Generowanie rekombinowanego wirusa RSV z tagiem GFP z wykorzystaniem systemu ekspresyjnego T7

Streszczenie

Źródło: Bouillier, C. i wsp., amplifikacja i miareczkowanie rekombinowanych wirusów RSV (wirusa syncytialnego układu oddechowego). J. Vis. Exp. (2019)

W niniejszym filmie zaprezentowano generowanie rekombinowanego wirusa RSV (respiratory syncytial virus) wykazującego ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) przy użyciu systemu genetyki odwrotnej opartego na polimerazie T7. Współtransfekcja plazmidów kodujących białka wirusowe oraz genomu z tagiem GFP prowadzi do ekspresji białek i inicjuje procesy rescue wirusa.

Protokół

1. Odzyskiwanie i pierwsze pasażowanie wirusa rekombinowanego

UWAGA: Wszystkie poniższe kroki należy przeprowadzić w sterylnym środowisku, korzystając z komory bezpieczeństwa biologicznego klasy II.

1. Dzień przed transfekcją przygotować zawiesinę linii komórkowej BSRT7/5 o stężeniu 5 x 10⁵ komórek/mL w pożywce kompletnej. Rozdzielić 2 mL zawiesiny komórkowej na każdy dołek w płytce 6-dołkowej. Przygotować jeden dołek dla każdego wirusa przeznaczonego do odzyskania oraz jeden dodatkowy dołek jako kontrolę negatywną. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C i przy 5% CO₂. Następnego dnia sprawdzić, czy komórki osiągnęły 80%–90% konfluencji.
2. Rozmrozić wektory genetyki odwrotnej wirusa RSV (respiratory syncytial virus) p-RSV-GFP i p-RSV-M2-1-GFP, a także p-N, p-P, p-L i p-M2-1. Dla każdego wirusa do odzyskania zmieszać w probówce 1 µg p-N i p-P, 0,5 µg p-L, 0,25 µg p-M2-1 oraz 1,25 µg p-RSV (GFP lub M2-1 GFP).
   UWAGA: Można zastosować inne wektory ekspresyjne dla białek wirusowych kompleksu polimerazy (N, P, L i M2-1); należy jednak zachować stosunek ilości tych białek. Kontrolę negatywną przeprowadzić, zastępując wektor p-RSV wektorem pustym.
3. Przejść do transfekcji (patrz Tabela materiałów).
   1. Do zmieszanych wektorów dodać 250 µL pożywki z obniżoną zawartością surowicy. W osobnej probówce rozcieńczyć 10 µL odczynnika do transfekcji w 250 µL pożywki z obniżoną zawartością surowicy. Delikatnie wymieszać obie probówki w wortexie i odczekać 5 min. Połączyć zawartość obu probówek i inkubować przez 20 min w temperaturze pokojowej.
   2. Przepłukać komórki BSRT7/5 za pomocą 1 mL pożywki z obniżoną zawartością surowicy i rozdzielić 1,5 mL Minimal Essential Medium (MEM) z 10% płodową surowicą cielęcą (FCS) bez antybiotyków na każdy dołek. W razie potrzeby inkubować w 37 °C i 5% CO₂ do czasu zakończenia inkubacji opisanej w kroku 1.3.1.
   3. Po upływie 20 min czasu inkubacji dodać 500 µL mieszaniny do transfekcji przygotowanej w kroku 1.3.1 do dołka. Umieścić komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO₂ na 3 dni. Nie zmieniać pożywki hodowlanej komórek podczas transfekcji.
4. Obserwować fluorescencję zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) (wzbudzanie przy 488 nm i emisja przy 515–535 nm) pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym przy powiększeniu 20x raz dziennie, używając filtra GFP, aby monitorować wydajność odzyskiwania wirusa.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
BSRT7/5		niedostępne w handlu	Patrz referencja 22. Buchholz et al. 1999
Mikroskop fluorescencyjny do obserwacji	Olympus	IX73 Olympus microscope
Mikroskop fluorescencyjny do wideomikroskopii	Olympus	ScanR Olympus microscope
HEp-2	ATCC	ATCC CCL-23
HEPES ≥99,5%	Sigma	H3375
L-Glutamina (200 mM)	ThermoFisher Scientific	25030024
Odczynnik Lipofactamine 2000	ThermoFisher Scientific	11668019	Protokół w kroku 2.3. jest zoptymalizowany dla tego odczynnika.
MEM (10x), bez glutaminy	ThermoFisher Scientific	11430030
MEM, suplement GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	41090-028
MgSO4 ReagentPlus, ≥99,5%	Sigma	M7506
Opti-MEM I medium o zredukowanej zawartości surowicy	ThermoFisher Scientific	51985-026
Plazmidy		niedostępne w handlu	Patrz referencja 21. Rameix-Welti et al. 2014