Połączona transdukcja adenowirusowa i wyciszanie genów za pomocą siRNA w komórkach nowotworowych

Streszczenie

Źródło: Fuchs, M. et al. Adenofekcja: Metoda badania roli chaperonów molekularnych w morfodynamice komórkowej za pomocą eksperymentów z deplecją i ratunkiem. J. Vis. Exp. (2016)

W niniejszym filmie zaprezentowano dostarczanie fluorescencyjnego transgenu za pośrednictwem adenowirusa w połączeniu z transfekcją siRNA–fosforanem wapnia w komórkach raka szyjki macicy. Adenowirus wykazuje ekspresję fluorescencyjnego białka zastępczego, podczas gdy siRNA indukuje ukierunkowaną degradację mRNA poprzez wiązanie z kompleksem RISC. Ta sekwencyjna kotransfekcja umożliwia jednoczesny wyciszenie (knockdown) białka endogennego oraz funkcjonalne przywrócenie jego aktywności (rescue) za pomocą transgenu, co pozwala na wizualizację i potwierdzenie zastąpienia białka poprzez obrazowanie fluorescencyjne.

Protokół

1. Transdukcja adenowirusowa i wyciszenie endogennego białka poprzez transfekcję małymi interferującymi RNA (siRNA) w komórkach HeLa-RFP-H2B z wykorzystaniem wytrącania fosforanu wapnia (CaPi)

UWAGA: Adenowirus kontrolny niosący niezwiązany gen (t.j. (LacZ) lub nie stosuje się żadnego genu, aby osiągnąć minimalną wielokrotność infekcji (MOI) we wszystkich procedurach adenofekcji (10–20 jednostek tworzących plaki (PFU)/komórkę), wykorzystując najniższą ilość rekombinowanego adenowirusa niosącego badany gen.

UWAGA: Wykazano, że procedura ta pomaga znormalizować ekspresję na jedną komórkę w dużej populacji komórek.

1. Jeden dzień po wysiewaniu komórek, policz komórki z dodatkowej płytki. Odssać medium i przepłukać raz 1 mL 0,05% trypsyny/kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA). Ponownie dodać 1 mL 0,05% trypsyny/EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ aż do całkowitego odklejenia się komórek. Dobrze rozdzielić komórki za pomocą pipety 1 mL i policzyć liczbę komórek na 1 mL przy użyciu komory countingowej (haemocytometru).
2. Wyznaczyć ilość wirusa potrzebną do transdukcji komórek przy MOI wynoszącym 2 PFU białka zainteresowania (POI) na komórkę oraz 18 PFU na komórkę dla wektora pustego (np. LacZ), aby uzyskać łącznie 20 PFU na komórkę. Jednocześnie przeprowadzić transdukcję 4 PFU każdego bakulowirusa kodującego aktynę z GFP (białkiem zieleniejącym fluorescencyjnym) oraz α-tubulinę z RFP (białkiem czerwoniejącym fluorescencyjnym). Przeprowadzić transdukcję komórek zgodnie z poniższym protokołem adenofekcji.
3. Przygotować w sterylnej komorze laminarnej probówkę plastikową 1,5 mL dla każdego wariantu i dodać 400 μL ogrzanego minimalnego medium esencjalnego alfa (αMEM).
4. Powoli rozmrozić alikwot wirusów na lodzie i w razie potrzeby rozcieńczyć zapas wirusa, aby pipetować objętość większą niż 1 μL w celu zminimalizowania błędów pipetowania.
5. Dodać obliczoną ilość wirusa dla każdego wariantu do każdej probówki plastikowej 1,5 mL zawierającej 400 μL αMEM i delikatnie wymieszać poprzez pipetowanie. Natychmiast przenieść zapas wirusa z powrotem do -80 °C, aby zachować jego aktywność.
6. Odssać medium z komórek i delikatnie dodawać mieszaninę wirusową kroplami za pomocą pipety. Inkubować komórki w 37 °C, 5% CO₂ i ostrożnie agitować płytki w sterylnej komorze laminarnej co 15 min przez 1 h, aby upewnić się, że komórki są dobrze pokryte wirusem. Zastosowanie niewielkiej ilości medium ułatwia kontakt wirusa z komórkami.
7. Po inkubacji delikatnie dodać pipetą 1,6 mL αMEM do każdej płytki, aby uzyskać całkowitą objętość 2 mL; rozpocząć synchronizację komórek poprzez dodanie 2 mM tymydyny i inkubować komórki przez kolejne 2 h w 37 °C, 5% CO₂.
8. W tym czasie przygotować mieszaninę do transfekcji siRNA zgodnie z metodą transfekcji CaPi (patrz Rycina 1). Jeśli siRNA nie jest wymagany, zastąpić jego ilość sterylną wodą w celu przeprowadzenia transfekcji pustej.
9. Przygotować 200 μL mieszaniny dla każdego wariantu, co daje 400 μL na próbkę powtórzoną. Poniższy przykład dotyczy końcowego stężenia siRNA wynoszącego 50 nM i musi zostać dostosowany dla każdego białka zainteresowania. Do probówki plastikowej 1,5 mL pipetować 50 μL 1 M CaCl₂ oraz 11 μL 20 μM siRNA do 139 μL sterylnej H₂O i wymieszać za pomocą wortexa. Po krótkim wirowaniu ostrożnie dodawać kroplami 200 μL 2× soli w buforze HEPES (HBS2x) (280 mM NaCl, 50 mM kwasu 4-(2-hydroksyetyl)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES), 1,5 mM Na₂HPO₄, pH 7,01-7,05).
   UWAGA: Im mniejsze krople, tym mniejsze powstają wytrącanie, co skutkuje lepszą wydajnością transfekcji. Delikatnie wymieszać trzy razy poprzez wprowadzanie powietrza za pomocą pipety 200 μL.
10. Inkubować mieszaninę przez 30 min w temperaturze pokojowej (RT). Powoli dodać 200 μL mieszaniny transfekcyjnej do każdej płytki i agitować krzyżowo. Przenieść płytki do 37 °C, 5% CO₂ na 16 h.
11. Następnego dnia przemyć komórki dwukrotnie 2 mL ogrzanego HEPES-u (6,7 mM KCl, 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,3) i dodać 2 mL αMEM. Nie przetwarzać więcej niż czterech płytek z komórkami jednocześnie, ponieważ różnice w temperaturze wpływają na długość cyklu komórkowego.
12. Wizualizować wydajność infekcji pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym przy powiększeniu 20-40x (obiektyw) i pobrać trzy reprezentatywne obrazy dla każdego wariantu w kanałach fluorescencyjnym i transmisyjnym do dokumentacji. Siedem godzin później dodać 2 mM tymydyny i inkubować przez kolejne 16 h w 37 °C, 5% CO₂.
13. Następnego dnia, 48 h po transfekcji siRNA i infekcji wirusowej, przemyć komórki dwukrotnie 2 mL ogrzanego soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS) i pozostawić na 7 h w 2 mL αMEM bez czerwieni fenolowej do obrazowania żywych komórek lub z czerwienią fenolową do ekstrakcji białek.
14. Zebrać komórki dla każdego wariantu 48 h po transfekcji w celu przygotowania ekstraktów białkowych i analizy Western blot, aby określić wydajność wyciszenia (knockdown) oraz ekspresję białka endogennego.
    UWAGA: Należy użyć przeciwciał przeciwko białku zainteresowania oraz odpowiednich przeciwciał służących jako kontrole ładowania. Wydajność wyciszenia powinna być określona poprzez nakładanie malejących ilości lizatów komórek kontrolnych (transfekowanych kontrolnym siRNA) w celu uzyskania krzywej miareczkowania (np. 1, ½, ¼, ⅛).

Wyniki

Rysunek 1. Plan typowego protokołu adenofekcji. Przedstawiono kolejne etapy typowego eksperymentu dla protokołu z wykorzystaniem osadów CaPi (podkreślone na szaro) lub protokołu z wykorzystaniem kationowego lipidowego odczynnika do transfekcji (wyróżnione na żółto), obejmujące wysiew komórek, transdukcję adenowirusami i bakulowirusami, transfekcję dupleksów siRNA oraz synchronizację komórek za pomocą podwójnej blokady tymidyną. Linie czasu w godzinach dla obu protokołów znajdują się po prawej stronie rysunku.

Materiały

EDTA	Sigma	E5134
Płytkowa surowica bydlęca (FBS)	Thermo Fisher	12483-020
Fibronektyna	Sigma	F1141
Szalki z szklanym dnem, 35 mm	MatTek Corperation	P35G-1.5-20-C Case
HeLa-RFP-H2B	Uprzejmy dar dr Sabine Elowe, Québec, Canada
HEPES	Fisher Scientific	BP310-1
KCl	Fisher Scientific	BP366-500
L-Glutamina	Thermo Fisher	25030081
NaCl	Fisher Scientific	BP358-10
Podłoże Minimal Essential Medium (MEM) Alpha	Wisent	310-101-CL
Podłoże Minimal Essential Medium (MEM) Alpha bez dezoksyrybonukleozydów/rybonukleozydów	Thermo Fisher	12000-022
Podłoże Minimal Essential Medium (MEM) Alpha bez czerwieni fenolowej	Thermo Fisher	41061-029
Na₂HPO₄	Biobasic	S0404
Adenowirus na specjalne zamówienie	Welgen	Custom design
Chlorek wapnia	Fisher Scientific	C79-500
CellLight® Actin-GFP, BacMam 2.0	Thermo Fisher	C10582
CellLight® Tubulin-RFP, BacMam 2.0	Thermo Fisher	C10614
Dupleksy siRNA	Dharmacon	Custom design
Tymidyna	Sigma	T9250
Trypsyna 2,5%	Thermo Fisher	15090-046