Analiza oparta na lucyferazie do oceny związków przeciwwirusowych w ludzkich komórkach embrionalnych nerek

Streszczenie

Źródło: Lucas-Hourani, M. et.al., High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses. J. Vis. Exp. (2014)

Ten film przedstawia oparty na lucyferazie test przeciwwirusowy z wykorzystaniem ludzkich komórek embrionalnych nerki zainfekowanych rekombinowanym wirusem odry. Pokazuje on, że seryjnie rozcieńczone związki testowe hamują replikację wirusa, co prowadzi do obniżenia luminescencji w sposób zależny od dawki, przy jednoczesnym zachowaniu żywotności komórek gospodarza.

Protokół

1. Przygotowanie kultur komórkowych zainfekowanych wirusem odry (MV) wykazującym ekspresję lucyferazy świetlika (rMV2/Luc)

1. Hodować komórki HEK-293T w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ w podłożu DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) ze stabilizowaną L-glutaminą, uzupełnionym o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FCS), streptomycynę (100 μg/ml) i penicylinę (100 IU/ml). Komórki pasażować poprzez trypsynizację co 4-5 dni, rozcieńczając je 1:10 w nowym kolbie. Do eksperymentów komórki powinny być w fazie logarytmicznej.
2. W dniu eksperymentu zebrać komórki poprzez trypsynizację i przeprowadzić zliczanie komórek. Osadzić komórki przez wirowanie, a następnie resuspendować je w podłożu hodowlanym w stężeniu 3 x 10⁵ komórek/ml. Należy przyjąć, że na każdą płytkę przesiewową wymagane jest 12,5 ml zawiesiny komórkowej.
3. Ponownie resuspendować komórki w podłożu hodowlanym w stężeniu 3 x 10⁵ komórek/ml. Należy przyjąć, że na każdą płytkę przesiewową wymagane jest 12,5 ml zawiesiny komórkowej.
4. Opcjonalnie: uzupełnić podłoże hodowlane urydyną w stężeniu 20 μg/ml.
   UWAGA: Podczas przesiewania bibliotek chemicznych w poszukiwaniu inhibitorów replikacji wirusowej często izolowane są związki celujące we wczesne etapy szlaku biosyntezy pirymidyn. Dodanie urydyny do podłoża hodowlanego służy do odfiltrowania takich cząsteczek przeciwwirusowych. Rzeczywiście, pozwala to na efektywne przywrócenie replikacji wirusa w przypadku zablokowania enzymów działających powyżej w szlaku biosyntezy pirymidyn.
5. Odstawić 1/10 zawiesiny komórkowej do dołków kontrolnych z niezinfekowanymi komórkami, a pozostałą objętość wykorzystać do infekcji.
6. Rozmrozić odpowiednią objętość roztworu zapasowego rMV2/Luc. Roztwory zapasowe MV mają zazwyczaj stężenie 10⁶-10⁸ cząsteczek zakaźnych na ml. Kulturę należy zinfekować 0,1 cząsteczką zakaźną rMV2/Luc na komórkę docelową, co odpowiada wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 0,1. 
   UWAGA: rMV2/Luc pochodzi z szczepionki przeciw MV (szczep Schwarz) i jest przetwarzany w środowisku BSL2.
7. Dodać wirusa do zawiesiny komórkowej i delikatnie wymieszać. Przenieść zinfekowane komórki do korytka i rozdać 100 μl zawiesiny zinfekowanych komórek do kolumn od 2 do 11 płytek D2 zawierających dodane związki chemiczne. Zawiesinę komórkową w korytku należy regularnie i delikatnie mieszać.
8. W kolumnach 1 i 12 rozdać do każdego dołka 100 μl niezinfekowanych komórek. W pozostałych dołkach rozdać komórki zinfekowane.
9. Inkubować komórki przez 24 h w temperaturze 37 °C i 5% CO₂.

2. Przesiew sekundarny w kierunku toksyczności i przeciwwirusowej aktywności o szerokim spektrum

1. Przygotować szereg rozcieńczeń 1:2 dla każdego związku wyłonionego (hit compound) w dimetylosulfotlenku (DMSO), zaczynając od 500 µM do 4 µM (8 rozcieńczeń). Białe, kodowane paskami płytki do hodowli tkanek napełnić 50 µl pożywki hodowlanej. Dodać 1 µl każdego rozcieńczenia związku do studni z kulturą. Powtórz czynność dwukrotnie, aby uzyskać 3 płytki do hodowli z podwójnymi rozcieńczeniami seryjnymi dla każdego zidentyfikowanego związku.
2. Przygotować 37,5 ml zawiesiny komórek HEK-293T o stężeniu 6 x 10⁵ komórek/ml w pożywce hodowlanej zgodnie z powyższym opisem (w punktach 1.1 i 1.2). Rozdzielić 2 x 12,5 ml do probówek Falcon i zainfekować komórki albo wirusem rMV2/Luc przy MOI = 0,1, albo rekombinowanym wirusem chikungunya (CHIKV) wykazującym ekspresję lucyferazy Renilla (CHIKV/Ren) przy MOI = 0,2. Wymieszać poprzez odwracanie.
   UWAGA: CHIKV/Ren pochodzi od szczepu CHIKV typu dzikiego, w związku z czym należy go manipulować w środowisku BSL3. Płytki mogą zostać przeniesione z poziomu BSL3 do BSL1 po dodaniu substratu dla lucyferazy Renilla do studnik kultur (patrz poniżej).
3. Rozdzielić 50 µl niezakażonych, zakażonych rMV2/Luc lub zakażonych CHIKV/Ren komórek do płytek hodowlanych zawierających rozcieńczenia seryjne związków hitowych. Inkubować przez 24 h w 37 °C.
4. Dodać 50 µl podłoża dla lucyferazy świetlikowej w celu oznaczenia aktywności lucyferazy świetlikowej w studzienkach zainfekowanych rMV2/Luc. Dodać 50 µl podłoża dla lucyferazy Renilla w celu oznaczenia aktywności lucyferazy Renilla w studzienkach zakażonych CHIKV/Ren. Na koniec dodać 50 µl odczynnika do badania żywotności opartego na lucyferazie do niezakażonych komórek w celu określenia żywotności komórkowej.
5. Przedstaw dane na wykresie (Rysunek 1) i wyznacz stężenia związków aktywnych, które hamują replikację MV i CHIKV o 50%. Zignoruj związki wykazujące toksyczność w tym badaniu.

Wyniki

Rysunek 1. Zależność dawka-odpowiedź dla aktywności przeciwwirusowej i toksyczności związków C864, C648 i C062. (A) Komórki HEK-293T zainfekowano szczepem rMV2/Luc wirusa MV wykazującym ekspresję lucyferazy (MOI=0,1), a następnie inkubowano z rosnącymi dawkami związków C864, C648, C062 lub samym DMSO. Po 24 h określono ekspresję lucyferazy. * oznacza, że obserwowane inhibicje lucyferazy były statystycznie istotne dla wszystkich trzech związków (wartości p < 0,05). (B) Komórki HEK-293T zainfekowano szczepem CHIKV/Ren wirusa CHIKV wykazującym ekspresję lucyferazy Renilla (MOI=0,2), a następnie inkubowano z rosnącymi dawkami związków C864, C648, C062 lub samym DMSO. Po 24 h określono ekspresję lucyferazy Renilla. * oznacza statystycznie istotne inhibicje dla wszystkich trzech związków (wartości p < 0,05). (C) Komórki HEK-293T inkubowano z rosnącymi dawkami związków C864, C648, C062 lub samym DMSO. W celu kontroli toksyczności do kultur komórkowych dodano 2,5 μl 0,5% roztworu IGEPAL. Po 24 h liczbę żywych komórek określono za pomocą testu żywotności opartego na lucyferazie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Platforma Freedom EVO	TECAN		Platforma robotyczna
Białe polistyrenowe mikropłytki do hodowli komórek z 96 dołkami	Greiner Bio One	655083
Zestaw do luminescencyjnego pomiaru żywotności komórek CellTiter-Glo	Promega	G7570	Test żywotności oparty na lucyferazie
System do pomiaru aktywności lucyferazy Bright-Glo	Promega	E2610	Odczynnik zawierający substrat dla lucyferazy świetlikowej
System do pomiaru aktywności lucyferazy Renilla-Glo	Promega	E2710	Odczynnik zawierający substrat dla lucyferazy Renilla
System do pomiaru aktywności genów reporterowych Britelite plus	Perkin-Elmer	6016761	Odczynnik zawierający substrat dla lucyferazy świetlikowej. Może być stosowany jako alternatywa dla odczynnika Bright-Glo do oznaczania aktywności lucyferazy.