Identyfikacja komórek zainfekowanych rekombinowanym wirusem ospy prawdziwej z wykorzystaniem selekcji metabolicznej i fluorescencyjnej

Streszczenie

Generowanie wirusa rekombinowanego Zgodnie z Rysunkiem 1, zainfekuj monowarstwę komórek BS-C-1 [Buffalo Subclone C-1 (linia nabłonkowa nerek małpy pochodna komórek CV-1)] wirusem ospy prawdziwej (vaccinia virus) w medium bezsurowiczym przy wielokrotności infekcji (MOI) > 1. Godzinę po infekcji odzyskaj komórki za pomocą podłoża DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) i przeprowadź transfekcję mieszaniną plazmidu wektora rekombinacyjnego oraz odczynnika do transfekcji w stosunku 3:1 w medium bezsurowiczym. Po 24 godzinach zeskrob i odzyskaj komórki w podłożu DMEM niezawierającym płodowej surowicy bydlęcej (FBS), a następnie przeprowadź trzy cykle zamrażania i rozmrażania, aby rozbić komórki i uwolnić cząstki wirusa. Przeprowadź test plackowy z płynną warstwą nakładkową z DMEM z 10% FBS oraz odczynnikami selekcyjnymi GPT (guaninofosforibozylotransferaza z E. coli): kwasem mykofenolowym (25 µg/ml) i ksantyną (250 µg/ml) w następujący sposób: 1. Wysiej monowarstwę komórek BS-C-1 na płytkę 6-dołkową. 2. Zainfekuj w pełni skonfluowane monowarstwy komórkowe rozcieńczeniami seryjnymi zamrażanych i rozmrażanych komórek zawierających cząstki wirusa, aby zapewnić odpowiednią separację poszczególnych placków. 3. Nałóż płynną warstwę DMEM z 10% FBS zawierającą odczynniki selekcyjne GPT – kwas mykofenolowy i ksantynę w końcowych stężeniach odpowiednio 25 µg/ml i 250 µg/ml. 4. Po 24-godzinnej inkubacji usuń płynną warstwę nakładkową i za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyszukaj placki wykazujące rozproszoną czerwoną fluorescencję, odpowiadającą wbudowaniu mCherry z wektora TDS (transient dominant selection) do wirusa. W zależności od genu docelowego i wybranego znacznika fluorescencyjnego w tym samym czerwonym placku może być obserwowana również zlokalizowana fluorescencja znacznika genu. Wybierz wiele placków dla każdego wirusa rekombinowanego poprzez zlokalizowane zeskrobywanie końcówką pipety w 100 µl DMEM z 5% FBS, aby przenieść komórki do probówki Eppendorf, a następnie przeprowadź trzy cykle zamrażania i rozmrażania zeskrobanych komórek w celu uwolnienia wirusów rekombinowanych. Dodaj DMEM zawierający zamrażanego i rozmrażanego wirusa do monowarstwy komórek na płytce 12-dołkowej, aby namnożyć wirusy rekombinowane z zastosowaniem odczynników selekcyjnych GPT w podłożu wzrostowym. Zeskrob pomyślnie namnożone komórki 24 godziny po infekcji. Przeprowadź test plackowy pomyślnie namnożonych placków wykazujących czerwoną fluorescencję, tym razem z warstwą nakładkową z agarozy i selekcją GPT, w następujący sposób: 1. Wysiej monowarstwę komórek BS-C-1 na płytkę 6-dołkową. 2. Wykonaj rozcieńczenia seryjne wirusów rekombinowanych i zainfekuj dołki rosnącymi rozcieńczeniami wirusów w DMEM bez FBS. 3. Godzinę po infekcji usuń podłoże płynne i przykryj każdy dołek warstwą 0,5% agarozy w minimalnym podłożu niezbędnym (MEM) zawierającym 2,5% FBS, 292 µg/ml L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny i 100 µg/ml streptomycyny wraz z odczynnikami selekcyjnymi GPT. 4. 2-3 dni po infekcji wybierz placki wykazujące zarówno fluorescencję czerwoną, jak i kolor wybranego znacznika fluorescencyjnego w celu ponownego namnożenia, tym razem bez selekcji GPT. Przeprowadź kolejny test plackowy z warstwą agarozy bez selekcji. Wybierz placki, które utraciły rozproszoną czerwoną fluorescencję, ale zachowały zlokalizowaną fluorescencję odpowiadającą wybranemu znacznikowi. Kontynuuj oczyszczanie placków bez selekcji, aby uzyskać czysty stok wirusów rekombinowanych, które utraciły gen mCherry i gen selekcyjny gpt, ale zachowały zlokalizowaną fluorescencję odpowiadającą wybranemu znacznikowi. Sprawdź czystość stoków za pomocą testu plackowego; wszystkie placki powinny mieć podobny fenotyp. Marzook, N. B., i wsp. Metodyka efektywnego generowania białek wirusa vaccinia znakowanych fluorescencyjnie. J. Vis. Exp. (2014)

W niniejszym filmie przedstawiono generowanie rekombinowanych wirusów vaccinia z wykorzystaniem plazmidowej rekombinacji homologicznej w zakażonych komórkach nabłonkowych. Markery fluorescencyjne i metaboliczne umożliwiają selekcję oraz identyfikację wirusów wykazujących ekspresję białek z tagiem.

Protokół

Generowanie wirusa rekombinowanego

1. Zgodnie z Rysunkiem 1, zainfekuj monowarstwę komórek BS-C-1 [Buffalo Subclone C-1 (linia nabłonkowych komórek nerki małpy pochodna komórek CV-1)] wirusem vaccinia w medium bezsurowiczym przy wielokrotności infekcji (MOI) > 1.
2. 1 hr po infekcji, odzyskaj komórki za pomocą modyfikowanej pożywki Eagle'a Dulbecco (DMEM) i przeprowadź transfekcję mieszaniną plazmidu wektora rekombinacyjnego i odczynnika do transfekcji w stosunku 3:1 w medium bezsurowiczym.
3. Po 24 hr, zeskrob i odzyskaj komórki w DMEM niezawierającym płodowej surowicy bydlęcej (FBS), a następnie przeprowadź trzy cykle zamrażania i rozmrażania, aby rozbić komórki i uwolnić cząsteczki wirusa.
4. Przeprowadź test plackowy z płynną warstwą nakładkową z DMEM z 10% FBS oraz odczynnikami selekcyjnymi GPT (guaninofosfororybylotransferaza z E. coli): kwasem mykofenolowym (25 µg/ml) i ksantyną (250 µg/ml) w następujący sposób:
   1. Zasiej monowarstwę komórek BS-C-1 na płytce 6-dołkowej.
   2. Zainfekuj 100% konfluentne monowarstwy komórek seryjnymi rozcieńczeniami zamrożonych i rozmrożonych komórek zawierających cząsteczki wirusa, aby zapewnić odpowiednią separację poszczególnych placków.
   3. Nałóż płynną warstwę DMEM z 10% FBS zawierającą odczynniki selekcyjne GPT – kwas mykofenolowy i ksantynę w końcowych stężeniach odpowiednio 25 µg/ml i 250 µg/ml.
5. Po 24 hr inkubacji usuń płynną warstwę nakładkową i za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyszukaj placki wykazujące rozproszoną czerwoną fluorescencję, odpowiadającą wbudowaniu mCherry z wektora TDS (transient dominant selection) do wirusa. W zależności od genu docelowego i wybranego znacznika fluorescencyjnego, w tym samym czerwonym placku może być obserwowana również zlokalizowana fluorescencja znakowanego genu.
6. Wybierz wiele placków dla każdego wirusa rekombinowanego poprzez zlokalizowane zeskrobanie końcówką pipety w 100 µl DMEM z 5% FBS, aby przenieść komórki do probówki Eppendorf, a następnie przeprowadź trzy cykle zamrażania i rozmrażania zeskrobanych komórek, aby uwolnić wirusy rekombinowane.
7. Dodaj DMEM zawierający zamrożone i rozmrożone wirusy do monowarstwy komórek na płytce 12-dołkowej, aby namnożyć wirusy rekombinowane z użyciem odczynników selekcyjnych GPT w medium wzrostowym. Zeskrob udane amplifikacje 24 hr po infekcji.
8. Przeprowadź test plackowy pomyślnie namnożonych placków wykazujących czerwoną fluorescencję, tym razem z nakładką agarozową i selekcją GPT, w następujący sposób:
   1. Zasiej monowarstwę komórek BS-C-1 na płytce 6-dołkowej.
   2. Wykonaj rozcieńczenia seryjne wirusów rekombinowanych i zainfekuj dołki zwiększającymi rozcieńczeniami wirusów w DMEM bez FBS.
   3. 1 hr po infekcji usuń płynne medium i nałóż na każdy dołek 0,5% agarozę w minimalnym medium niezbędnym (MEM) zawierającym 2,5% FBS, 292 µg/ml L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny i 100 µg/ml streptomycyny, wraz z odczynnikami selekcyjnymi GPT.
9. 2-3 dni po infekcji wybierz placki wykazujące fluorescencję zarówno czerwoną, jak i w kolorze wybranego znacznika fluorescencyjnego, aby ponownie je namnożyć, tym razem bez selekcji GPT.
10. Przeprowadź kolejny test plackowy z nakładką agarozową bez selekcji.
11. Wybierz placki, które utraciły rozproszoną czerwoną fluorescencję, ale zachowały zlokalizowaną fluorescencję odpowiadającą wybranemu znacznikowi.
12. Kontynuuj oczyszczanie placków bez selekcji, aby uzyskać czysty stok wirusów rekombinowanych, które utraciły mCherry i geny selekcyjne gpt, ale zachowały zlokalizowaną fluorescencję odpowiadającą wybranemu znacznikowi. Sprawdź czystość stoków za pomocą testu plackowego; wszystkie placki powinny mieć podobny fenotyp placka.

Wyniki

Rycina 1. Schemat procedury eksperymentalnej służącej do wytworzenia rekombinowanego wirusa ospy krowiej. Przedstawiono zdarzenia zachodzące na poziomie genetycznym i komórkowym wraz z reprezentatywnymi obrazami plamkowań, obrazującymi kolejne etapy po wytworzeniu fluorescencyjnego wirusa ospy krowiej znakowanego mCherry-A3-GFP. (A) Komórki zainfekowane wirusem ospy krowiej poddaje się transfekcji wektorem rekombinacyjnym TDS. (B) Na tej rycinie przedstawiono jedynie wynik rekombinacji lewostronnej, a w przykładzie jako wybrany znacznik fluorescencyjny zastosowano GFP. Rekombinacja prawostronna doprowadziłaby do wbudowania całego plazmidu TDS w genom w podobny sposób, z tą różnicą, że w etapie pośrednim znacznik zostałby połączony z całym genem docelowym, t.j. krok C. Na monowarstwie komórkowej przeprowadza się test plackowy z użyciem mieszaniny rekombinacyjnej, a następnie poddaje ją selekcji GPT. (C) Wybierane i namnażane są płytki wykazujące zarówno czerwoną, jak i zieloną fluorescencję, odpowiadające odpowiednio ekspresji mCherry i GFP. Po usunięciu selekcji nastąpi utrata czerwonej fluorescencji, co będzie odpowiadać utracie gpt i mCherry geny (D), a następnie wybiera się i namnaża blaszki wykazujące wyłącznie fluorescencję zieloną (E).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kwas mykofenolowy	Sigma-Aldrich	M3536-50MG	Rozpuścić w 0.1 N NaOH
Ksantyna	Sigma-Aldrich	X0626-5G	Rozpuścić w 0.1 N NaoH
Odczynnik do transfekcji FuGENE HD	Promega	E2311
Mikroskop fluorescencyjny wyposażony w filtry Chroma 31001, 31002	Olympus, Chroma	BX51 (Olympus); 31001, 31002 (Chroma)