Ocena zdolności replikacyjnej wirusa za pomocą radioznakowanego testu odwrotnej transkryptazy

Streszczenie

Źródło: Claiborne, D. T. et al. A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses. J. Vis. Exp. (2014)

Niniejszy film prezentuje ocenę zdolności replikacyjnej wirusa z wykorzystaniem radioznakowanego testu odwrotnej transkryptazy. Nadnadczynki hodowlane zawierające wiriony potomne dodaje się do mieszaniny odwrotnej transkrypcji zawierającej radioznakowany nukleotyd. Wbudowany sygnał odzwierciedla ilość wytworzonych wirusów oraz wydajność replikacji. Do wykrywania i porównywania sygnałów między próbkami testowymi a próbkami typu dzikiego wykorzystuje się obrazowanie fosforymetryczne.

Protokół

1. Analiza odwrotnej transkryptazy (RT) w supernatantach hodowli komórkowych

1. Przygotować dygestorium biologiczne w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa 3 (BSL-3) do pracy z materiałami radioaktywnymi.
   1. Wyłożyć dygestorium papierem chłonnym i zastąpić aspirator takim, który jest przeznaczony do użytku z materiałami radioaktywnymi. 
      UWAGA: Wszystkie odpady radioaktywne muszą zostać zutylizowane zgodnie z przepisami bezpieczeństwa.
2. Do każdej 1 ml alikwoty master mixu do RT dodać 1-2 µl [α-³³P]deoksytymidynotrifosforanu (dTTP) o stężeniu 10 mCi/ml oraz 4 µl 1 M ditiotreitolu (DTT) (patrz tabela 1).
3. Każdą probówkę mikrocentryfugową o pojemności 1,5 ml zawierającą master mix do RT, DTT i [α-³³P] dTTP ostrożnie wymieszać za pomocą pipety 1 000 µl, a następnie przenieść do sterylnej korytka.
4. Do każdego dołka 96-dołkowej cienkościennej płytki do reakcji polimerazy łańcuchowej (PCR) nanieść 25 µl znakowanej mieszaniny RT. 
   UWAGA: Należy przewidzieć miejsce na kontrolę pozytywną (zakażenie szczepem dzikim (WT) MJ4) oraz kontrolę negatywną (zakażenie pozorowane, Mock).
5. Do płytki PCR zawierającej master mix do RT dodać po 5 µl każdego supernatantu.
6. Płytkę PCR szczelnie zamknąć pokrywą z folii samoprzylepnej i inkubować przez 2 h w temperaturze 37 °C w termocyklerze. Ze względów bezpieczeństwa końcówki pipet należy wypłukać preparatem Amphyl i wyrzucić do małego pojemnika na odpady Amphyl, który zostanie później zutylizowany jako odpad radioaktywny.
7. Po inkubacji wykonać niewielkie otwory w pokrywie z folii za pomocą wielokanałowej pipety 200 µl. 
   UWAGA: Jeśli końcówki pipety dotkną cieczy w dołku, należy je wymienić przed przejściem do następnej kolumny lub rzędu.
8. Próbki wymieszać 5 razy i przenieść po 5 µl każdej z nich na papier DE-81. Suszyć na powietrzu przez 10 min.
9. Bloty przemyć 5 razy 1x roztworem SSC (saline-sodium citrate), a następnie 2 razy 90% etanolem (czas każdego przemywania: 5 min). Pozostawić do wyschnięcia na powietrzu.
   1. Każdy blot umieścić w osobnym pojemniku do przemywania, np. w pudełku do przechowywania typu sandwich, dodać odpowiednią ilość buforu do przemywania (1x SSC lub 90% etanolu (EtOH)), aby przykryć blot, i mieszać przez 5 min.
   2. Odlać bufor do przemywania do osobnego pojemnika i powtórzyć czynność. UWAGA: Pierwsze 3 przemycia są uznawane za radioaktywne i powinny zostać zutylizowane w odpowiedni sposób. Ostatnie 2 przemycia można zutylizować w sposób standardowy.
10. Po wyschnięciu ostrożnie owinąć blot folią Saran i naświetlać na ekranie fosforowym w szczelnie zamkniętej kasecie przez noc w temperaturze pokojowej.
11. Analizować ekrany fosforowe za pomocą fosforyobrazera i określić ilość radioaktywnych transkryptów.
12. Obrysować okręgiem każdy sygnał radioaktywny przy użyciu oprogramowania OptiQuant. Wykreślić wartości DLU (Digital Light Unit), aby wygenerować krzywe replikacji.
13. W celu wyznaczenia wyników zdolności replikacyjnej, wartości DLU poddano transformacji log₁₀, a nachylenia obliczono dla punktów czasowych: dzień 2, 4 i 6. Następnie nachylenia replikacji podzielono przez nachylenie dla WT MJ4, aby uzyskać wyniki zdolności replikacyjnej. Ważne jest przeprowadzenie normalizacji w oparciu o wartości MJ4 WT uzyskane z tej samej płytki RT, aby zmniejszyć zmienność wewnątrzanalizową.

Tabela 1: Skład mieszaniny głównej (master mix) do radioznaczonego testu odwrotnej transkryptazy.
UWAGA: Przechowywać w aliquotach po 1 ml w temperaturze -20 °C.

Odczynnik	Objętość (ml)
H2O wolna od nukleaz2O	419.5
Tris-Cl, pH 7,8 (1 M)	30
Chlorek potasu (1 M)	37.5
Chlorek magnezu (1 M)	2.5
Nonidet P-40 (10%)	5
EDTA (0,5 M)	1.02
Kwas poliadenylowy, sól potasowa (2 mg/ml)	1.25
starter oligo-dT (25 μg/ml)	3.25
Objętość całkowita	500

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynniki do hodowli komórkowych
Środek czyszczący/dezynfekujący Amphyl	Fisher	22-030-394
Kuwety do pipet wielokanałowych, 55 ml	Fisher	13-681-501
1 M roztwór chlorku magnezu	Sigma-Aldrich	M1028-100ML
Odczynniki do testu ilościowego odwrotnej transkryptazy
dTTP, [α-³³P]- 3000 Ci/mmol, 10 mCi/ml, 1 mCi	Perkin-Elmer	NEG605H001MC
1 M Tris-Cl, pH 8.0	Life Technologies/Invitrogen	15568025	Wymagana korekta pH do 7,8 za pomocą KOH
2 M chlorek potasu (KCl)	Life Technologies/Invitrogen	AM9640G	Rozcieńczyć do roztworu 1 M
0.5 M EDTA	Life Technologies/Invitrogen	15575-020
Nonidet P40	Roche	11333941103
Kwas poliadenylowy (Poly rA), sól potasowa	Midland Reagent Co.	P-3001
Starter Oligo d(T)	Life Technologies/Invitrogen	18418-012
Ditiotreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	43815-1G
SR, ekran fosforowy o wysokiej rozdzielczości, mały	Perkin-Elmer	7001485
Płytka 96-dołkowa Corning Costar Thermowell model (M) poliwęglanowa	Fisher	07-200-245	Wyprodukowano przez Corning Life
Aluminiowa taśma uszczelniająca do mikropłytek 96-dołkowych Corning, niesterylna	Fisher	07-200-684	Wyprodukowano przez Corning Life
Papier do wymiany anionowej DE-81	Whatman	3658-915
Cytrynian trisodu dwuwodny	Sigma-Aldrich	S1804-1KG
Chlorek sodu	Fisher	S671-3
Kaseta do autoradiografii	Fisher	FB-CA-810
Ekran fosforowy do przechowywania Cyclone	Packard
Termocykler, PTC-200	MJ Research