Wizualizacja supresji transkrypcyjnej w komórkach zainfekowanych wirusem

Streszczenie

Źródło: Kalveram, B. et al. Wykorzystanie chemii klikalnej do pomiaru wpływu infekcji wirusowej na syntezę RNA w komórkach gospodarza. J. Vis. Exp. (2013)

W niniejszym materiale wideo zaprezentowano wykorzystanie chemii klik (click chemistry) oraz mikroskopii fluorescencyjnej do wizualizacji transkrypcji nowo powstającego RNA w komórkach ssaków. Przedstawiono w jaki sposób infekcja wirusowa hamuje transkrypcję gospodarza, porównując sygnały fluorescencyjne w komórkach zainfekowanych i kontrolnych.

Protokół

1. Zakażenie komórek wirusem gorączki Doliny Rift (RVFV) szczepem MP-12 i znakowanie nowo powstałego RNA za pomocą 5-etynylo-urydyny (EU)

   1. Wysiać ludzkie komórki embrionalne nerki 293 (HEK293) na płytkę hodowlaną 6-dołkową w pożywce wzrostowej (pożywka Eagle'a modyfikowana przez Dulbecco (DMEM) zawierająca 10% płodowej surowicy bydlęcej, 100 U/mL penicyliny, 100 μg/mL streptomycyny). Inkubować w humidyfikowanym inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO₂ do momentu, aż komórki osiągną 80 - 100% konfluencji.
   2. Zakazić komórki szczepem MP-12 przy wielokrotności zakażenia (MOI) wynoszącej 3. Uwzględnić co najmniej dwa dołki niezakażone: jeden z nich posłuży jako kontrola niezakażona, a drugi zostanie poddany działaniu aktynomycyny D (ActD). Usunąć pożywkę wzrostową i rozcieńczyć zapas wirusa tak, aby całkowita objętość dodana do każdego dołka wynosiła 400 μL. Inkubować przez 1 h w humidyfikowanym inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO₂.
   3. Usunąć inokulum i dodać 2 mL świeżej pożywki wzrostowej na dołek. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 12 h.

   UWAGA: Jeśli protokół ten jest adaptowany do użytku z innym wirusem, zaleca się przeprowadzenie eksperymentu z przebiegiem czasowym w celu określenia optymalnego punktu czasowego dla znakowania i zbierania komórek. Należy zaplanować taki przebieg czasowy, aby czasy zakażenia były przesunięte, a wszystkie próbki mogły zostać oznakowane, zebrane i zabarwione w tym samym czasie.

   4. W 12. godzinie po zakażeniu (hpi) zastąpić pożywkę wzrostową pożywką zawierającą 0,5 mM EU. Do jednego z dołków z infekcją pozorowaną dodać również 5 μg/mL ActD. Posłuży to jako kontrola supresji transkrypcyjnej, ponieważ ActD hamuje zależną od DNA syntezę RNA. Przenieść komórki z powrotem do inkubatora.
   5. W 13. hpi przemyć komórki raz solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS) i zebrać je poprzez trypsynizację. Przemyć zebrane komórki trzy razy PBS zawierającym 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA).

   UWAGA: W tym i w kolejnych krokach nie wirować komórek z prędkością większą niż 500-1 000 x g, aby zapobiec rozrywaniu komórek. Wirować komórki przez 1-2 min w celu ich osadzenia.

   UWAGA: Jeśli po reakcji click planowane jest immunobarwienie powierzchniowe, zamiast tego zebrać komórki za pomocą gumowego policemana lub jednorazowego skrobaka do komórek.

   6. Utrwalić komórki, resuspendując je w 1 mL 4% paraformaldehydu (PFA) i inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej (RT).
   7. Przemyć raz 1 mL PBS-EDTA na dołek. Przejść niezwłocznie do kroku 2.

   UWAGA: Ważne jest, aby niezwłocznie przystąpić do reakcji click, ponieważ RNA ulega degradacji, jeśli jest przechowywane na tym etapie przez dłuższy czas. Podobnie, w przypadku przeprowadzania eksperymentu z przebiegiem czasowym, należy upewnić się, że wszystkie próbki są znakowane, utrwalane i barwione w tym samym czasie.

2. Reakcja click w celu wykrycia znakowanego RNA

   1. Zpermeabilizować komórki, dodając 1 ml 0,2% Triton X-100 w PBS. Inkubować przez 10 min w RT.

   UWAGA: Wszystkie roztwory używane w krokach od 2.1 do 2.3 muszą być wolne od nukleaz.

   2. Przemyć trzy razy 1 ml PBS na dołek.
   3. Zdjąć szkiełka nakrywkowe z płytki 12-dołkowej i przenieść je do komory wilgotnościowej. Przykryć każde szkiełko nakrywkowe 50 - 100 μl roztworu barwiącego do reakcji click (100 mM Tris pH 8,5, 1 mM CuSO₄, 20 μM fluorescencyjnego azydku [maksimum ekscytacji/emisji: 590/617 nm], 100 mM kwasu askorbinowego). Inkubować przez 1 h w RT w ciemności.

   UWAGA: Aby przygotować komorę wilgotnościową, wyłożyć dno naczynia do hodowli komórkowej lub szalki Petriego o średnicy 10 cm plastikową folią parafinową. Wyłożyć wnętrze krawędzi naczynia wilgotnymi ręcznikami papierowymi. Położyć szkiełka nakrywkowe na plastikowej folii parafinowej.

   UWAGA: Należy uważać, aby szkiełka nakrywkowe nie wyschły podczas tego ani żadnego innego kroku protokołu. Najlepiej jest dodać roztwór barwiący do każdego szkiełka nakrywkowego bezpośrednio po umieszczeniu go w komorze wilgotnościowej.

   UWAGA: Roztwór barwiący do reakcji click należy przygotować na świeżo bezpośrednio przed tym krokiem. Roztwory stokowe 1,5 M Tris pH 8,5, 100 mM CuSO₄ i 500 mM kwasu askorbinowego można przechowywać w 4 °C. Należy jednak wyrzucić każdy roztwór stokowy kwasu askorbinowego, który stał się żółty.

   UWAGA: Należy wybrać fluorofor dopasowany do filtrów w używanym mikroskopie fluorescencyjnym.

   4. Wyjąć szkiełka nakrywkowe z komory wilgotnościowej, umieścić je w nowej płytce 12-dołkowej i przemyć trzy razy 1 ml PBS na dołek.
   5. Zamontować szkiełka nakrywkowe, nakładając jedną kroplę (około 15 μl) Fluoromount-G na szkiełko mikroskopowe. Zanurzyć szkiełko nakrywkowe w H₂O, usunąć nadmiar H₂O, dotykając boku ręcznikiem papierowym, i położyć stroną z komórkami do dołu na kroplę Fluoromount-G. Suszyć na powietrzu przez 5 min.

   UWAGA: W przypadku obrazowania na mikroskopie odwróconym, należy pozwolić Fluoromount-G zestalić się w 4 °C przez noc lub przymocować szkiełka nakrywkowe do szkiełka mikroskopowego, uszczelniając krawędź przezroczystym lakierem do paznokci.

   UWAGA: Preparaty można obrazować natychmiast lub przechowywać w 4 °C w ciemności do tygodnia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
5-Ethynyl uridine	Berry Associates	PY 7563	Rozpuścić w DMSO dla otrzymania roztworu zapasu 100 mM
Okrągłe szkiełko nakrywki 12-mm	Fisherbrand	12-545-82
Aktynomycyna D (ActD)	Sigma	9415	Rozpuścić w DMSO dla otrzymania roztworu zapasu 10 mM
Mikroskop fluorescencyjny			np. Olympus IX71
CuSO₄	Sigma	C-8027	Rozpuścić w H₂O dla otrzymania roztworu zapasu 100 mM
DMEM (pożywka Eagle'a modyfikowana przez Dulbecco)	Invitrogen	11965092
FBS (płodowa surowica bydlęca)	Invitrogen	16000044
Fluorescencyjny azydek (sprzężony z Alexa Fluor 594)	Invitrogen	A10270
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
Kwas L-askorbinowy	Sigma	A-5960	Rozpuścić w H₂O dla otrzymania roztworu 500 mM
Paraformaldehyd	Sigma	158127
Penicylina-streptomycyna	Invitrogen	15140122
Triton X-100	Sigma	T-8787
Trypsyna-EDTA	Invitrogen	25200056
Trizma base	Sigma	T-1503	rozpuścić w H₂O dla otrzymania roztworu zapasu 1.5 M, pH 8.5