Artykuł metodologiczny

Identyfikacja wpływu mutacji BRCA1 na rekombinację homologiczną przy użyciu komórek wyrażających endogenne BRCA1 typu dzikiego

DOI:

10.3791/2468

⸱

17 lutego 2011

 ,  , 
1Department of Biomedical Informatics, The Ohio State University, 2Departments of Molecular Immunology and Clinical Oncology, Tohoku University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Udostępniamy metodę testowania wariantów BRCA1 w teście opartym na hodowli tkankowej do naprawy uszkodzeń DNA metodą rekombinacji homologicznej poprzez usunięcie endogennego białka BRCA1 z komórki za pomocą RNAi i zastąpienie go mutantem punktowym BRCA1, który zawiera zmianę kodującą.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza funkcjonalna mutacji typu missense może być skomplikowana przez obecność w komórce endogennego białka. Analizy strukturalno-funkcjonalne BRCA1 były skomplikowane ze względu na brak solidnego testu dla białka BRCA1 o pełnej długości oraz trudności związane z pracą z liniami komórkowymi, które wyrażają hipomorficzne białko BRCA11,2,3,4,5. Opracowaliśmy system, w którym endogenne białko BRCA1 w komórce zostało ostro zubożone przez RNAi ukierunkowane na 3'-UTR mRNA BRCA1 i zastąpione przez kotransfekcję plazmidu wyrażającego wariant BRCA1. Jedną z zalet tej procedury jest to, że ostre wyciszenie BRCA1 i jednoczesna wymiana pozwalają komórkom rosnąć bez wtórnych mutacji lub adaptacji, które mogą pojawić się z czasem, aby skompensować utratę funkcji BRCA1. Ta procedura zubożenia i uzupełniania została przeprowadzona w linii komórkowej pochodzącej z HeLa, którą łatwo przetestowano pod kątem aktywności rekombinacji homologicznej. Test rekombinacji homologicznej opiera się na wcześniej opublikowanej metodzie, w której substrat rekombinacji jest integrowany z genomem (ryc. 1)6,7,8,9. Ten substrat rekombinacyjny ma rzadkie miejsce enzymu restrykcyjnego I-SceI wewnątrz nieaktywnego allelu GFP, a poniżej znajduje się drugi nieaktywny allel GFP. Transfekcja plazmidu, który wyraża I-SceI, powoduje dwuniciowe pęknięcie, które może być naprawione przez rekombinację homologiczną, a jeśli rekombinacja homologiczna naprawia pęknięcie, tworzy aktywny allel GFP, który jest łatwo oceniany za pomocą cytometrii przepływowej w celu ekspresji białka GFP. Zubożenie endogennego BRCA1 spowodowało 8-10-krotne zmniejszenie aktywności rekombinacji homologicznej i dodanie plazmidu typu dzikiego w pełni przywróconą funkcję rekombinacji homologicznej. Gdy specyficzne mutanty punktowe pełnej długości BRCA1 uległy ekspresji z kotransfekowanych plazmidów, można było ocenić wpływ specyficznego mutanta missense. Na przykład ekspresja białka BRCA1(M18T), wariantu o nieznanym znaczeniu klinicznym10, uległa ekspresji w tych komórkach, nie udało się przywrócić rekombinacji homologicznej zależnej od BRCA1. Natomiast ekspresja innego wariantu, również o nieznanym znaczeniu, BRCA1(I21V) w pełni przywróciła zależną od BRCA1 funkcję rekombinacji homologicznej. Ta strategia testowania funkcji mutacji błędnego sensu BRCA1 została zastosowana do innego systemu biologicznego badającego funkcję centrosomów (Kais i wsp., obserwacje niepublikowane). Ogólnie rzecz biorąc, podejście to jest odpowiednie do analizy mutantów missense w dowolnym genie, który musi być analizowany recesywnie.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Linia komórkowa ze zintegrowanym substratem rekombinacyjnym

  1. Komórki HeLa były stabilnie transformowane za pomocą pDR-GFP (plazmid7 dar od M. Jasin, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center) i utrzymywane w puromycynie w celu selekcji transformantów.
  2. Komórki są pasażowane w DMEM / FBS, zawierającym 10% płodowej surowicy bydlęcej, 2 mM GlutaMAX, 1 mM pirogronianu sodu, penicyliny/streptomycyny (100 U / ml / 0,1 mg / ml) i 1,5 ug / ml puromycyny.

Substrat rekombinacji w plazmidzie pDR-GFP oraz w stabilnych transformantach zawiera dwa nieaktywne allele GFP (Rysunek 1). Jeden allel jest nieaktywny ze względu na włączenie do jego sekwencji kodującej miejsca rozpoznawania enzymu restrykcyjnego 18 pz dla I-SceI. Ekspresja I-SceI w tych komórkach powoduje dwuniciowe pęknięcie DNA (DSB). W tym DNA znajduje się drugi allel nieaktywnego GFP, ale część jego sekwencji skorelowana z miejscem I-SceI na pierwszym allelu jest typu dzikiego. Ten drugi allel GFP może funkcjonować jako dawca sekwencji do naprawy rekombinacji homologicznej DSB i skutkowałby aktywnym allelem GFP, który jest łatwo wykrywany przez cytometrię przepływową. Alternatywnie, DSB może być naprawiony przez niehomologiczne łączenie końców, co zniszczyłoby miejsce restrykcyjne I-SceI i spowodowałoby powstanie komórek GFP-ujemnych. Poziom rekombinacji homologicznej w komórce określa się poprzez zliczenie procentu komórek GFP-dodatnich.

Ta linia komórkowa, pHeLa-DR13-9, została wybrana spośród wszystkich klonów ze względu na zerowy sygnał tła GFP i stosunkowo wysoki procent komórek GFP dodatnich po transfekcji plazmidem eksprymującym I-SceI, pCBASce. (pCBASce i jego kontroler wektorowy, pCAGGS, zostały dostarczone przez M. Jasina z Memorial Sloan-Kettering Cancer Center).
Linia komórkowa HeLa-DR13-9 jest dostępna u autorów na życzenie.

2. Transfekcja w celu zubożenia endogennego BRCA1 i dodania z powrotem zmutowanego BRCA1.

  1. Dzień przed pierwszą transfekcją (zwykle we wtorek): Rozpocznij od 10-centymetrowej płytki z komórkami HeLa-DR13-9 o co najmniej 90% zlewających się.
  2. Trypsynizować w 1 ml i zatrzymać reakcję przez dodanie 9 ml DMEM/FBS, dobrze wymieszać pipetując.
  3. Dodaj 40 μl trypsynizowanych komórek na dołek 24-dołkowej płytki w 0,5 ml DME/FBS.
  4. Dzień 1 transfekcji (środa): komórki powinny być ~ 40-50% zlewające się, jeśli znacznie mniej zacząć od nowa. Transfekcja przez mieszanie: 5 pmol siRNA + 0,3 ug BRCA1-mutant wykazujący ekspresję plazmidowego DNA w 12,5 μl Opti-MEM; i 0,5 μl Lipofectamine 2000 w 12,5 μl Opti-MEM. Kontynuuj transfekcję zgodnie z protokołem Lipofectamine (Invitrogen).
  5. Wymień nośnik 4-6 godzin później. SiRNA, którego używamy do zubożenia BRCA1, opiera się na sekwencji GCUCCUCUCUCUCUUCAGU określającej sekwencje BRCA1 3'-UTR od 80,780 do 80,798 (numer dostępu AY273801).
  6. Dzień 2: Przenieś komórki przez trypsynizację z płytki 24-dołkowej na płytkę 6-dołkową.
  7. Dzień 3 transfekcje: 25 pmol siRNA + 0,75 ug BRCA1-mutant eksprymujący plazmidowe DNA + 0,75 ug pCBASce (lub kontrola wektorowa pCAGGS) w 62,5 μl Opti-MEM i 2,5 μl Lipofectamine 2000 w 62,5 μl Opti-MEM. Wymień nośnik 4-6 godzin później.

3. Analiza transfektantów.

  1. W 6 dniu trypsynizuj komórki z każdej studzienki i zatrzymaj się w 1 mL DMEM / FBS. Analizę komórek pod kątem ekspresji GFP można przeprowadzić w dniu 5 lub 7, ale okazuje się, że najlepiej sprawdza się dzień 6.
  2. Przeanalizuj 10 000 komórek na studzienkę za pomocą cytometrii przepływowej. Używamy instrumentu Becton Dickinson FACSCalibur we wspólnym zasobie Kompleksowego Centrum Onkologii Analitycznej Uniwersytetu Stanowego Ohio. Pojedyncze, dynamiczne komórki są bramkowane przy użyciu parametrów rozproszenia do przodu i boku. Komórki GFP-dodatnie są wykrywane za pomocą detektora fluorescencji GFP (FL1), a wyniki są prezentowane w postaci histogramu (ryc. 2, na dole).
  3. W razie potrzeby pozostałe komórki można ponownie pokryć do fotografii za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

4. Reprezentatywne wyniki:

BRCA1 reguluje szlak naprawy pęknięć dwuniciowego DNA poprzez rekombinację homologiczną6,11. Te komórki, które uległy naprawie przez rekombinację homologiczną, są łatwo wykrywane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (ryc. 2, u góry). Zubożenie BRCA1 powoduje zmniejszenie liczby wykrytych komórek GFP-dodatnich (ryc. 2, po prawej). Dane wyjściowe z FACSCalibur to histogram z intensywnością GFP na komórkę na osi X i liczbą komórek na osi Y (rysunek 2, na dole). W typowym zestawie wyników z pojedynczego eksperymentu 15,5% komórek było GFP-dodatnich po ekspresji I-SceI i kontrolnym wyczerpaniu RNAi (Figura 3). Dla porównania, zubożenie BRCA1 i dodanie wektorów zmniejszyło konwersję GFP do 0,7%. Dodanie w pełni przywróconej rekombinacji homologicznej BRCA1 typu dzikiego lub BRCA1 (I21V), wykrytej przez uzyskanie 15-16% komórek GFP-dodatnich. Dodanie mutanta BRCA1(M18T) (Rysunek 3, tor 5) miało podobny efekt jak dodanie kontroli wektorowej. Ponieważ wariant ten ulega ekspresji na podobnych poziomach jak endogenne białko9, interpretujemy wariant BRCA1(M18T) jako niefunkcjonalny w rekombinacji homologicznej.

Zazwyczaj mamy 10-20% komórek przekształcających się w GFP-dodatnie po transfekcji plazmidu ekspresji I-SceI. Zmniejszenie ilości BRCA1 w sposób powtarzalny zmniejsza konwersję komórek GFP-dodatnich około 8-10 razy. Chociaż rzeczywisty odsetek komórek GFP-dodatnich może się zmieniać w zależności od eksperymentu, stosunek komórek GFP-dodatnich po wyczerpaniu BRCA1 w stosunku do zubożenia kontrolnego w eksperymencie jest dość spójny. Normalizujemy wyniki, ustawiając nieskrępowany współczynnik konwersji na 100% i wyrażamy wyniki z wyczerpaniami i uzupełnieniami BRCA1 w procentach. W ten sposób możemy połączyć wiele eksperymentów, a zmienność eksperymentalna nie jest duża.

Dodanie mutantów BRCA1 do tej pory przyniosło solidne wyniki: każdy wariant BRCA1 albo w pełni przywrócił homologiczną aktywność rekombinacji, albo nie przyniósł żadnego efektu. Ważnym czynnikiem w uzyskaniu tych wyników jest to, że nasze warunki transfekcji wytwarzają poziomy białka BRCA1, które w przybliżeniu są równe stężeniu endogennego białka w nieleczonych komórkach. Zbyt wysoka nadekspresja nawet wadliwego mutanta BRCA1 może skutkować dodatnią aktywnością rekombinacji homologicznej.

Problemem, który musieliśmy rozwiązać, była toksyczność transfekcji. Samo wyczerpanie BRCA1 może spowolnić wzrost komórek, a równowaga lipofeektaminy-2000 i plazmidowego DNA w stosunku do liczby komórek na szalce musi być utrzymywana na stałym poziomie. Zbyt duża ilość lipofeektaminy lub plazmidowego DNA zmniejszy liczbę komórek, a liczba komórek będzie niewystarczająca do uzyskania wiarygodnych wyników cytometrii przepływowej. Równowaga odczynników plazmidowych i lipofekcaminy w stosunku do liczby transfekowanych komórek jest bardzo ważna dla utrzymania żywotności komórek.

figure-protocol-1
Rysunek 1. Podłoże rekombinacyjne. Przedstawiona jest strategia, która została opracowana przez grupę M. Jasin7,12. Plazmid pDR-GFP zawiera dwa wadliwe allele GFP, z których jeden zawiera miejsce endonukleazy restrykcyjnej I-SceI. Linia komórkowa pochodząca z HeLa zawiera ten substrat DNA zintegrowany w jednym miejscu w genomie9, a aktywna naprawa dwuniciowego pęknięcia DNA w miejscu I-SceI przez rekombinację homologiczną powoduje konwersję jednego allelu do GFP-dodatniego.

figure-protocol-2
Rysunek 2. Wykrywanie komórek GFP-dodatnich za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Komórki były testowane zgodnie z tym protokołem, a komórki zubożone w kontrolę były aktywne w rekombinacji homologicznej, co wykryto u wysokiego odsetka komórek z ekspresją GFP (po lewej). Zubożenie BRCA1 przez RNAi powoduje gwałtowny spadek liczby komórek GFP-dodatnich (po prawej).

figure-protocol-3
Rysunek 3. Wyniki addycji mutantów błędnego sensu BRCA1. Wyniki pojedynczego eksperymentu są pokazane na tym histogramie. W przypadku braku transfekowanego plazmidu wykazującego ekspresję I-SceI (ścieżka 1) nie wykrywa się komórek GFP-dodatnich. Wyniki na torach 2-6 zostały pobrane z komórek, w których plazmid wyrażający ekspresję I-SceI został przetransfekowany w dniu 3. W komórkach, które były zubożone o nieistotny gen (lucyferazę) i z addycją wektora, 15,5% komórek było GFP-dodatnich (ścieżka 2). Zubożenie BRCA1 i add-back wektora ujawnia wpływ utraty BRCA1 na rekombinację homologiczną (tor 3). Przedstawiono skutki wyczerpania BRCA1 i dodania BRCA1 typu dzikiego (tor 4), BRCA1(M18T) (tor 5) i BRCA1(I21V) (tor 6). Wyniki te pochodzą z pojedynczego eksperymentu i zostaną połączone z co najmniej dwoma kolejnymi powtórzeniami w celu uzyskania miary rekombinacji homologicznej wspieranej przez dane zmutowane białko BRCA1.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zaletą tej metody jest to, że możemy badać funkcję białka BRCA1 w regulacji naprawy DNA poprzez rekombinację homologiczną przy użyciu komórek, które mają endogenną ekspresję BRCA1 typu dzikiego. Przyjęliśmy dwie odrębne, ustalone metody badania procesu rekombinacji homologicznej i wykorzystania zubożenia za pośrednictwem RNAi w celu uzyskania nowej metody testowania wariantów BRCA1 pod kątem funkcji naprawy DNA. Kluczem do sukcesu tej metody było stworzenie łatwo transfekcjonalnej linii komórkowej, takiej jak HeLa, z substratem rekombinacyjnym w genomie, dzięki czemu uzyskujemy bardzo wysoki poziom konwersji GFP. Przebadaliśmy wiele klonów oryginalnej transformacji, aby uzyskać taki, który nie miał wykrywalnego sygnału tła GFP, ale po transfekcji plazmidu ekspresji I-SceI miał bardzo wysoki poziom konwersji GFP.

Dzięki tej metodzie badamy teraz inne specyficzne reszty aminokwasowe BRCA1 pod kątem funkcji w rekombinacji homologicznej. Wraz z biologicznymi spostrzeżeniami wynikającymi z tej pracy, wnioski te można zastosować do klinicznej genetyki nowotworów. Wysoki odsetek mutacji typu missense BRCA1 ma nieznane znaczenie kliniczne, ponieważ istnieje wiele rzadkich wariantów i nie ma wystarczających informacji na temat wielu z nich, aby określić związek z rakiem za pomocą analizy segregacji genetycznej3,10,13,14. Korzystając z tej metody, konsekwencje określonego wariantu dla biologicznej funkcji BRCA1 w regulacji rekombinacji homologicznej mogą być wykorzystane do poinformowania kobiet, które są nosicielkami jednego z tych wariantów w swoim genomie.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni Kompleksowemu Centrum Onkologicznemu Uniwersytetu Stanowego Ohio za zapewnienie funduszy na tę pracę.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEMInvitrogen11960
FBSUSA Scientific, Inc.9871-5200
siRNAInvitrogenN/A
Lipofectamine-2000Invitrogen11668
TrypLEInvitrogen12604
PuromycinEnzo Life SciencesBML-GR312
Opti-MEM IInvitrogen31985
Pirogronian soduInvitrogen11360
GlutaMAX IInvitrogen35050
Penicylina-StreptomycynaInvitrogen15140

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Carvalho, M. A. Determination of cancer risk associated with germ line BRCA1 missense variants by functional analysis. Cancer Res. 67, 1494-1501 (2007).
  2. Couch, F. J. Genetic epidemiology of BRCA1. Cancer Biol Ther. 3, 509-514 (2004).
  3. Couch, F. J. Assessment of functional effects of unclassified genetic variants. Hum Mutat. 29, 1314-1326 (2008).
  4. Tomlinson, G. E. Characterization of a breast cancer cell line derived from a germ-line BRCA1 mutation carrier. Cancer Res. 58, 3237-3242 (1998).
  5. Ruffner, H., Joazeiro, C. A., Hemmati, D., Hunter, T., Verma, I. M. Cancer-predisposing mutations within the RING domain of BRCA1: loss of ubiquitin protein ligase activity and protection from radiation hypersensitivity. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 5134-5139 (2001).
  6. Moynahan, M. E., Chiu, J. W., Koller, B. H., Jasin, M. Brca1 controls homology-directed DNA repair. Mol Cell. 4, 511-518 (1999).
  7. Nakanishi, K. Human Fanconi anemia monoubiquitination pathway promotes homologous DNA repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1110-1115 (2005).
  8. Pierce, A. J. Double-strand breaks and tumorigenesis. Trends Cell Biol. 11, 52-59 (2001).
  9. Ransburgh, D. J., Chiba, N., Ishioka, C., Toland, A. E., Parvin, J. D. Identification of breast tumor mutations in BRCA1 that abolish its function in homologous DNA recombination. Cancer Res. 70, 988-995 (2010).
  10. Easton, D. F. A systematic genetic assessment of 1,433 sequence variants of unknown clinical significance in the BRCA1 and BRCA2 breast cancer-predisposition genes. Am J Hum Genet. 81, 873-883 (2007).
  11. Snouwaert, J. N. BRCA1 deficient embryonic stem cells display a decreased homologous recombination frequency and an increased frequency of non-homologous recombination that is corrected by expression of a brca1 transgene. Oncogene. 18, 7900-7907 (1999).
  12. Pierce, A. J., Hu, P., Han, M., Ellis, N., Jasin, M. Ku DNA end-binding protein modulates homologous repair of double-strand breaks in mammalian cells. Genes Dev. 15, 3237-3242 (2001).
  13. Spearman, A. D. Clinically applicable models to characterize BRCA1 and BRCA2 variants of uncertain significance. J Clin Oncol. 26, 5393-5400 (2008).
  14. Sweet, K., Senter, L., Pilarski, R., Wei, L., Toland, A. E. Characterization of BRCA1 ring finger variants of uncertain significance. Breast Cancer Res Treat. 119, 737-743 (2009).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

wyciszanie RNAiuzupe nianie plazmidowecytometria przep ywowaekspresja GFPtest I SceIkom rki HeLa DR13naprawa DNAanaliza wariant w

Powiązane artykuły