Analiza indukowanego przez wirusa hamowania transkrypcji komórki gospodarza z wykorzystaniem cytometrii przepływowej

Streszczenie

Źródło: Kalveram, B., et al. Wykorzystanie chemii klikalnej do pomiaru wpływu infekcji wirusowej na syntezę RNA w komórkach gospodarza. J. Vis. Exp. (2013)

Niniejszy film demonstruje wykorzystanie chemii klik oraz cytometrii przepływowej do pomiaru indukowanego przez wirusa tłumienia transkrypcji w komórkach gospodarza. Komórki ssaków są infekowane wirusem wykazującym ekspresję jądrowego białka wirulencji, które zaburza kompleks czynników transkrypcyjnych gospodarza, podczas gdy komórki kontrolne pozostają aktywne transkrypcyjnie. Wbudowanie 5-etynylo-urydyny znakuje nowo syntetyzowane mRNA, co umożliwia ilościowe określenie aktywności transkrypcyjnej w komórkach zainfekowanych i kontrolnych za pomocą podwójnej detekcji fluorescencyjnej.

Protokół

1. Zakażenie komórek szczepem MP-12 i znakowanie nowo syntetyzowanego RNA za pomocą 5-etynylo-urydyny (EU)

1. Wysiać komórki 293 do 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej w pożywce wzrostowej (DMEM zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny). Inkubować w wilgotnej inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ aż do osiągnięcia przez komórki 80 - 100% konfluencji.
2. Zainfekować komórki szczepem MP-12 przy m.o.i. wynoszącym 3. Uwzględnić co najmniej dwa dołki niezinfekowane: jeden z nich będzie służył jako kontrola niezinfekowana, a drugi zostanie poddany działaniu ActD w kroku 1.4. Usunąć pożywkę wzrostową i rozcieńczyć zapas wirusa tak, aby całkowita objętość dodana do każdego dołka wynosiła 400 μl. Inkubować przez 1 hr w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂.
3. Usunąć inokulum i dodać 2 ml świeżej pożywki wzrostowej na dołek. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 12 hr.

UWAGA: W przypadku dostosowania tego protokołu do innego wirusa zaleca się przeprowadzenie eksperymentu z analizą przebiegu czasowego w celu ustalenia optymalnego momentu znakowania i zbioru komórek. Należy zaplanować ten przebieg czasowy tak, aby czasy infekcji były przesunięte, co umożliwi jednoczesne znakowanie, zbiór i barwienie wszystkich próbek.

4. W 12 h.p.i. należy zastąpić pożywkę wzrostową pożywką zawierającą 0.5 mM EU. Do jednej z studzienek z kontrolą mock dodać również 5 μg/ml ActD. Posłuży to jako kontrola supresji transkrypcyjnej, ponieważ ActD hamuje zależną od DNA syntezę RNA. Komórki należy zwrócić do inkubatora.
5. W 13 h.p.i. komórki należy przemyć raz PBS i zebrać poprzez trypsynizację. Zebrane komórki należy przemyć trzy razy PBS zawierającym 1 mM EDTA (PBS-EDTA).

UWAGA: Podczas tego i kolejnych kroków nie wirować komórek z prędkością przekraczającą 500 - 1,000 x g, aby zapobiec ich rozpadowi. Wirować komórki przez 1-2 min w celu ich osadzenia.

UWAGA: Jeśli po reakcji click planowane jest immunobarwienie powierzchniowe, należy zamiast tego zebrać komórki za pomocą gumowego policemana lub jednorazowego skrobaka do komórek.

6. Utrwalone komórki poprzez ponowne zawieszenie ich w 1 ml 4% PFA i inkubację przez 30 min w RT.
7. Przemyć raz 1 ml PBS-EDTA na dołek. Bezzwłocznie przejść do kroku 6.

UWAGA: Ważne jest, aby niezwłocznie przystąpić do reakcji click, ponieważ RNA ulega degradacji, jeśli jest przechowywane na tym etapie przez dłuższy czas. Podobnie, w przypadku przeprowadzania eksperymentu w układzie czasowym, należy pamiętać o tym, aby oznakować, utrwalić i zabarwić wszystkie próbki w tym samym czasie.

2. Reakcja click w celu wykrycia znakowanego RNA

1. Przeprowadź permeabilizację komórek poprzez ponowne zawieszenie ich w 0,5 ml 0,2% Triton X-100 w PBS. Inkubuj przez 10 min w RT.

UWAGA: Wszystkie roztwory używane w krokach 2.1 do 2.3 muszą być wolne od nukleaz. Jeśli komórki nie sedymentują prawidłowo podczas tego etapu, należy zwiększyć czas wirowania do 5 min. Zachowanie podczas sedymentacji poprawi się po zawieszeniu komórek w buforze FACS.

2. Przemyć raz 1 ml PBS.

UWAGA: Na tym etapie nie należy stosować EDTA, ponieważ spowoduje on chelatację jonów Cu²⁺ niezbędnych do zajścia reakcji click.

3. Resuspendować komórki w 200 μl roztworu do barwienia click (100 mM Tris pH 8.5, 1 mM CuSO4, 200nM azotku znakowanego barwnikiem fluorescencyjnym [maksimum ekscytacji/emisji: 650/665 nm], 100 mM kwasu askorbinowego). Inkubować przez 1 hr w RT w ciemności.

UWAGA: Roztwór do barwienia metodą click należy przygotować świeżo bezpośrednio przed tym krokiem. Roztwory zapasowe 1,5 M Tris pH 8,5, 100 mM CuSO₄ oraz 500 mM kwasu askorbinowego można przechowywać w temperaturze 4 °C. Należy jednak zutylizować każdy roztwór zapasowy kwasu askorbinowego, który zmienił barwę na żółtą. Jeśli podczas tego kroku komórki zaczną się agregować, należy je ponownie zawiesić poprzez kilkukrotne pipetowanie. Należy upewnić się, że wybrany fluorofor może być wykryty przez używany cytometr przepływowy. Należy również przygotować jedną próbkę zainfekowanych komórek, które nie zostaną poddane procedurze barwienia metodą click; będą one niezbędne do kalibracji cytometru przepływowego. W tym celu należy wykorzystać połowę zainfekowanych komórek lub uwzględnić dodatkową studzienkę z komórkami zainfekowanymi w kroku 1.2.

Przemyć dwukrotnie buforem FACS (PBS zawierający 1 mM EDTA i 0,5% (w/v) BSA).

3. Immunofluorescencja w celu wykrycia ekspresji białek wirusowych

1. Resuspender komórki w 200 μl przeciwciała pierwszorzędowego (anty-RVFV) rozcieńczonego w buforze FACS (1:10 000) i inkubować przez 1 hr w RT w ciemności.

UWAGA: Alternatywnie krok ten można przeprowadzić przez noc (O/N) w temperaturze 4 °C w ciemności.

UWAGA: Należy przygotować również jedną próbkę niezinfekowanych komórek, które zostaną poddane procedurze barwienia typu click, ale nie zostaną poddane immunobarwieniu; będą one potrzebne do kalibracji cytometru przepływowego. W tym celu należy wykorzystać połowę komórek z grupy mock lub dodać dodatkową studniczkę z niezinfekowanymi komórkami w kroku 1.2.

UWAGA: Adaptując ten protokół do użycia z innym wirusem, należy w pierwszej kolejności określić optymalne rozcieńczenie przeciwciała pierwszorzędowego.

2. Przemyć komórki dwukrotnie w buforze FACS.
3. Resuspendować komórki w 200 μl przeciwciała wtórnego (anty-mysie IgG koniugowane z barwnikiem fluorescencyjnym [maksimum ekscytacji/emisji: 495/519 nm]) rozcieńczonego w buforze FACS (1:1 000) i inkubować przez 1 hr w RT w ciemności.
4. Przemyć komórki raz w buforze FACS.

UWAGA: Na tym etapie komórki można przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C w ciemności.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
5-ethynyl-uridine	Berry Associates	PY 7563	rozpuścić w DMSO do uzyskania stężenia zapasu 100 mM
okrągłe szkiełka podstawowe 12 mm	Fisherbrand	12-545-82
probówki polistyrenowe 5 ml	BD Biosciences	352058
Aktynomycyna D (ActD)	Sigma	9415	rozpuścić w DMSO do uzyskania stężenia zapasu 10 mM
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG	Invitrogen	A-11029
Albuminy surowicy bydlęcej (BSA)	Santa Cruz	sc-2323
CuSO₄	Sigma	C-8027	rozpuścić w H2O do uzyskania stężenia zapasu 100 mM
DAPI	Sigma	D-9542	rozpuścić w H2O do uzyskania stężenia zapasu 5 mg/ml
DMEM	Invitrogen	11965092
FBS	Invitrogen	16000044
azyd fluoryzujący (sprzężony z Alexa Fluor 594)	Invitrogen	A10270
azyd fluoryzujący (sprzężony z Alexa Fluor 657)	Invitrogen	A10277
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
L-kwas askorbinowy	Sigma	A-5960	rozpuścić w H2O do 500 mM
filtr papierowy	VWRbrand	28333-087
paraformaldehyd	Sigma	158127
Penicylina-Streptomycyna	Invitrogen	15140122
poli-L-lizyna (MW ≥ 70000)	Sigma	P1274
Triton X-100	Sigma	T-8787
Trizma base	Sigma	T-1503	rozpuścić w H2O do uzyskania stężenia zapasu 1,5 M, pH 8,5
Trypsyna-EDTA	Invitrogen	25200056
Mikroskop fluorescencyjny			np. Olympus IX71
Cytometr przepływowy			np. BD Biosciences LSRII Fortessa