Identyfikacja wpływu mutacji BRCA1 na rekombinację homologiczną z wykorzystaniem komórek wykazujących endogenną ekspresję BRCA1 typu dzikiego

Podsumowanie

Przedstawiamy metodę testowania wariantów BRCA1 w teście opartym na hodowli tkankowej dla homologicznej naprawy pęknięć DNA, polegającą na usunięciu endogennego białka BRCA1 z komórki za pomocą RNAi i zastąpieniu go mutantem punktowym BRCA1 zawierającym zmianę kodującą.

Streszczenie

Analiza funkcjonalna mutacji typu missense może być utrudniona przez obecność białka endogennego w komórce. Analizy strukturalno-funkcjonalne BRCA1 były komplikowane przez brak wiarygodnego testu dla pełnowymiarowego białka BRCA1 oraz trudności związane z pracą z liniami komórkowymi wykazującymi ekspresję hypomorficznego białka BRCA1^1,2,3,4,5. Opracowaliśmy system, w którym endogenne białko BRCA1 w komórce było gwałtownie usuwane za pomocą RNAi celującego w 3'-UTR mRNA BRCA1 i zastępowane poprzez kotransfekcję plazmidu wykazującego ekspresję wariantu BRCA1. Jedną z zalet tej procedury jest to, że gwałtowne wyciszenie BRCA1 i jednoczesne zastąpienie pozwalają komórkom rosnąć bez wtórnych mutacji lub adaptacji, które mogłyby pojawić się z czasem w celu skompensowania utraty funkcji BRCA1. Ta procedura usuwania i przywracania (depletion and add-back) została przeprowadzona w linii komórkowej pochodzącej z komórek HeLa, która była łatwo testowana pod kątem aktywności rekombinacji homologicznej. Test rekombinacji homologicznej opiera się na wcześniej opublikowanej metodzie, w której substrat rekombinacyjny jest zintegrowany z genomem (Rysunek 1)^6,7,8,9. Ten substrat rekombinacyjny posiada miejsce rozpoznawane przez rzadko tnący enzym restrykcyjny I-SceI wewnątrz nieaktywnego allelu GFP, a poniżej znajduje się drugi nieaktywny allel GFP. Transfekcja plazmidu wykazującego ekspresję I-SceI prowadzi do pęknięcia obu nici DNA, które może zostać naprawione poprzez rekombinację homologiczną; jeżeli rekombinacja homologiczna naprawi to pęknięcie, powstaje aktywny allel GFP, który jest łatwo oceniany za pomocą cytometrii przepływowej pod kątem ekspresji białka GFP. Usunięcie endogennego BRCA1 spowodowało 8-10-krotny spadek aktywności rekombinacji homologicznej, a przywrócenie plazmidu typu dzikiego w pełni odtworzyło funkcję rekombinacji homologicznej. Gdy specyficzne mutanty punktowe pełnowymiarowego BRCA1 były wyrażane z kotransfekowanych plazmidów, można było ocenić efekt konkretnego mutantu missense. Przykładowo, ekspresja białka BRCA1(M18T), wariantu o nieznanym znaczeniu klinicznym¹⁰, w tych komórkach nie przywróciła zależnej od BRCA1 rekombombinacji homologicznej. W przeciwieństwie do tego, ekspresja innego wariantu, również o nieznanym znaczeniu, BRCA1(I21V), w pełni przywróciła funkcję zależnej od BRCA1 rekombinacji homologicznej. Tę strategię testowania funkcji mutacji missense BRCA1 zastosowano w innym systemie biologicznym badającym funkcję centrosomów (Kais i wsp., niepublikowane obserwacje). Ogólnie rzecz biorąc, podejście to jest odpowiednie do analizy mutantów missense w każdym genie, który musi być analizowany recesywnie.

Protokół

1. Linia komórkowa z zintegrowanym substratem rekombinacyjnym

1. Komórki HeLa zostały stabilnie przetransformowane pDR-GFP (plazmid⁷ otrzymany od M. Jasina z Memorial Sloan-Kettering Cancer Center) i utrzymywane w obecności puromycyny w celu selekcji transformantów.
2. Komórki pasażowano w podłożu DMEM/FBS zawierającym 10% płodowej surowicy bydlęcej, 2 mM GlutaMAX, 1 mM pirogronianu sodu, penicylinę/streptomycynę (100 U/ mL/0,1 mg/ mL) oraz 1,5 ug/ mL puromycyny.

Podłoże rekombinacji w plazmidzie pDR-GFP oraz w stabilnych transformantach zawiera dwa nieaktywne allele GFP (Rycina 1). Jeden allel jest nieaktywny z powodu obecności 18 pb miejsca rozpoznawania enzymu restrykcyjnego I-SceI w jego sekwencji kodującej. Ekspresja I-SceI w tych komórkach powoduje pęknięcie obu nici DNA (DSB). Na tym DNA znajduje się drugi nieaktywny allel GFP, jednak fragment jego sekwencji odpowiadający miejscu I-SceI w pierwszym allelu ma charakter typu dzikiego. Ten drugi allel GFP może służyć jako dawca sekwencji do naprawy DSB poprzez rekombinację homologiczną, co prowadzi do powstania aktywnego allelu GFP, który jest łatwo wykrywalny za pomocą cytometrii przepływowej. Alternatywnie DSB może zostać naprawione przez niehomologiczne łączenie końców (NHEJ), co zniszczyłoby miejsce restrykcyjne I-SceI i doprowadziło do powstania komórek GFP-ujemnych. Poziom rekombinacji homologicznej w komórce określa się poprzez obliczenie procentowej liczby komórek GFP-dodatnich.

Linia komórkowa ta, pHeLa-DR13-9, została wybrana spośród wszystkich klonów ze względu na brak sygnału tła GFP oraz stosunkowo wysoki odsetek komórek GFP-dodatnich po transfekcji plazmidem pCBASce wykazującym ekspresję I-SceI. (Plazmid pCBASce oraz jego kontrola wektorowa, pCAGGS, zostały dostarczone przez M. Jasina z Memorial Sloan-Kettering Cancer Center).
Linia komórkowa HeLa-DR13-9 jest dostępna od autorów na zapytanie.

2. Transfekcja w celu usunięcia endogennego BRCA1 i wprowadzenia zmutowanego BRCA1.

1. Dzień przed pierwszą transfekcją (zazwyczaj we wtorek): rozpocząć z komórkami HeLa-DR13-9 w naczyniu o średnicy 10 cm, przy konfluencji co najmniej 90%.
2. Poddać komórki trypsynizacji w 1 mL i zatrzymać reakcję poprzez dodanie 9 mL DMEM/FBS, mieszając dokładnie za pomocą pipety.
3. Do każdego dołka płytki 24-dołkowej dodać 40 μL trypsynizowanych komórek w 0,5 mL DME/FBS.
4. Dzień 1. transfekcji (środa): konfluencja komórek powinna wynosić ok. 40-50%; jeśli jest znacznie niższa, należy rozpocząć procedurę od nowa. Transfekcję przeprowadzić, mieszając: 5 pmol siRNA + 0,3 ug plazmidowego DNA wykazującego ekspresję zmutowanego BRCA1 w 12,5 μL Opti-MEM oraz 0,5 μL Lipofectamine 2000 w 12,5 μL Opti-MEM. Postępować zgodnie z protokołem Lipofectamine (Invitrogen).
5. Wymienić pożywkę po 4-6 godzinach. Stosowany do deplecji BRCA1 siRNA oparty jest na sekwencji GCUCCUCUCACUCUUCAGU, która specyficznie wiąże się z sekwencjami 3'-UTR BRCA1 od 80 780 do 80 798 (numer dostępu AY273801).
6. Dzień 2.: przenieść komórki z płytki 24-dołkowej do płytki 6-dołkowej po uprzedniej trypsynizacji.
7. Dzień 3. transfekcji: 25 pmol siRNA + 0,75 ug plazmidowego DNA wykazującego ekspresję zmutowanego BRCA1 + 0,75 ug pCBASce (lub wektor kontrolny pCAGGS) w 62,5 μL Opti-MEM oraz 2,5 μL Lipofectamine 2000 w 62,5 μL Opti-MEM. Wymienić pożywkę po 4-6 godzinach.

3. Analiza transfektantów.

1. W 6. dniu poddaj komórki z każdej studzienki trypsynizacji i zatrzymaj proces w 1 mL DMEM/FBS. Analizę ekspresji GFP w komórkach można przeprowadzić w 5. lub 7. dniu, jednak stwierdzono, że 6. dzień jest najodpowiedniejszy.
2. Przeanalizuj 10 000 komórek na studnienkę za pomocą cytometrii przepływowej. Wykorzystano urządzenie Becton Dickinson FACSCalibur w jednostce zasobów współdzielonych Analytical Cytometry w Ohio State University Comprehensive Cancer Center. Pojedyncze, żywe komórki wyselekcjonowano (gating) przy użyciu parametrów rozproszenia światła przedniego (forward scatter) i bocznego (side scatter). Komórki GFP-dodatnie wykryto za pomocą detektora fluorescencji GFP (FL1), a wyniki przedstawiono w formie histogramu (Rysunek 2, dół).
3. Pozostałe komórki można ponownie wysiać do wykonania zdjęć za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, jeśli jest to wymagane.

4. Reprezentatywne wyniki:

BRCA1 reguluje szlak naprawy pęknięć dwuniciowych DNA poprzez rekombinację homologiczną^6,11. Komórki, które przeszły naprawę metodą rekombinacji homologicznej, są łatwo wykrywalne za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (Rysunek 2, góra). Wyczerpanie BRCA1 skutkuje spadkiem liczby wykrytych komórek dodatnich dla GFP (Rysunek 2, prawo). Wynikiem z analizatora FACSCalibur jest histogram z intensywnością GFP na komórkę na osi X oraz liczbą komórek na osi Y (Rysunek 2, dół). W typowym zestawie wyników z jednego eksperymentu, 15,5% komórek było dodatnich dla GFP po ekspresji I-SceI i kontrolnym wyciszeniu RNAi (Rysunek 3). Dla porównania, wyczerpanie BRCA1 i wprowadzenie pustego wektora zredukowało konwersję GFP do 0,7%. Ponowne wprowadzenie BRCA1 typu dzikiego lub BRCA1(I21V) w pełni przywróciło rekombinację homologiczną, co potwierdzono uzyskaniem 15–16% komórek dodatnich dla GFP. Ponowne wprowadzenie mutanta BRCA1(M18T) (Rysunek 3, ścieżka 5) miało efekt podobny do wprowadzenia wektora kontrolnego. Ponieważ wariant ten był eksprimowany na poziomach zbliżonych do białka endogennego⁹, interpretujemy to tak, że wariant BRCA1(M18T) jest niefunkcjonalny w procesie rekombinacji homologicznej.

Zazwyczaj po transfekcji plazmidu ekspresyjnego I-SceI konwersja komórek do postaci GFP-dodatnich wynosi 10-20%. Deplecja BRCA1 w sposób powtarzalny zmniejsza konwersję komórek GFP-dodatnich około 8-10 krotnie. Chociaż rzeczywiste wartości procentowe komórek GFP-dodatnich mogą różnić się między poszczególnymi eksperymentami, stosunek liczby komórek GFP-dodatnich po deplecji BRCA1 względem kontrolnej deplecji w obrębie jednego eksperymentu jest bardzo spójny. Wyniki normalizujemy, przyjmując niehamowaną stopę konwersji za 100%, a wyniki dla deplecji i przywrócenia ekspresji BRCA1 wyrażamy w procentach. W ten sposób możemy łączyć dane z wielu eksperymentów, a zmienność eksperymentalna nie jest wysoka.

Dodanie mutantów BRCA1 przyniosło dotychczas jednoznaczne wyniki: każdy wariant BRCA1 albo w pełni przywracał aktywność rekombinacji homologicznej, albo nie wywoływał żadnego efektu. Ważnym czynnikiem w uzyskaniu tych wyników jest fakt, że nasze warunki transfekcji pozwalają na uzyskanie poziomu białka BRCA1, który jest w przybliżeniu równy stężeniu białka endogennego w komórkach nieleczonych. Zbyt silna nadekspresja, nawet w przypadku wadliwego mutanta BRCA1, może prowadzić do uzyskania pewnej dodatniej aktywności rekombinacji homologicznej.

Problemem, który musieliśmy rozwiązać, była toksyczność transfekcji. Same usunięcie BRCA1 może spowalniać wzrost komórek, dlatego stosunek Lipofectamine-2000 i plazmidowego DNA do liczby komórek na płytce musi być utrzymywany na stałym poziomie. Zbyt duża ilość Lipofectamine lub plazmidowego DNA zredukuje liczbę komórek, co sprawi, że będzie ona niewystarczająca do uzyskania wiarygodnych wyników cytometrii przepływowej. Równowaga między odczynnikami plazmidowymi a Lipofectamine a liczbą transfekowanych komórek jest bardzo istotna dla utrzymania żywotności komórek.

Rysunek 1. Substrat rekombinacyjny. Przedstawiono strategię opracowaną przez grupę M. Jasina^7,12. Plazmid pDR-GFP zawiera dwa defektywne allele GFP, z których jeden posiada miejsce rozpoznawane przez endonukleazę restrykcyjną I-SceI. Linia komórkowa pochodząca z komórek HeLa zawiera ten substrat DNA zintegrowany w pojedynczym miejscu w genomie⁹, a aktywna naprawa pęknięcia dwuniciowego DNA w miejscu I-SceI poprzez rekombinację homologiczną prowadzi do przekształcenia jednego allela w GFP-dodatni.

Rysunek 2. Wykrywanie komórek GFP-dodatnich za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Komórki badano zgodnie z niniejszym protokołem; komórki kontrolne z wyczerpanym białkiem wykazywały aktywność w rekombinacji homologicznej, co potwierdził wysoki odsetek komórek z ekspresją GFP (po lewej). Wyczerpanie białka BRCA1 za pomocą RNAi prowadzi do gwałtownego spadku liczby komórek GFP-dodatnich (po prawej).

Rysunek 3. Wyniki eksperymentu add-back mutantów missense BRCA1. Na tym histogramie przedstawiono wyniki z pojedynczego eksperymentu. W przypadku braku transfekcji plazmidu wyrażającego I-SceI (ścieżka 1) nie wykryto komórek GFP-dodatnich. Wyniki na ścieżkach 2-6 uzyskano z komórek, w których plazmid wyrażający I-SceI został przetransfekowany w 3. dniu. W komórkach, w których wyciszono nieistotny gen (lucyferazę) i zastosowano add-back wektora, 15,5% komórek było GFP-dodatnich (ścieżka 2). Wyciszenie BRCA1 i add-back wektora ujawnia wpływ utraty BRCA1 na rekombinację homologiczną (ścieżka 3). Przedstawiono efekty wyciszenia BRCA1 i add-back typu dzikiego BRCA1 (ścieżka 4), BRCA1(M18T) (ścieżka 5) oraz BRCA1(I21V) (ścieżka 6). Wyniki te pochodzą z pojedynczego eksperymentu i zostałyby połączone z co najmniej dwoma kolejnymi powtórzeniami w celu uzyskania miary rekombinacji homologicznej wspieranej przez dany białkowy mutant BRCA1.

Dyskusja

Zaletą tej metody jest możliwość badania funkcji białka BRCA1 w regulacji naprawy DNA poprzez rekombinację homologiczną z wykorzystaniem komórek wykazujących endogenną ekspresję BRCA1 typu dzikiego. W celu opracowania nowej metody testowania funkcji wariantów BRCA1 w naprawie DNA, zaadaptowaliśmy dwie oddzielne, uznane metody badania procesu rekombinacji homologicznej oraz wykorzystania deplecji za pośrednictwem RNAi. Kluczem do sukcesu tej metody było stworzenie łatwo transfektowalnej linii komórkowej, takiej jak HeLa, z substratem rekombinacyjnym w genomie, co pozwoliło na uzyskanie bardzo wysokiego poziomu konwersji GFP. Przeskanowaliśmy wiele klonów z pierwotnej transformacji, aby uzyskać taki, który nie wykazywał wykrywalnego sygnału tła GFP, lecz po transfekcji plazmidem ekspresyjnym I-SceI wykazywał bardzo wysoki poziom konwersji GFP.

Za pomocą tej metody badamy obecnie inne specyficzne reszty aminokwasowe BRCA1 pod kątem ich funkcji w rekombinacji homologicznej. Wraz z biologicznymi spostrzeżeniami wynikającymi z niniejszej pracy, wnioski te mogą zostać zastosowane w klinicznej genetyce nowotworów. Wysoki odsetek mutacji typu missense w genie BRCA1 ma nieznane znaczenie kliniczne, ponieważ istnieje wiele rzadkich wariantów i brakuje wystarczających informacji dla wielu z nich, aby określić związek z nowotworem na podstawie analizy segregacji genetycznej^3,10,13,14. Wykorzystując tę metodę, można określić wpływ konkretnego wariantu na biologiczną funkcję BRCA1 w regulacji rekombinacji homologicznej, co mogłoby posłużyć do informowania kobiet posiadających jeden z tych wariantów w swoim genomie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM	Invitrogen	11960
FBS	USA Scientific, Inc.	9871-5200
siRNA	Invitrogen	N/A
Lipofectamine-2000	Invitrogen	11668
TrypLE	Invitrogen	12604
Puromycyna	Enzo Life Sciences	BML-GR312
Opti-MEM I	Invitrogen	31985
Pirowinian sodu	Invitrogen	11360
GlutaMAX I	Invitrogen	35050
Penicylina-streptomycyna	Invitrogen	15140