Produkcja cząsteczek wirusopodobnych w zmodyfikowanych E. coli

Streszczenie

Źródło: Chen, Z., et al. Making Conjugation-induced Fluorescent PEGylated Virus-like Particles by Dibromomaleimide-disulfide Chemistry. J. Vis. Exp. (2018)

W niniejszym filmie zaprezentowano metodę kontrolowanej ekspresji białka kapsydu bakteriofaga Qβ w zmodyfikowanych szczepach E. coli. Powstałe białka ulegają samoroskładaniu w cząsteczki przypominające wirusy (VLP), które są następnie pozyskiwane do dalszej biokoniugacji.

Protokół

Ekspresja Qβ

1. Przetrzeć powierzchnię blatu roztworem wybielacza i etanolu w stosunku 1:1.
2. Przygotować dwie 3 mL kultury startowe w warunkach aseptycznych, dodając pojedyncze kolonie E. coli BL21(DE3) do 3 mL pożywki Super Optimal Broth (SOB).
3. Inkubować na wytrząsarce przy 250 rpm w pomieszczeniu o temperaturze 37 °C i 0% wilgotności względnej (rH) przez noc.
4. Zaszczepić kulturę startową w pożywce SOB:
   1. Zdjąć obie 3 mL kultury startowe z wytrząsarki i w warunkach aseptycznych przelać każdą z nich do jednej z dwóch 2 L kolb Erlenmeyera z przegrodami, zawierających każda 1 L świeżej pożywki SOB.
   2. Umieścić zaszczepione pożywki na wytrząsarce przy 250 rpm w pomieszczeniu o temperaturze 37 °C i 0% rH.
5. Hoduć bakterie na wytrząsarce przy 250 rpm w pomieszczeniu o temperaturze 37 °C i 0% rH do momentu, aż OD₆₀₀ osiągnie wartość 0,9–1,0.
6. Dodać 1 mL 1 M izopropyl-β-D-1-tiogalaktopiranosydy (IPTG) za pomocą pipety P1000, aby indukowć ekspresję białka.
7. Pozostawić pożywki na wytrząsarce przy 250 rpm w pomieszczeniu o temperaturze 37 °C i 0% rH przez noc.
8. Zdjąć pożywki z wytrząsarki następnego dnia rano i odwirować je w butelkach 1000 mL przy 20 621 × g przez 1 h w temperaturze 4 °C w celu zebrania komórek.
9. Odlać nadsącz i zebrać osad komórkowy.
   1. Przelać nadsącz do kolby z około 5 mL wybielacza w celu zneutralizowania bakterii. Stanowi to odpad.
   2. Za pomocą szpachelki zebrać osad komórkowy z dna butelki do wirowania i przenieść go do 50 mL probówki wirówkowej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
LB Broth (Miller)	EMD Millipore	1.10285.0500
Trypton, proszek	Research Products International	T60060-1000.0
Ekstrakt drożdżowy, proszek	Research Products International	Y20020-1000.0
Siarczan magnezu bezwodny	P212121	CI-06808-1KG
Chlorek sodu (krystaliczny/certyfikowany ACS)	Fisher Scientific	S271-10
Chlorek potasu	Fisher Scientific	BP366-500
System oczyszczania wody Elga PURELAB Flex 3	Fisher Scientific	4474524
Fosforan potasu jednodstawny	Fisher Scientific	BP362-1
Fosforan potasu dwudstawny bezwodny	Fisher Scientific	P288-500
Izopropyl β-D-1-tiogalaktopyranosyd (IPTG)	Sigma Aldrich	I6758-1G
Butelki wirówkowe Nalgene z zakrętkami, kopolimer polipropylenu	Thermo Scientific	3141-0250
Wstrząsarka orbitalna VWR Os-500	VWR Scientifc Products	14005-830
Pipetman P1000	Gilson	F123602
Stożkowa probówka wirówkowa Falcon 50 mL	Fisher Scientific	14-432-22