Wzbogacanie próbek wody środowiskowej w kierunku wirusów olbrzymich z wykorzystaniem ameb

Streszczenie

Źródło: Bou Khalil, J. Y.,et al. A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis. J. Vis. Exp. (2016)

W niniejszym filmie zaprezentowano wzbogacanie próbek wirusów olbrzymich z wodnych próbek środowiskowych przy użyciu kokultury z amebami, co umożliwia ich późniejszą detekcję i analizę.

Protokół

1. Pobieranie próbek

1. Pobierz 70 próbek z różnych środowisk i regionów. W tym przypadku należy wykorzystać: 5 próbek brudnej wody z wioski Saint Pierre de Meyzoargues (Francja), 15 próbek z jeziora w Parc Borély w Marsylii (Francja), 15 próbek wody morskiej z osadem z skalistych zatoczek w Samena w Marsylii (Francja), 25 próbek wody rzecznej z Alp (Francja) oraz 10 próbek ścieków z La Ciotat (Francja).
2. Próbki poddaj homogenizacji w wirówce typu vortex przed inokulacją przez jedną minutę w temperaturze pokojowej, bez dodatkowej obróbki.

2. Procedura izolacji

1. Przygotowanie gospodarza do procedur ślepej hodowli i inokulacja próbek
   1. W celu stworzenia kokultury jako wsparcie komórkowe wykorzystać Vermamoeba vermiformis (szczep CDC19).
   2. Hodować ameby w temperaturze 28 °C w kolbie do hodowli komórkowej o powierzchni 75 cm² zawierającej 30 ml pożywki proteaza-pepton-ekstrakt drożdżowy-glukoza (PYG). Skład pożywki PYG znajduje się w Tabeli 1.
      UWAGA: Po 48 h liczbę ameb należy określić poprzez standardne liczenie z użyciem szkiełek do liczenia (np. Kovaslides).
   3. Zebrać komórki przy stężeniu od 5 x 10⁵ do 10⁶ komórek/ml, a następnie odwirować ameby w celu otrzymania osadu przy 720 x g przez 10 min.
   4. Usunąć nadsącz poprzez aspirację i zawiesić osad z ameb w 30 ml sterylnego roztworu soli amebowej Page'a (PAS) (Tabela 1). Powtórzyć procedurę płukania.
   5. Ponownie zawiesić ameby w 30 ml pożywki głodzeniowej z mieszaniną antybiotyków i leków przeciwgrzybiczych przy stężeniu około 10⁶ ameb/ml. Pożywka głodzeniowa jest pożywką przeżycia dla ameby, umożliwiającą jej przetrwanie bez tworzenia cyst lub mnożenia się. Skład znajduje się w Tabeli 1.
      UWAGA: Mieszanina środków przeciwdrobnoustrojowych zawierała 10 µg/ml wankomycyny, 10 µg/ml imipenemu, 20 µg/ml cyprofloksacyny, 20 µg/ml doksycykliny oraz 20 µg/ml worykonazolu. Mieszanina ta służyła do ograniczenia kontaminacji bakteryjnej i grzybiczej, która może hamować lub zmieniać namnażanie wirusów.
   6. Inokulować bezpośrednio 25 µl każdej próbki na 200 µl monowarstwy ameb w 96-dołkowej płytce z płaskim dnem, co sprzyja adhezji ameb, i inkubować w temperaturze 30 °C w środowisku wilgotnym (środowisko wilgotne uzyskuje się poprzez umieszczenie mokrego kompresu wewnątrz worka zawierającego płytkę, aby zapobiec odparowywaniu). Jest to primo-kultura. Pozostawić dwa dołki z amebami bez inokulacji próbką; służą one jako kontrola negatywna. Inkubować primo-kulturę przez trzy dni.
   7. Trzy dni po pierwszej inokulacji wykonać subkulturę z płytki primo-kultury na świeże ameby zgodnie z powyższym opisem, bez obserwacji mikroskopowej. Inkubować nową płytkę przez trzy dni w tych samych warunkach co w przypadku primo-kultury.
   8. Po tych trzech dniach inkubacji wykonać kulturę końcową w ten sam sposób, co w przypadku primo- i subkultury. Inkubować kulturę końcową przez dwa dni, a następnie przystąpić do detekcji.

Tabela 1. Składy roztworów

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pożywka proteaza-pepton-ekstrakt drożdżowy-glukoza (PYG), sól amoebalna Page'a (PAS), pożywka głodzeniowa	Produkcja laboratoryjna wewnętrzna	Marseille URMITE	x
Szczep ameby CDC-19	ATCC	Francja	50237
Płytki	Cellstar	Francja	655180
Kolby	SARSTEDT	Niemcy	833911
Ultrawirówka Sorval WX 80	Thermo scientific	Francja	9102448