Infekcja mysich embrionalnych komórek macierzystych (mESC) lentiwirusem Hodować mESC przystosowane do testu chromatin in vivo (CiA) o niskim numerze pasażu (poniżej pasażu 35), bez wykorzystania komórek karmionkowych, w pożywce bazowej DMEM (Dulbecco's Modified Eagle medium) z wysoką zawartością glukozy, uzupełnionej o 20% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) klasy ESC, 10 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES), 1x nieessentialne aminokwasy (NEAA), penicylinę/streptomycynę, 2-merkaptoetanol oraz czynnik hamujący białaczkę (LIF) w rozcieńczeniu 1:500, w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2. UWAGA: LIF uzyskuje się z nadsączu komórek Cos produkujących Lif-1C-alpha (COS LIF), które są zbierane partiami i mrożone w temperaturze -80 °C. Hodować komórki na płytkach, które uprzednio inkubowano przez 1–3 h z 0,1% żelatyną w 1x fosforanie buforowanym solą (PBS), a następnie przemyto 1x PBS. Karmić komórki codziennie i pasażować co 2–3 dni, w zależności od ich gęstości. UWAGA: Morfologicznie kolonie embrionalnych komórek macierzystych (ES) powinny być małe, okrągłe i wyraźnie oddzielone od siebie. Przesiać mESC do płytki 12-dołkowej (100 000 komórek/dołek) na jeden dzień przed infekcją. Policzyć komórki za pomocą hemocytometru. W przypadku komórek hodowanych w formacie 10-cm, odessać starą pożywkę, dodać 5 ml 1x PBS, odessać PBS i dodać 1 ml 0,25% trypsyny. Inkubować komórki w trypsynie przez 8 min w temperaturze 37 °C, kołysząc i opukując płytkę w połowie czasu inkubacji. Celem tego etapu jest uzyskanie zawiesiny pojedynczych komórek. Po 48 h od wymiany pożywki w hodowli ludzkich komórek embrionalnych nerki (HEK) 293T na płytce 15-cm, zebrać nadsącz i przenieść go do probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Wirować nadsącz z prędkością 300 x g przez 5 min w celu odwirowania szczątków komórkowych. Przefiltrować nadsącz przez membranę o porach 0,45 µm. UWAGA: Należy używać membran z octanu celulozy bez surfaktantów (SFCA), ponieważ inne materiały mogą zatrzymywać wirusa, co znacząco obniża wydajność. Skoncentrować wirusa metodą ultrawirowania, używając wirówki z rotorem SW32; wirować z prędkością 20 000 rpm (~72 000 x g) przez 2,5 h w temperaturze 4 °C. Podczas koncentracji wirusa w ultrawirowarce, potraktować CiA mESC w płytce 12-dołkowej świeżą pożywką ES zawierającą 5 µg/ml polybrene. Po zakończeniu koncentracji wirusa ostrożnie odessać nadsącz i zawiesić pellet wirusowy w 100 µl 1x PBS (unikając powstawania nadmiernych pęcherzyków powietrza). Przenieść wirusa i 1x PBS do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Wymieszać w wirówce typu vortex lub wstrząsnąć przy 300 x g (lub na najniższym ustawieniu), aby w pełni zawiesić wirusa. Odwirować probówkę w mini-wirówce laboratoryjnej przez 5–10 s, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Do każdego dołka płytki 12-dołkowej dodać 30 µl wirusa. Zakręcić płytką, a następnie wirować ją z prędkością 1 000 x g przez 20 min. UWAGA: Ilość dodawanego wirusa może być zmienna w zależności od miana wirusa, które jest odwrotnie proporcjonalne do wielkości konstruktu dostarczanego. Alternatywnie można zamrozić wirusa gwałtownie w ciekłym azocie i przechowywać go w temperaturze -80 °C. Należy jednak pamiętać, że mrożenie obniża miano wirusa. Umieścić płytkę 12-dołkową z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C, a następnego ranka (~16 h później) wymienić pożywkę na świeżą pożywkę ES. Po 48 h od infekcji wyselekcjonować komórki, w których zintegrowano plazmid wirusowy, dodając odpowiedni antybiotyk (np. 1,5 µg/ml puromycyny, 10 µg/ml blastycydyny itp.). Wymieniać pożywkę codziennie i przemywać komórki 1x PBS, jeśli większość z nich unosi się w pożywce lub jest martwa. Utrzymywać komórki w pożywce selekcyjnej przez 72–96 h w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2. Chiarella, A. M. i współpr. Represja transkrypcji genów poprzez przekierowanie aparatu komórkowego za pomocą chemicznych modyfikatorów epigenetycznych. J. Vis. Exp. (2018)
W niniejszym filmie zaprezentowano metodę generowania genetycznie zmodyfikowanych mysich embrionalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem transdukcji lentiwirusem. Cząsteczki lentiwirusa dostarczają marker oporności na antybiotyk, co umożliwia stabilną integrację genomową i selekcję komórek transdukowanych.
