Test miareczkowania płytek do ilościowego oznaczenia zakaźnego wirusa RSV (wirusa syncjialnego układu oddechowego)

Streszczenie

Źródło: Bouillier, C., et al. Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses. J. Vis. Exp. (2019)

W materiale wideo zaprezentowano metodę miareczkowania płytek wykorzystywaną do ilościowego oznaczenia zakaźnych rekombinantnych wirusów RSV (wirus syncytialny układu oddechowego) w monowarstwach komórek nabłonkowych. Przedstawiono proces zakażania komórek gospodarza seryjnie rozcieńczonymi zawiesinami wirusowymi, ograniczenie rozprzestrzeniania się wirusa za pomocą półstałej nakładki na bazie celulozy oraz powstawanie miejscowych płytek w wyniku efektów cytopatycznych. Procedurę kończy barwienie, dekontaminacja i liczenie płytek w celu oznaczenia miana wirusa oraz oceny zakaźności RSV.

Protokół

1. Test miareczkowania płytek

1. Przygotować płytki 12-dołkowe do mianowania w dniu poprzedzającym wykonanie testu mianowania (do zmianowania jednej probówki z wirusem wymagane będą sześć dołków). Do dołków nanieść po 1 ml komórek nabłonkowych człowieka typu 2 (HEp-2) w stężeniu 5 × 10⁵ komórek/ml w medium kompletnym.
2. Następnego dnia przygotować sterylną zawiesinę celulozy mikrokrystalicznej (2,4% [m/v] w wodzie) (patrz Tabela materiałów).
   1. Dyspergować 2,4 g proszku celulozy mikrokrystalicznej w 100 ml wody destylowanej, używając standardowego mieszadła magnetycznego, aż do całkowitego rozpuszczenia proszku (zazwyczaj 4–12 h). Autoklawować zawiesinę w 121 °C przez 20 min, a następnie przechowywać w temperaturze pokojowej do momentu użycia.
      UWAGA: W takich warunkach zawiesina jest stabilna przez 1 rok.
   2. Po otwarciu roztworu w warunkach sterylnych należy go przechowywać w temperaturze 4 °C przez 6 miesięcy. Przed każdym użyciem należy zawsze wymieszać zawiesinę (poprzez wstrząsanie ręczne lub w vorteksie), aby upewnić się, że jest jednorodna.
3. Przygotuj 2× minimalne medium niezbędne (MEM) w warunkach sterylnych. Rozcieńczyć komercyjne MEM 10× wodą sterylną, a następnie dodać L-glutaminę, 1000 jednostek/ml penicyliny oraz 1 mg/ml streptomycyny. Energicznie wstrząsnąć rozcieńczeniem i przechowywać w 4 °C.
   UWAGA: Kroki 1.4–1.10 należy wykonać w środowisku sterylnym, korzystając z komory bezpieczeństwa klasy II.
4. Przygotować sześć probówek zawierających 900 µL MEM bez płodowej surowicy cielęcej (FCS) na każdy wirus do miareczkowania (probówki do miareczkowania). Rozmrozić alikwoty wirusa, energicznie wymieszać w wstrząsarce wirówkowej (vortex) przez 5 s i przenieść 100 µL do pierwszej probówki do miareczkowania.
5. Wykonaj dziesięciokrotne rozcieńczenie 6×, w następujący sposób. Dodać 100 μL wirusa do 900 μL pożywki do pierwszej probówki, zakręć probówkę i wymieszaj jej zawartość, wstrząsając w wiertaku (vortexerze) przez kilka sekund. Wymień końcówkę pipety i dodaj 100 µL pierwszego rozcieńczenia do 900 µL do drugiej probówki, zakręć probówkę i wymieszaj na wirówce typu vortex. Powtórz tę procedurę aż do szóstej probówki.
   UWAGA: Bardzo ważne jest zmienianie końcówki przy każdym rozcieńczeniu.
6. Na płytkach 12-dołkowych z komórkami HEp-2 zapisz nazwę wirusa oraz stopień rozcieńczeń. Zaznacz płytkę i jej pokrywę w sposób umożliwiający ich dopasowanie, ponieważ mogą zostać rozdzielone podczas barwienia (krok 1.9). Usuń z płytek pożywkę i rozdziel 400 µL po jednym rozcieńczeniu na dołek. Inkubować płytki w 37 °C przez 2 h, w celu adsorpcji wirusa.
   UWAGA: Wymień końcówkę pipety po każdym szczepieniu lub użyj tej samej końcówki, przechodząc od najniższego do najwyższego stężenia. Szczep ograniczoną liczbę płytek (od 1 do 2) jednocześnie, aby zapobiec wysychaniu komórek.
7. Przygotować nakładkę z celulozy mikrokrystalicznej podczas adsorpcji wirusa (przygotowanie doraźne). Aby uzyskać 100 ml nakładki, zmieszać 10 ml 2,4% zawiesiny celulozy mikrokrystalicznej, 10 ml 2× MEM oraz 80 ml MEM z 2% FCS.
   1. Dostosuj pH 2× doprowadzić pH MEM do około 7,2 za pomocą sterylnego 7,5% roztworu wodorowęglanu sodu, kierując się wskaźnikiem barwnym. Dodać zawiesinę celulozy mikrokrystalicznej oraz MEM, a następnie intensywnie wymieszać.
8. Po zakończeniu 2-godzinnej inkubacji do każdej studzienki płytek 12-dołkowych należy dodać od 2 do 3 ml warstwy overlay, nie usuwając wcześniej inokulum. Należy zachować ostrożność, aby uniknąć zanieczyszczenia sąsiednich studninek inokulum o wysokim mianie wirusa. Płytkę inkubować w 37 °C oraz 5% CO2₂ przez 6 dni. Podczas inkubacji nie wolno przesuwać płytki ani inkubatora.
9. Należy przystąpić do barwienia komórek, używając roztworu fioletu krystalicznego (8% fioletu krystalicznego [v/v], 2% formaldehydu [v/v] i 20% etanolu [v/v] w wodzie).
   1. Wyłożyć powierzchnię roboczą komory bezpieczeństwa biologicznego arkuszem ochronnym (fiolet krystaliczny silnie barwi powierzchnie).
   2. Delikatnie wstrząśnij płytkami, aby usunąć warstwę półpłynną z celulozy mikrokrystalicznej. Odlej nadsącz i przemyj komórki 2× z 1× roztwór soli fizjologicznej z buforowanym fosforanem (PBS). Płytki należy przetwarzać pojedynczo, aby zapobiec wysychaniu komórek. Należy dodać 1–2 ml roztworu fioletu krystalicznego i odczekać 10–15 min. Następnie należy usunąć roztwór, który może zostać ponownie wykorzystany do barwienia kolejnych płytek.
   3. Zanurz płytki wraz z pokrywkami w świeżym roztworze wybielacza na kilka sekund, a następnie dokładnie wypłucz je wodą z kranu. Należy pamiętać, że płytki i pokrywki zostają odkażone za pomocą wybielacza.
   4. Połóż płytki i pokrywki na ręcznikach papierowych i pozostaw do wyschnięcia. Po płukaniu wodą susz płytki w temperaturze otoczenia, a następnie przechowuj je w temperaturze pokojowej. W przypadku długotrwałego przechowywania (przez wiele miesięcy) należy chronić płytki przed światłem, aby zapobiec odbarwieniu. Należy pamiętać, że jeśli komórki stracą kolor, można je ponownie zbarwić fioletem krystalicznym.
10. Obliczyć miana wirusa. Policzyć plaque w studzienkach na wysuszonych płytkach, które są widoczne gołym okiem. Sprawdzić, czy liczba plaque dla poszczególnych rozcieńczeń jest spójna (czynnik 10 między każdym rozcieńczeniem). Wybrać studzienkę, w której plaque są najłatwiejsze do policzenia. Określić liczbę plaque w stosunku do objętości inokulum i stopnia rozcieńczenia.
    UWAGA: Na przykładzie przedstawionym w Rycina 1, policzono 21 placków przy rozcieńczeniu 10^-5 rozcieńczenie. Odpowiada to mianowi wynoszącemu

Wyniki

Rysunek 1: Oznaczanie miana RSV za pomocą metody plackowej. (A) Wyniki testu miareczkowania plackowego na płytce 12-dołkowej. Przedstawiono sześć dołków zainfekowanych rozcieńczeniami seryjnymi jednego stoku wirusa. Rozcieńczenia są podane w logarytmie dziesiętnym. Komórki zainfekowane trzema pierwszymi rozcieńczeniami uległy całkowitemu odłączeniu. Liczba placków zaobserwowana przy rozcieńczeniach 10^-4, 10^-5 i 10^-6 jest spójna. (B) Ilustracja enumeracji placków (żółte cyfry). Zielona gwiazdka wskazuje zarysowania warstwy komórkowej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Roztwór fioletu krystalicznego	Sigma	HT90132
HEp-2	ATCC	ATCC CCL-23
MEM (10x), bez glutaminy	ThermoFisher Scientific	11430030
MEM, suplement GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	41090-028
Roztwór wodorowęglanu sodu 7.5%	ThermoFisher Scientific	25080094
Penicylina-Streptomycyna (10,000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15140122