Izolacja pojedynczego wirusa olbrzymiego z mieszanej populacji wirusowej z wykorzystaniem ameb

Streszczenie

Źródło: Sahmi-Bounsiar, D. et al. Mikroaspiracja pojedynczych komórek jako alternatywna strategia dla sortowania komórek metodą fluorescencyjną w celu rozdzielenia mieszaniny wirusów olbrzymich. J. Vis. Exp. (2019)

Film ten demonstruje mikroaspirację pojedynczych komórek w celu izolacji i namnożenia pojedynczej populacji wirusa olbrzymiego z mieszanej populacji wirusowej przy użyciu ameb jako komórek gospodarza.

Protokół

1. Hodowla ameb

1. Użycie Vermamoeba vermiformis (szczep CDC19) jako wsparcie komórkowe.
2. Dodaj 30 ml pożywki proteaza-pepton-ekstrakt drożdżowy-glukoza (PYG) (Tabela 1) oraz 3 ml ameb o stężeniu 1 x 10⁶ komórek/ml w naczyniu 75 cm² kolba do hodowli komórek.
3. Hodować kulturę w temperaturze 28 °C.
4. Po 48 h należy określić liczbę ameb, korzystając z komór licznych.
5. Aby wypłukać, należy zebrać komórki w stężeniu 1 x 10⁶ komórek/ml i osadź ameby poprzez wirowanie przy 720 x g przez 10 min. Odlej nadsącz i resuspenduj osad w odpowiedniej objętości pożywki głodzeniowej, aby uzyskać 1 x 10⁶ komórek/ml (Tabela 1).

2. Rozcieńczenie końcowe

1. Przeprowadzić rozcieńczenia seryjne (od 10^-1 do 10^-11) próbki wirusa w pożywce głodzeniowej (Tabela 1).
2. Zaszczepić 2 mL 1 x 10⁶ Vermamoeba vermiformis w każdej płytce Petri za pomocą 100 µL inokulum mieszaniny.
3. Umieścić płytki Petri w szczelnej plastikowej torbie w temperaturze 30 °C.
4. Rozpocząć obserwację płytek Petri przy użyciu odwróconego mikroskopu optycznego 6 h po infekcji i kontrolować morfologię komórek co 4 do 8 h.
5. W momencie pojawienia się efektu cytopatycznego objawiającego się zaokrągleniem komórek, rozpocząć proces mikroaspiracji pojedynczych komórek.

3. Mikroaspiracja pojedynczych komórek

1. Przygotowanie gospodarza
   UWAGA: Przygotowanie to służy do przeniesienia zakażonych pojedynczych komórek na świeże podłoże komórkowe.
   1. Potraktuj ameby w hodowli środkiem przeciwmikrobowym zawierającym 10 µg/mL wankomycyny, 10 µg/mL imipenemu, 20 µg/mL cyprofloksacyny, 20 µg/mL doksycykliny i 20 µg/mL worykonazolu. Mieszanina ta jest stosowana w celu uniknięcia zanieczyszczenia bakteryjnego i grzybiczego.
      UWAGA: Procedura odbywa się na blacie poza stanowiskiem bezpieczeństwa mikrobiologicznego. Do 15 szalek Petriego dodaj po 2 mL ameb o stężeniu 1 x 10⁶ komórek/mL. W celu adhezji ameb inkubuj hodowlę w temperaturze 30 °C przez 30 min.
2. Wybierz szalkę Petriego do mikroaspiracji z rozcieńczeń granicznych zgodnie z następującymi kryteriami: 1) brak widocznego zanieczyszczenia czynnikami grzybiczymi i bakteryjnymi, 2) dowody efektu cytopatycznego ameb wywołanego przez wirusy oraz 3) faza prelizy i zaokrąglenia ameb (aby uniknąć aspiracji samych cząstek wirusowych).
3. Przygotuj stanowisko pracy z następującymi materiałami (Rysunek 1A,B): mikromanipulator, który umożliwia pozycjonowanie mikrokapilary; ręczne urządzenie do kontroli ciśnienia, używane do aspiracji i uwalniania komórek do mikrokapilary; mikroskop odwrócony; moduły silników typu plug and play; kamera; moduł komputerowy do wizualizacji manipulacji i robienia zdjęć.
4. Wybierz mikrokapilarę (Rysunek 1C).
   UWAGA: Rozmiar komórek, deformacja i przyleganie ich błon do powierzchni oraz ruchliwość komórkowa mogą wpływać na sprawny przebieg mikroaspiracji. Średnicę mikrokapilary można precyzyjnie dobrać i dostosować do konkretnych typów komórek w zależności od ich rozmiarów i metod aspiracji. Do aspiracji zaokrąglonej ameby (średnica ~10 µm) użyto mikrokapilary o średnicy wewnętrznej 20 µm. Pozwala to na utrzymanie komórki w pozycji wewnętrznej i jej łatwe uwolnienie.
5. Montaż systemu.
   1. Ustaw kąt roboczy systemu chwytającego na module zmotoryzowanym pod kątem 45°.
   2. Przeprowadź podwójną instalację, najpierw w systemie chwytającym, a następnie w mikrokapilarze.
   3. Ustaw ostrość na komórkach po przepuszczeniu kilku kropli oleju przez mikrokapilarę.
      UWAGA: Olej mineralny z kompatybilnością biologiczną jest dostarczany przez urządzenie.
   4. Zakończ montaż zgodnie z zaleceniami producenta.
6. Klonowanie komórek (Rysunek 2A,B)
   1. Umieść szalkę Petriego zawierającą 2 mL zakażonych ameb pod mikroskopem.
   2. Ustaw najpierw ostrość na komórkach, a następnie na mikrokapilarze zanurzonej w hodowli.
   3. Wybierz pojedynczą, zaokrągloną komórkę i zbliż mikrokapilarę za pomocą mikromanipulatora.
   4. Zastosuj delikatną aspirację za pomocą ręcznej kontroli ciśnienia, aby zaciągnąć komórkę do wnętrza mikrokapilary. Usuń pojedynczą komórkę z pierwszej próbki i uwolnij ją na podłożu komórkowym, a następnie inkubuj w temperaturze 30 °C.
   5. Przeprowadzaj codzienne obserwacje za pomocą odwróconego mikroskopu optycznego, aby monitorować wygląd komórek i pojawienie się efektu cytopatycznego.

Tabela 1: Skład pożywek hodowlanych

Wyniki

Rycina 1: Materiały do mikromanipulacji. (A) Rzeczywista konfiguracja stanowiska roboczego. (B) Schematyczny rysunek komponentów stanowiska roboczego. (C) Schematyczny rysunek mikrokapilary.

Rycina 2: Etapy mikroaspiracji. (A) Procedura izolacji pojedynczej komórki (powiększenie x40). (B) Schematyczne przedstawienie poszczególnych etapów aspiracji pojedynczej komórki: 1) Lokalizacja komórki. 2) Aspiracja komórki. 3) Etap uwalniania. Czarne strzałki wskazują mikrokapilarę, a białe pojedynczą komórkę.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Corning cell culture flasks 150 cm²	Sigma-aldrich	CLS430825	Hodowla
Corning cell culture flasks 25 cm²	Sigma-aldrich	CLS430639	Hodowla
Corning cell culture flasks 75 cm²	Sigma-aldrich	CLS430641	Hodowla
DFC 425C camera	LEICA	Unkown	Obserwacja/monitorowanie
Eclipse TE2000-S Inverted Microscope	Nikon	Unkown	Obserwacja/monitorowanie
Microcapillary 20 µm	Eppendorf	5175 107.004	Mikroaspiracja i uwalnianie komórek
Micromanipulator InjectMan NI2	Eppendorf	631-0210	Pozycjonowanie mikrokapilary
Petri dish 35 mm	Ibidi	81158	Hodowla/obserwacja