Funkcjonalizacja fluorescencyjna cząsteczek przypominających wirusy poprzez ponowne tworzenie mostków dwusiarczkowych

Streszczenie

Źródło: Chen, Z., et al. Making Conjugation-induced Fluorescent PEGylated Virus-like Particles by Dibromomaleimide-disulfide Chemistry. J. Vis. Exp. (2018)

Niniejszy film prezentuje fluorescencyjną funkcjonalizację cząstek wirusopodobnych poprzez ponowne sieciowanie zredukowanych mostków dwusiarczkowych za pomocą łącznika z glikolu polietylenowego (PEG), co pozwala na otrzymanie stabilnych, możliwych do śledzenia koniugatów odpowiednich do obrazowania komórkowego i celowanego dostarczania w zastosowaniach biomedycznych.

Protokół

1. Koniugacja związków dibromomaleimidowych (DB) z bakteriofagiem Qβ

1. Redukcja mostków disiarczkowych w Qβ.
   1. Rozpuścić 0,0020 g tris(2-karboksyetylo)fosfiny (TCEP) w 1 mL wody ultrapure, aby przygotować 100-krotny roztwór stokowy.
      UWAGA: Przed redukcją należy przygotować świeży roztwór TCEP.
   2. Do probówki do mikrowirówki dodać 200 µL Qβ (5 mg/mL).
   3. Następnie dodać 20 µL 100-krotnego roztworu stokowego TCEP.
   4. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 h.
2. Ponowne tworzenie mostków w zredukowanych disiarczkach przy użyciu dibromomaleimidu polietylenoglikolu (DB-PEG).
   1. Rozpuścić 0,0017 g dibromomaleimidu-polietylenoglikolu (DB-PEG) w 100 µL DMF.
   2. Dodać 680 µL 10 mM roztworu fosforanu sodu (pH 5).
   3. Do roztworu DB-PEG dodać zredukowane Qβ i obserwować proces mieszania pod lampą UV (ultrafioletową) o długości fali 365 nm. Jasnożółta fluorescencja może być natychmiast widoczna po zmieszaniu przy użyciu ręcznej lampy UV 365 nm.
   4. Pozostawić reakcję na noc w temperaturze pokojowej (RT) na rotatorze.
3. Oczyścić mieszaninę reakcyjną za pomocą filtra wirówkowego (próg odcięcia masy cząsteczkowej (MWCO) = 10 kDa) trzykrotnie, używając 1x PBS (soli fosforanowo-buforowanej) przy 3 283 x g przez 20 min w 4 °C.
4. Monitorować koniugację za pomocą nieodredukującego SDS-PAGE (elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodu) oraz natywnej elektroforezy w żelu agarozowym.
   UWAGA: VLP (cząsteczki przypominające wirusy) wędrują w natywnym żelu agarozowym jako nieuszkodzone cząsteczki i są rozdzielane na podstawie ich ładunku, wielkości i kształtu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2,3-dibromomaleimid 97%	Sigma Aldrich	553603-5G
Glikol polietylenowy	Alfa Aesar	41561-22
Fosforan sodu	Fisher Scientific	AC424375000
Akrylamid/bis-akrylamid	P212121	RP-A11310-500.0
Dodecylsiarczan sodu	Sigma Aldrich	L3771-100G
Persiarczan amonu	Fisher Scientific	BP179-100
Jednostki filtracyjne do wirowania Amicon Ultra-4	Millipore Sigma	UFC801024
Stożkowa probówka wirówkowa Falcon 15 mL	Fisher Scientific	14-959-53A
Probówka do mikrowirowania: 1,5 mL	Fisher Scientific	05-408-129
Wstrząsarka orbitalna VWR Os-500	VWR Scientifc Products	14005-830
Pipeta Pipetman P1000	Gilson	F123602
Pipeta Pipetman P200	Gilson	F123601
Pipeta Pipetman P100	Gilson	F123615
Pipeta Pipetman P20	Gilson	F123600
Pipeta Pipetman P10	Gilson	F144802
Laboratoryjna waga precyzyjna Intel Weighing PM-100	Intelligent Weighting Technology	IWT_PM100