Przedstawiamy metodę testowania wariantów BRCA1 w teście opartym na hodowli tkankowej dla homologicznej naprawy pęknięć DNA, polegającą na usunięciu endogennego białka BRCA1 z komórki za pomocą RNAi i zastąpieniu go mutantem punktowym BRCA1 zawierającym zmianę kodującą.
Artykuł metodologiczny
Identyfikacja wpływu mutacji BRCA1 na rekombinację homologiczną z wykorzystaniem komórek wykazujących endogenną ekspresję BRCA1 typu dzikiego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Analiza funkcjonalna mutacji typu missense może być utrudniona przez obecność białka endogennego w komórce. Analizy strukturalno-funkcjonalne BRCA1 były komplikowane przez brak wiarygodnego testu dla pełnowymiarowego białka BRCA1 oraz trudności związane z pracą z liniami komórkowymi wykazującymi ekspresję hypomorficznego białka BRCA11,2,3,4,5. Opracowaliśmy system, w którym endogenne białko BRCA1 w komórce było gwałtownie usuwane za pomocą RNAi celującego w 3'-UTR mRNA BRCA1 i zastępowane poprzez kotransfekcję plazmidu wykazującego ekspresję wariantu BRCA1. Jedną z zalet tej procedury jest to, że gwałtowne wyciszenie BRCA1 i jednoczesne zastąpienie pozwalają komórkom rosnąć bez wtórnych mutacji lub adaptacji, które mogłyby pojawić się z czasem w celu skompensowania utraty funkcji BRCA1. Ta procedura usuwania i przywracania (depletion and add-back) została przeprowadzona w linii komórkowej pochodzącej z komórek HeLa, która była łatwo testowana pod kątem aktywności rekombinacji homologicznej. Test rekombinacji homologicznej opiera się na wcześniej opublikowanej metodzie, w której substrat rekombinacyjny jest zintegrowany z genomem (Rysunek 1)6,7,8,9. Ten substrat rekombinacyjny posiada miejsce rozpoznawane przez rzadko tnący enzym restrykcyjny I-SceI wewnątrz nieaktywnego allelu GFP, a poniżej znajduje się drugi nieaktywny allel GFP. Transfekcja plazmidu wykazującego ekspresję I-SceI prowadzi do pęknięcia obu nici DNA, które może zostać naprawione poprzez rekombinację homologiczną; jeżeli rekombinacja homologiczna naprawi to pęknięcie, powstaje aktywny allel GFP, który jest łatwo oceniany za pomocą cytometrii przepływowej pod kątem ekspresji białka GFP. Usunięcie endogennego BRCA1 spowodowało 8-10-krotny spadek aktywności rekombinacji homologicznej, a przywrócenie plazmidu typu dzikiego w pełni odtworzyło funkcję rekombinacji homologicznej. Gdy specyficzne mutanty punktowe pełnowymiarowego BRCA1 były wyrażane z kotransfekowanych plazmidów, można było ocenić efekt konkretnego mutantu missense. Przykładowo, ekspresja białka BRCA1(M18T), wariantu o nieznanym znaczeniu klinicznym10, w tych komórkach nie przywróciła zależnej od BRCA1 rekombombinacji homologicznej. W przeciwieństwie do tego, ekspresja innego wariantu, również o nieznanym znaczeniu, BRCA1(I21V), w pełni przywróciła funkcję zależnej od BRCA1 rekombinacji homologicznej. Tę strategię testowania funkcji mutacji missense BRCA1 zastosowano w innym systemie biologicznym badającym funkcję centrosomów (Kais i wsp., niepublikowane obserwacje). Ogólnie rzecz biorąc, podejście to jest odpowiednie do analizy mutantów missense w każdym genie, który musi być analizowany recesywnie.
Protokół
1. Linia komórkowa zintegrowanym substratem rekombinacyjnym
- Komórki HeLa zostały stabilnie przetransformowane plazmidem pDR-GFP (plazmid7 otrzymany od M. Jasina z Memorial Sloan-Kettering Cancer Center) i utrzymywane w obecności puromycyny w celu selekcji transformantów.
- Komórki pasażowane są w pożywce DMEM/FBS zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej, 2 mM GlutaMAX, 1 mM pirogronianu sodu, penicylinę/streptomycynę (10 U/ mL/0.1 mg/ mL) oraz 1.5 ug/ mL puromycyny.
Podłoże rekombinacyjne w plazmidzie pDR-GFP oraz w stabilnych transformantach zawiera dwa nieaktywne allele GFP (Rysunek 1). Jeden allel jest nieaktywny z powodu obecności 18 bp sekwencji rozpoznawania enzymu restrykcyjnego I-SceI w jego sekwencji kodującej. Ekspresja I-SceI w tych komórkach powoduje powstanie pęknięcia dwuniciowego DNA (DSB). W tym DNA znajduje się drugi nieaktywny allel GFP, jednak fragment jego sekwencji odpowiadający miejscu I-SceI w pierwszym allelu jest typu dzikiego. Ten drugi allel GFP może pełnić rolę donora sekwencji dla naprawy DSB poprzez rekombinację homologiczną, co prowadzi do powstania aktywnego allelu GFP, który jest łatwo wykrywalny za pomocą cytometrii przepływowej. Alternatywnie, DSB może zostać naprawione przez niehomologiczne łączenie końców, co zniszczyłoby miejsce restrykcyjne I-SceI i doprowadziło do powstania komórek GFP-ujemnych. Poziom rekombinacji homologicznej w komórce określa się poprzez obliczenie procentowej liczby komórek GFP-dodatnich.
Linia komórkowa ta, pHeLa-DR13-9, została wybrana spośród wszystkich klonów ze względu na brak sygnału GFP w tle oraz stosunkowo wysoki odsetek komórek GFP-dodatnich po transfekcji plazmidem pCBASce wykazującym ekspresję I-SceI. (Plazmid pCBASce oraz jego kontrola wektorowa, pCAGGS, zostały dostarczone przez M. Jasina z Memorial Sloan-Kettering Cancer Center).
Linia komórkowa HeLa-DR13-9 jest dostępna od autorów na żądanie.
2. Transfekcja w celu wyczerpania endogennego BRCA1 i wprowadzenia zmutowanego BRCA1.
- Dzień przed pierwszą transfekcją (zazwyczaj we wtorek): Przygotuj komórki HeLa-DR13-9 w szalce 10 cm o stopniu konfluencji co najmniej 90%.
- Przeprowadź trypsynizację w 1 mL i zatrzymaj reakcję, dodając 9 mL DMEM/FBS, a następnie dokładnie wymieszaj za pomocą pipety.
- Do każdej studzienki płytki 24-dołkowej w 0,5 mL DME/FBS dodaj 40 μL trypsynizowanych komórek.
- Dzień 1 transfekcji (środa): Komórki powinny osiągnąć konfluencję na poziomie ~40-50%; jeśli jest ona znacznie niższa, należy powtórzyć procedurę. Wykonaj transfekcję, mieszając: 5 pmol siRNA + 0,3 ug plazmidowego DNA wykazującego ekspresję zmutowanego BRCA1 w 12,5 μL Opti-MEM oraz 0,5 μL Lipofectamine 20 w 12,5 μL Opti-MEM. Kontynuuj transfekcję zgodnie z protokołem Lipofectamine (Invitrogen).
- Wymień medium po 4-6 godzinach. Stosowane przez nas siRNA do wyciszenia BRCA1 opiera się na sekwencji GCUCCUCACUCUUCAGU, specyficznej dla sekwencji 3'-UTR BRCA1 od 80 780 do 80 798 (numer dostępu AY273801).
- Dzień 2: Przenieś komórki z płytki 24-dołkowej do płytki 6-dołkowej poprzez trypsynizację.
- Dzień 3 transfekcji: 25 pmol siRNA + 0,75 ug plazmidowego DNA wykazującego ekspresję zmutowanego BRCA1 + 0,75 ug pCBASce (lub kontrolny wektor pCAGGS) w 62,5 μL Opti-MEM oraz 2,5 μL Lipofectamine 20 w 62,5 μL Opti-MEM. Wymień medium po 4-6 godzinach.
3. Analiza transfektantów.
- W 6. dniu przeprowadź trypsynizację komórek z każdej studzienki i zatrzymaj proces w 1 mL DMEM/FBS. Analizę ekspresji GFP w komórkach można przeprowadzić w 5. lub 7. dniu, jednak najlepiej sprawdza się 6. dzień.
- Przeanalizuj 10 0 komórek na studzienkę za pomocą cytometrii przepływowej. Wykorzystano instrument Becton Dickinson FACSCalibur w zasobach współdzielonych Analytical Cytometry w Ohio State University Comprehensive Cancer Center. Pojedyncze, żywe komórki wyodrębniono za pomocą parametrów rozproszenia przedniego (FSC) i bocznego (SSC). Komórki GFP-dodatnie wykryto za pomocą detektora fluorescencji GFP (FL1), a wyniki przedstawiono w formie histogramu (Rysunek 2, dół).
- Pozostałe komórki można wysiać ponownie w celu wykonania fotografii za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, jeśli jest to wymagane.
4. Reprezentatywne wyniki:
BRCA1 reguluje szlak naprawy pęknięć dwuniciowych DNA poprzez rekombinację homologiczną6,1. Komórki, w których doszło do naprawy poprzez rekombinację homologiczną, są łatwo wykrywalne za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (Rysunek 2, góra). Wyciszenie BRCA1 prowadzi do zmniejszenia liczby wykrytych komórek GFP-dodatnich (Rysunek 2, prawo). Wynikiem z analizatora FACSCalibur jest histogram z intensywnością GFP na pojedynczą komórkę na osi X oraz liczbą komórek na osi Y (Rysunek 2, dół). W typowym zestawie wyników z jednego eksperymentu, 15,5% komórek było GFP-dodatnich po ekspresji I-SceI i kontrolnym wyciszeniu RNAi (Rysunek 3). Dla porównania, wyciszenie BRCA1 i wprowadzenie pustego wektora zredukowało konwersję GFP do 0,7%. Ponowne wprowadzenie BRCA1 typu dzikiego lub BRCA1(I21V) w pełni przywróciło rekombinację homologiczną, co potwierdzono poprzez uzyskanie 15-16% komórek GFP-dodatnich. Wprowadzenie mutanta BRCA1(M18T) (Rysunek 3, ścieżka 5) miało efekt podobny do wprowadzenia kontrolnego wektora. Ponieważ wariant ten był ekspresowany na poziomach zbliżonych do białka endogennego9, interpretujemy to tak, że wariant BRCA1(M18T) jest niefunkcjonalny w procesie rekombinacji homologicznej.
Zazwyczaj po transfekcji plazmidu ekspresyjnego I-SceI od 10-20% komórek ulega konwersji do fenotypu GFP-dodatniego. Deplecja BRCA1 powtarzalnie zmniejsza konwersję komórek GFP-dodatnich około 8-10 krotnie. Choć rzeczywiste wartości procentowe komórek GFP-dodatnich mogą różnić się między poszczególnymi eksperymentami, stosunek komórek GFP-dodatnich po deplecji BRCA1 w stosunku do deplecji kontrolnej w obrębie jednego eksperymentu jest dość spójny. Wyniki normalizujemy, przyjmując stopień konwersji bez inhibicji jako 10%, a wyniki dla deplecji BRCA1 oraz tzw. add-backów przedstawiamy w procentach. W ten sposób możemy łączyć wyniki z wielu eksperymentów, a zmienność eksperymentalna nie jest wysoka.
Wprowadzenie mutantów BRCA1 dostarczyło dotychczas jednoznacznych wyników: każdy wariant BRCA1 albo w pełni przywracał aktywność rekombinacji homologicznej, albo nie wywierał żadnego wpływu. Istotnym aspektem przy uzyskiwaniu tych wyników jest fakt, że nasze warunki transfekcji zapewniają poziomy białka BRCA1 w przybliżeniu równoliczne z koncentracją białka endogennego w komórkach niepoddanych leczeniu. Zbyt silna nadekspresja, nawet w przypadku wadliwego mutantu BRCA1, może prowadzić do wystąpienia pewnej dodatniej aktywności rekombinacji homologicznej.
Problemem, który musieliśmy rozwiązać, była toksyczność transfekcji. Samo usunięcie BRCA1 może spowolnić wzrost komórek, dlatego należy utrzymać stałą proporcję Lipofectamine-200 i plazmidowego DNA w stosunku do liczby komórek na płytce. Nadmiar Lipofectamine lub plazmidowego DNA zredukuje liczbę komórek, co sprawi, że będzie ona niewystarczająca do uzyskania wiarygodnych wyników cytometrii przepływowej. Zachowanie odpowiedniej równowagi między odczynnikami plazmidowymi a Lipofectamine a liczbą transfekowanych komórek jest kluczowe dla utrzymania ich żywotności.
Rycina 1. Substrat do rekombinacji. Strategia opracowana przez grupę M. Jasina7,12 przedstawiono. Plazmid pDR-GFP zawiera dwa wadliwe allele GFP, z których jeden zawiera miejsce rozpoznawane przez endonukleazę restrykcyjną I-SceI. Linia komórkowa pochodząca z komórek HeLa zawiera ten substrat DNA zintegrowany w jednym miejscu w genomie9or aktywna naprawa pęknięcia dwuniciowego DNA w miejscu I-SceI poprzez rekombinację homologiczną prowadzi do konwersji jednego allelu na GFP-dodatni.
Rysunek 2. Wykrywanie komórek GFP-dodatnich za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Komórki badano zgodnie z niniejszym protokołem; komórki kontrolne (bez wyciszenia genów) wykazywały aktywność w procesie rekombinacji homologicznej, co potwierdzono wysokim odsetkiem komórek wykazujących ekspresję GFP (lewa strona). Wyciszenie BRCA1 za pomocą RNAi prowadzi do gwałtownego spadku liczby komórek GFP-dodatnich (prawa strona).
Rysunek 3. Wyniki testu add-back dla mutantów missense białka BRCA1. Na tym histogramie przedstawiono wyniki pojedynczego eksperymentu. W przypadku braku transfekcji plazmidem wykazującym ekspresję I-SceI (ścieżka 1) nie wykryto komórek GFP-dodatnich. Wyniki w ścieżkach 2–6 uzyskano z komórek, w których plazmid wykazujący ekspresję I-SceI został przetransfekowany w 3. dniu. W komórkach z wyczerpaniem nieistotnego genu (lucyferazy) i add-backiem wektora 15,5% komórek było GFP-dodatnich (ścieżka 2). Wyczerpanie BRCA1 i add-back wektora ujawnia wpływ utraty BRCA1 na rekombinację homologiczną (ścieżka 3). Przedstawiono efekty wyczerpania BRCA1 i add-backu BRCA1 typu dzikiego (ścieżka 4), BRCA1(M18T) (ścieżka 5) oraz BRCA1(I21V) (ścieżka 6). Wyniki te pochodzą z jednego eksperymentu i zostałyby połączone z co najmniej dwoma kolejnymi powtórzeniami eksperymentalnymi w celu uzyskania pomiaru rekombinacji homologicznej wspieranej przez dane białko mutant BRCA1.
Dyskusja
Zaletą tej metody jest możliwość badania funkcji białka BRCA1 w regulacji naprawy DNA poprzez rekombinację homologiczną z wykorzystaniem komórek wykazujących endogenną ekspresję BRCA1 typu dzikiego. W celu opracowania nowej metody testowania funkcji wariantów BRCA1 w naprawie DNA, zaadaptowaliśmy dwie oddzielne, uznane metody badania procesu rekombinacji homologicznej oraz wykorzystania deplecji za pośrednictwem RNAi. Kluczem do sukcesu tej metody było stworzenie łatwo transfektowalnej linii komórkowej, takiej jak HeLa, z substratem rekombinacyjnym w genomie, co pozwoliło na uzyskanie bardzo wysokiego poziomu konwersji GFP. Przeskanowaliśmy wiele klonów z pierwotnej transformacji, aby uzyskać taki, który nie wykazywał wykrywalnego sygnału tła GFP, lecz po transfekcji plazmidem ekspresyjnym I-SceI wykazywał bardzo wysoki poziom konwersji GFP.
Za pomocą tej metody badamy obecnie inne specyficzne reszty aminokwasowe BRCA1 pod kątem ich funkcji w rekombinacji homologicznej. Wraz z biologicznymi spostrzeżeniami wynikającymi z niniejszej pracy, wnioski te mogą zostać zastosowane w klinicznej genetyce nowotworów. Wysoki odsetek mutacji typu missense w genie BRCA1 ma nieznane znaczenie kliniczne, ponieważ istnieje wiele rzadkich wariantów i brakuje wystarczających informacji dla wielu z nich, aby określić związek z nowotworem na podstawie analizy segregacji genetycznej3,10,13,14. Wykorzystując tę metodę, można określić wpływ konkretnego wariantu na biologiczną funkcję BRCA1 w regulacji rekombinacji homologicznej, co mogłoby posłużyć do informowania kobiet posiadających jeden z tych wariantów w swoim genomie.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Jesteśmy wdzięczni Ohio State University Comprehensive Cancer Center za sfinansowanie tych badań.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| DMEM | Invitrogen | 11960 | |
| FBS | USA Scientific, Inc. | 9871-5200 | |
| siRNA | Invitrogen | N/A | |
| Lipofectamine-2000 | Invitrogen | 11668 | |
| TrypLE | Invitrogen | 12604 | |
| Puromycyna | Enzo Life Sciences | BML-GR312 | |
| Opti-MEM I | Invitrogen | 31985 | |
| Pirowinian sodu | Invitrogen | 11360 | |
| GlutaMAX I | Invitrogen | 35050 | |
| Penicylina-streptomycyna | Invitrogen | 15140 |
Bibliografia
- Carvalho, M. A. Determination of cancer risk associated with germ line BRCA1 missense variants by functional analysis. Cancer Res. 67, 1494-1501 (2007).
- Couch, F. J. Genetic epidemiology of BRCA1. Cancer Biol Ther. 3, 509-514 (2004).
- Couch, F. J. Assessment of functional effects of unclassified genetic variants. Hum Mutat. 29, 1314-1326 (2008).
- Tomlinson, G. E. Characterization of a breast cancer cell line derived from a germ-line BRCA1 mutation carrier. Cancer Res. 58, 3237-3242 (1998).
- Ruffner, H., Joazeiro, C. A., Hemmati, D., Hunter, T., Verma, I. M. Cancer-predisposing mutations within the RING domain of BRCA1: loss of ubiquitin protein ligase activity and protection from radiation hypersensitivity. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 5134-5139 (2001).
- Moynahan, M. E., Chiu, J. W., Koller, B. H., Jasin, M. Brca1 controls homology-directed DNA repair. Mol Cell. 4, 511-518 (1999).
- Nakanishi, K. Human Fanconi anemia monoubiquitination pathway promotes homologous DNA repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1110-1115 (2005).
- Pierce, A. J. Double-strand breaks and tumorigenesis. Trends Cell Biol. 11, 52-59 (2001).
- Ransburgh, D. J., Chiba, N., Ishioka, C., Toland, A. E., Parvin, J. D. Identification of breast tumor mutations in BRCA1 that abolish its function in homologous DNA recombination. Cancer Res. 70, 988-995 (2010).
- Easton, D. F. A systematic genetic assessment of 1,433 sequence variants of unknown clinical significance in the BRCA1 and BRCA2 breast cancer-predisposition genes. Am J Hum Genet. 81, 873-883 (2007).
- Snouwaert, J. N. BRCA1 deficient embryonic stem cells display a decreased homologous recombination frequency and an increased frequency of non-homologous recombination that is corrected by expression of a brca1 transgene. Oncogene. 18, 7900-7907 (1999).
- Pierce, A. J., Hu, P., Han, M., Ellis, N., Jasin, M. Ku DNA end-binding protein modulates homologous repair of double-strand breaks in mammalian cells. Genes Dev. 15, 3237-3242 (2001).
- Spearman, A. D. Clinically applicable models to characterize BRCA1 and BRCA2 variants of uncertain significance. J Clin Oncol. 26, 5393-5400 (2008).
- Sweet, K., Senter, L., Pilarski, R., Wei, L., Toland, A. E. Characterization of BRCA1 ring finger variants of uncertain significance. Breast Cancer Res Treat. 119, 737-743 (2009).
Przedruki i uprawnienia
