Ilościowe oznaczenie zakaźnego wirusa zapalenia wątroby C za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Streszczenie

Źródło: Ren, S., et al. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (2014)

Niniejszy film prezentuje test ognisk fluorescencyjnych stosowany do ilościowego oznaczania zakaźnego wirusa zapalenia wątroby typu C w hodowli komórkowej. Przedstawiono w nim seryjne rozcieńczanie supernatantu wirusowego, zakażanie komórek hepatomy oraz detekcję miejsc replikacji wirusa za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii z wykorzystaniem przeciwciał.

Protokół

1. Pomiar miana wirusa

1. Wysiać naiwne komórki Huh-7.5.1 w zagęszczeniu około 3 x 10³ komórek/dołek, korzystając z płytki 96-dołkowej. Następnego dnia wykonać 10-krotne rozcieńczenia seryjne wolnego od komórek supernatantu hodowli pobranego z komórek transfektowanych RNA wirusa zapalenia wątroby C (HCV), używając pożywki wzrostowej, a następnie zaszczepić w trzech powtórzeniach na komórki Huh-7.5.1.
2. Utrwalić komórki 72 h po infekcji za pomocą metanolu (przez 30 min w -20 ºC) i przeprowadzić immunobarwienie na białko NS5A HCV.
3. Przemyć komórki trzy razy PBS i zablokować za pomocą buforu blokującego IFA.
4. Zastosować królika poliklonalne przeciwciało pierwotne anty-NS5A lub mysie monoklonalne przeciwciało anty-dsRNA J2 w rozcieńczeniu 1:200 (1 μg/ml) i inkubować od 5 h do całej nocy w 4 ºC.
5. Po inkubacji z przeciwciałem pierwotnym przemyć komórki trzy razy PBS.
6. Dodać kozie poliklonalne przeciwciało wtórne anty-rabbit IgG-488 lub kozie poliklonalne przeciwciało wtórne anty-mouse IgG-594 w rozcieńczeniu 1:1,000 (1 μg/ml) i inkubować przez 1 h w temperaturze pokojowej.
7. Przemyć komórki trzy razy PBS i obejrzeć pod mikroskopem fluorescencyjnym.
8. Wykorzystać najwyższe rozcieńczenie do policzenia ognisk pozytywnych pod kątem NS5A i obliczyć średnią liczbę jednostek tworzących ogniska (FFU) na mililitr. Miano HCV przedstawiono na Ryc. 1.

Wyniki

Rysunek 1. Badanie zakaźności HCV typu dzikiego i pomiar miana wirusa. A) Do badań nad zakaźnością wykorzystano naiwne komórki Huh-7.5.1. Bezkomórkowy supernatant zebrany 48 i 96 godzin po transfekcji (hpt) RNA HCV poddano 10-krotnym rozcieńczeniom seryjnym i dodano do komórek na płytce 96-dołkowej w trzech powtórzeniach. 72 godziny po zakażeniu komórki utrwalono i poddano barwieniu immunologicznemu na białko HCV NS5A. Komórki z dodatnim barwieniem na NS5A (czerwony) są zakażone wirusem. W celu oceny jednostek tworzących ogniska (FFU) policzono dodatnie ogniska przy najwyższym rozcieńczeniu. Przedstawiono reprezentatywne panele obrazów (pasman skala 100 μm). B) Na wykresie przedstawiono średnie wartości i odchylenia standardowe miana wirusa w FFU na mililitr. Mutant z brakiem polimerazy nie wytwarzał cząsteczek zakaźnych. WT: typ dziki; Pol-: brak polimerazy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Fisher Scientific	10-017-CV
Huh-7.5.1	The Scripps Research Institute		Linia komórkowa została uprzejmie udostępniona przez dr. Francisa Chisari dla dr. Arumugaswami na podstawie podpisanej umowy MTA pomiędzy The Scripps Research Institute a Cedars-Sinai Medical Center
Mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko dsRNA J2	English & Scientific Consulting Kft.	10010200
Kozie przeciwciało przeciwko królika IgG Alexa Fluor 488	Life Technologies	A11008
Kozie przeciwciało przeciwko królika IgG Alexa Fluor 594	Life Technologies	A11020