Sortowanie pojedynczych cząstek wirusowych metodą fluorescencyjną do analizy genomowej

Streszczenie

Źródło: Zeigler Allen, L., et al. Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'. J. Vis. Exp. (2013).

Niniejszy film demonstruje, w jaki sposób cytometria przepływowa umożliwia izolację pojedynczych wirusów zawierających genom z populacji mieszanych dzięki detekcji opartej na fluorescencji i precyzyjnemu sortowaniu cząstek, a następnie ich zatopienie w agarozie w celu późniejszej charakterystyki genomowej.

Protokół

1. Przygotowanie zawiesin wirusowych

Przed izolacją pojedynczych wirionów za pomocą cytometrii przepływowej należy przygotować niefiksowane zawiesiny wirusowe.

1. Wyizoluj cząsteczki wirusowe zgodnie z wcześniej ustalonymi protokołami, upewniając się, że końcowa zawiesina wirusowa znajduje się w buforze TE (Tris-EDTA, pH 8) przefiltrowanym przez filtr 0,1 μm. Zalecamy stosowanie metod filtracji stycznej (TFF), choć opracowano również inne metody wykorzystujące flokulację chemiczną.
2. Oznacz liczbę cząsteczek wirusowych zgodnie z ustalonymi protokołami, np. przy użyciu mikroskopii epifluorescencyjnej 8-10 lub cytometrii przepływowej.
3. Rozdziel zawiesinę wirusową do dwóch probówek Eppendorf (zalecana końcowa objętość to 1,000 μl).

2. Cytometria przepływowa

1. Aby przeprowadzić sortowanie wirusów przy użyciu cytometru przepływowego BD FACSAria II wyposażonego w niestandardowy PMT do rozproszenia przedniego (FSC PMT), należy rozcieńczyć cząstki wirusowe w buforze TE filtrowanym przez membranę 0.1 μm (pH 8.0) do miana odpowiedniego dla częstotliwości zliczania 200 events sec^-1.
2. Należy ustawić progi (thresholds) tak, aby zmaksymalizować stosunek sygnału do szumu; np. dla mieszaniny zawierającej cząstki faga T4 i faga lambda zaleca się następujące ustawienia: FSC PMT na 1 000 oraz SSC na 200.
3. Należy przeanalizować 100 μl próbek „blank” zawierających odpowiednio: 1) sam bufor TE filtrowany przez membranę 0.1 μm oraz 2) bufor TE filtrowany przez membranę 0.1 μm i SybrGreen1 w rozcieńczeniu 1e-4 z roztworu stokowego (10 000X).
4. Należy przeanalizować niewielką alikwotę (zalecane 100 μl) niebarwionej zawiesiny wirusowej w celu oceny tła, a następnie zabarwionej zawiesiny wirusowej (SybrGreen1 w rozcieńczeniu 1e-4 z roztworu stokowego), zliczając łącznie po 5 000 zdarzeń (events) dla każdej z nich. Pozwala to na sprawdzenie stężenia i, jeśli to konieczne, dostosowanie bramek sortowania (gates) przed właściwym sortowaniem. Zaleca się zastosowanie wąskiej bramki w centrum populacji cząstek wirusowych. Do wyznaczania bramek wykorzystujemy wykres SYBR Green i FSC PMT.
5. Do każdego dołka na szkiełku mikroskopowym z politetrafluoroetylenu (PTFE) (Electron Microscopy Sciences) należy dodać 5 μl 1% agarozy o niskiej temperaturze topnienia (LMP) (w buforze TBE) schłodzonej do 37 °C.
6. Szkiełko PTFE należy umieścić w cytometrze przepływowym, aby przechwycić posortowane cząstki wirusowe.
7. Należy rozpocząć sortowanie cząstek wirusowych zabarwionych SybrGreen bezpośrednio na szkiełko PTFE z agarozą LMP. Zaleca się sortowanie 10 lub więcej zdarzeń (cząstek wirusowych) w niektórych dołkach, aby ułatwić określenie głębokości położenia wirusów podczas konfokalnej skaningowej mikroskopii laserowej (CSLM).
8. Po zakończeniu sortowania należy wyjąć szkiełko z cytometru przepływowego i dodać do każdego dołka kolejne 5 μl agarozy LMP schłodzonej do 37 °C, aby zatopić cząstkę (lub cząstki) wirusowe.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bufor TE 1X	Invitrogen	12090-015
Fenol nasycony buforem	Invitrogen	15513-039
Agaroza LMP	Invitrogen	16520100
Przedmiotowy szkiełko PTFE	Electron Microscopy Sciences	63430-04	24 dołki, średnica 4 mm
β-agaraza	New England Biolabs	M0392S