Przygotowanie próbek do ilościowego oznaczania wirusa metodą opartą na lucyferazie

Streszczenie

Źródło: Garcia, V., et al. High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses. J. Vis. Exp. (91), e51890, doi:10.3791/51890 (2014).

W niniejszym filmie zaprezentowano przygotowanie próbek hodowli komórkowych do oceny ładunku wirusowego z wykorzystaniem testu opartego na lucyferazie. Przedstawiono proces zakażania komórek nabłonkowych genetycznie zmodyfikowanym wirusem, przenoszenia nadnadkresów wirusowych i standardów do dołków testowych oraz wspomagania wnikania wirusa poprzez wirowanie i inkubację. Ekspresja lucyferazy służy jako marker, umożliwiając kwantyfikację stężenia wirusa na podstawie sygnału luminescencyjnego.

Protokół

1. Przygotowanie próbek

1. Należy pozyskać próbki zawierające wirusa wykazującego ekspresję lucyferazy (w tym przypadku jako przykład VSV∆51-Fluc) do miareczkowania i przenieść je do płytek 96-dołkowych. Alternatywnie można przeprowadzić infekcje w 96-dołkowych płytkach do hodowli tkankowej i bezpośrednio wykorzystać nadnadkładowe.
2. Dwie kolumny należy pozostawić niepoddane działaniu czynnika w celu wprowadzenia krzywych wzorcowych. W przypadku eksperymentów przeprowadzanych bezpośrednio w płytkach 96-dołkowych miareczkowanie wykonuje się na koniec eksperymentu (40 hr po infekcji) lub przechowuje próbki w temperaturze -80 °C i miareczkuje w późniejszym terminie.

2. Przygotowanie komórek permissywnych do miareczkowania wirusa

1. Na 24 hr przed miareczkowaniem przygotować zawiesinę komórek Vero o stężeniu 2,5 x 10⁵ cells/ml w zmodyfikowanym podłożu Eagle'a z dodatkiem Dulbecco (DMEM) zawierającym 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 30 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES) oraz 1% penicyliny/streptomycyny. 
   UWAGA: Choć w tym protokole wykorzystano komórki Vero, można użyć dowolnej odpowiedniej linii komórek permissywnych dla infekcji wirusem zapalenia jam ustnych i języka (VSV).
2. Zasiać 2,5 x 10⁴ komórek (100 μl) na białe, pełne płytki 96-dołkowe o płaskim dnie, używając dystrybutora do mikropłytek.
   1. Przygotować 12 ml zawiesiny komórkowej na płytkę, plus dodatkowe 5 ml do zaprawowania układu.
   2. Wyczyścić kasetę dystrybutora do mikropłytek, przepłukując przewody 50 ml sterylnej wody.
   3. Napełnić linie dystrybutora do mikropłytek zawiesiną komórkową i pozwolić na przepływ 5 ml zawiesiny.
   4. Wybrać program, który rozda 100 μl do każdego dołka białej płytki 96-dołkowej. Wykonać rozlew i powtórzyć w razie potrzeby dla kolejnych płytek. Jeśli używane są płytki z białymi ściankami i nieprzezroczystym dnem, zasiać również kilka dołków na przezroczystej płytce 96-dołkowej o płaskim dnie w celu weryfikacji stanu i gęstości komórek.
   5. Po zakończeniu przepłukać komórki z powrotem do oryginalnego pojemnika. Wyczyścić kasetę, przepuszczając przez przewody 50 ml 70% etanolu, a następnie 50 ml ciepłej sterylnej wody.
   6. Upewnić się, że kaseta i przewody są odpowiednio czyszczone pomiędzy kolejnymi użyciami.
3. Inkubować komórki przez 24 hr w temperaturze 37 °C w humidyfikowanym inkubatorze z 5% CO₂.

3. Przygotowanie krzywej standardowej wirusa

1. Przygotować krzywą standardową VSV∆51-Fluc w bezserumowym DMEM w taki sposób, aby końcowe stężenie jednostek tworzących plaques (pfu) na ml po przeniesieniu na komórki Vero wynosiło odpowiednio: 10⁸ pfu/ml, 10⁷ pfu/ml, 10⁶ pfu/ml, 10⁵ pfu/ml, 10⁴ pfu/ml, 10³ pfu/ml, 10² pfu/ml oraz 10¹ pfu/ml. Przygotować 50 μl każdego stężenia na jedną płytkę z komórkami Vero oraz dodatkowe 10%.
   UWAGA: Miano zapasu wirusa z lucyferazą musi zostać ocenione w sposób klasyczny, aby wygenerować krzywą standardową umożliwiającą ilościowe oznaczenie bezwzględne. W przeciwnym razie ilościowe oznaczenie względne można przeprowadzić bez dokładnych informacji o mianie, dowolnie ustalając miano wirusa na podstawie stopni rozcieńczenia. Na przykład pierwsze rozcieńczenie krzywej standardowej można ustalić na 10⁸ jednostek wirusowych, a kolejne rozcieńczenie 1/10 na 10⁷ i tak dalej. W takim przypadku wartości należy wyrazić jako krotność zmiany (fold-change) w stosunku do określonej próbki, ponieważ ilościowe oznaczenie bezwzględne nie będzie dokładne.

4. Przeniesienie nadnadnadkładów z próbek na komórki podatne

1. Sprawdzić komórki Vero wysiane na płytce 96-dołkowej z przezroczystym dnem pod mikroskopem świetlnym, aby potwierdzić, że monowarstwy osiągnęły co najmniej 95% konfluencji.
2. Przenieść 25 μl supernatantu z próbki na komórki Vero wysiane na płytkach z białymi ściankami. Nie przenosić supernatantów do 2 kolumn przeznaczonych na krzywe standardowe. 
   UWAGA: Można to wykonać jednocześnie dla wszystkich dołków na jednej płytce, korzystając z 96-kanałowego automatycznego dozownika cieczy.
3. Używając 8- lub 12-kanałowej pipety wielokanałowej, dodać 25 μl każdego rozcieńczenia krzywej standardowej przygotowanej w kroku 3 do komórek Vero w 2 wyznaczonych kolumnach.
4. Wirować płytki przez 5 min przy 430 x g w temperaturze pokojowej (RT).
5. Inkubować przez 5 hr przy 37 °C w humidyfikowanym inkubatorze z 5% CO₂.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dulbeccos' Modified Eagle's Medium (DMEM)	Corning	SH30243.01
Surowica cielęca płodowa	NorthBio Inc.	NBSF-701
Fosforanowy bufor solny	Corning	21-040-CV
HEPES	Fisher Scientific	BP310-1	Przygotować roztwór 1 mM, pH 7,3
Białe polistyrenowe mikropłytki 96-dołkowe o płaskim dnie, traktowane TC	Corning	3917	Do zwiększenia przepustowości można również stosować płytki 384-dołkowe
Synergy Mx	BioTek	SMTBL	Czytnik mikropłytek z monochromatorem
Liquidator96	Mettler Toledo	LIQ-96-200	Ręczny system pipetujący z 96 końcówkami
Końcówki Liquidator96 LTS sterylizowane z filtrami	Mettler Toledo	LQR-200F	Odpowiednie są wszelkie sterylne końcówki z filtrem kompatybilne z wybranymi pipetami
Microflo	BioTek	111-206-21	Stosowany do wysiewu komórek na płytkę 96-dołkową
Fluoroskan Ascent FL	Thermo Scientific	5210450	Fluorometr do mikropłytek