Znakowanie reszt cysteiny dostępnych na powierzchni w zmodyfikowanych cząsteczkach wirusopodobnych

Streszczenie

Źródło: Natilla, A.,and Hammond, R. W. Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs. J. Vis. Exp. (2013)

W niniejszym filmie zaprezentowano specyficzne dla miejsca znakowanie fluorescencyjne zmutowanych cząsteczek wirusopodobnych (VLP) wytworzonych w Nicotiana benthamiana przy użyciu barwnika reaktywnego wobec grup tiolowych, a następnie ich oczyszczanie i elektroforezę w żelu w celu potwierdzenia modyfikacji powierzchniowej.

Protokół

1. Inokulacja wirusem i oczyszczanie VLP z roślin Nicotiana benthamiana

1. Przygotować kapsylowane transkrypty T7-RNA z plazmidów wektorowych opartych na wirusie ziemniaka X (PVX), zawierających geny białka kapsydu (CP) wirusa Maize rayado fino virus (MRFV) typu dzikiego (wt) oraz zmutowanego w pozycji cysteiny, używając zestawu T7-mMessage mMachine firmy Ambion.
2. Dla każdej reakcji transkrypcji T7 zaszczepić dwa w pełni rozwinięte liście N. benthamiana za pomocą 10 μL reakcji i inkubować rośliny przez 10 dni w szklarni, przy 60% wilgotności, przez 16 h w świetle (25,000-30,000 lux) w temperaturze 25 °C oraz 8 h w ciemności w temperaturze 20 °C.
3. Zebrać zainfekowane wirusem liście N. benthamiana 10 dni po inokulacji (dpi), zważyć tkankę roślinną (50 gramów) i umieścić na lodzie.
4. Zhomogenizować materiał roślinny w blenderze w obecności 100 mL schłodzonego roztworu buforu cytrynianowo-sodowego 0,5 M o pH 5,5 (użyć 2 mL buforu na gram tkanki roślinnej).
5. Przefiltrować homogenat przez 3 warstwy gazy i oczyścić poprzez wirowanie przy 27,000 × g przez 30 min. Przenieść nadsącz do schłodzonego cylindra miarowego, zmierzyć objętość, a następnie przenieść do schłodzonego, sterylnego zlewki. Osad odrzucić.
6. Przetworzyć nadsącz poprzez dodanie 10% glikolu polietylenowego 8,000 (PEG 8,000), mieszać przez 15 min w temperaturze 4 °C i inkubować przez kolejne 45 min w temperaturze 4 °C w celu wytrącenia matrycy cząsteczek wirusopodobnych (VLP)-PEG.
7. Wirować próbkę przy 27,000 × g przez 20 min w temperaturze 4 °C i usunąć nadsącz.
8. Przetworzyć osad poprzez dodanie 8 mL buforu cytrynianowo-sodowego 0,05 M o pH 5,5, zawierającego 2% Triton X-100. Dobrze wymieszać probówki wirówki ruchem okrężnym, aby uwolnić osad. Przenieść osad i bufor do schłodzonej, sterylnej zlewki. Natychmiast wypłukać probówki 2 mL tego samego buforu i dodać do zlewki. Mieszać zawiesinę w temperaturze 4 °C do czasu rozpuszczenia osadów (zazwyczaj 1 h).
9. Oczyścić poprzez wirowanie przez 5 min przy 27,000 × g, odrzucić osad i przetworzyć nadsącz poprzez wirowanie przy 140,000 × g przez 2 h w temperaturze 4 °C.
10. Resuspendować osad w 1 mL buforu cytrynianowo-sodowego 0,05 M o pH 5,5 i nanieść zawiesinę na gradient sacharozy 10-40% przygotowany w buforze cytrynianowo-sodowym 0,05 M o pH 5,5.
11. Wirować gradient przez 3 h przy 140,000 × g w temperaturze 4 °C.
12. Oświetlić górną część probówki wirówki i zebrać rozpraszający światło górny prążek w odległości 4 cm od góry probówki, rozcieńczyć buforem cytrynianowo-sodowym 0,05 M o pH 5,5 i wirować przez 3 h przy 140,000 × g w temperaturze 4 °C.
13. Resuspendować osad w 0,5 mL sterylnej wody i przechowywać w temperaturze 4 °C do sześciu miesięcy.
14. Oznaczyć stężenie VLP, wykonując test białkowy Bradforda. Wydajność VLP wynosi od 1 do 3 μg/g tkanki roślinnej.

2. Reakcje znakowania VLP fluoresceiną-5-maleimidem

1. Przygotować 1 mM roztwór fluoresceiny-5-maleimidu (427,37 g/mol) w 50 mM buforze fosforanowym sodu, pH 7,0; 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA). Wymieszać za pomocą wortexa i sprawdzić, czy substancja została całkowicie rozpuszczona. Chronić probówkę przed światłem, owijając ją folią aluminiową.
2. Dodać fluoresceinę-5-maleimid do VLP otrzymanych w kroku 1 i wymieszać. Należy zastosować 25-krotną nadwyżkę molową fluoresceiny-5-maleimidu w stosunku do molowej ilości grup sulfhydrylowych. Zazwyczaj zastosowanie 30 μL VLP o stężeniu 1 μg/μL oraz 60 μL roztworu fluoresceiny-5-maleimidu daje satysfakcjonujące wyniki.
3. Inkubować mieszaninę przez 2 h w temperaturze pokojowej lub przez noc w 4 °C.
4. Zatrzymać reakcję poprzez dodanie ditiotreitolu (DTT) do stężenia końcowego 50 mM.
5. Usunąć nieprzereagowaną fluoresceinę za pomocą kolumny odsalającej (Thermo Scientific Inc., Rockford IL) i wirowania przez 2 min przy 1 500 × g w temperaturze pokojowej.
6. W celu analizy za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE), dodać 10 μL 2 × buforu do próbek Laemmliego SDS-PAGE do 10 μL każdej reakcji. Przechowywać znakowane białko w ciemności w temperaturze 4 °C do jednego miesiąca lub w jednorazowych alikwotach w temperaturze -20 °C do 3 miesięcy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Probówki cienkościenne, Ultra-Clear Tubes	Beckman	344059
mMESSAGE mMACHINE T7 Kit	Life Tecnologies	AM1344M
Fluoresceina-5-maleimid	Thermo Scientific Life Technologies	46130 F150	Produkt 46130 niedostępny, zastąpić produktem F150
Bufor Laemmliego	Bio-Rad	1610737
Bufor do elektroforezy Tris-glicyna SDS (dodecylsiarczan sodu)	Invitrogen	LC2675
Bufor do transferu Tris-glicyna	Invitrogen	LC3675
Membrana nitrocelulozowa, papier filtracyjny (kanapka)	Invitrogen	LC2001
EZ-Link Maleimide-Polyethylene glycol (PEG) 2-Biotin, No-Weigh Format	Thermo Scientific	21901