Bezpieczne przygotowanie preparatów wirusowych do transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Streszczenie

Źródło: Blancett, C. D., et al. Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment. J. Vis. Exp. (2017).

Niniejszy materiał wideo demonstruje bezpieczne przygotowanie preparatów wirusowych do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Cząsteczki wirusa są utrwalane glutaraldehydem, barwione odczynnikiem o wysokiej gęstości elektronowej oraz poddawane utrwalaniu oparami tetratlenku osmu w celu stabilizacji struktur i zapewnienia całkowitej inaktywacji, co gwarantuje bezpieczną obsługę próbek wirusowych przy jednoczesnej poprawie kontrastu dla wysokiej jakości obrazowania TEM.

Protokół

1. Metoda kapsułkowa do barwienia negatywnego w warunkach biocontainment z wykorzystaniem wodnego glutaraldehydu i inaktywacji oparami 1% tetrotnku osmu

1. Wewnątrz komory bezpieczeństwa biologicznego (BSC) w strefie biocontainment naciągnij 40 µL zawiesiny wirusa do kapsułki przymocowanej do pipety.
   UWAGA: Pipeta pozostaje przymocowana do kapsułki aż do zakończenia procesu.
2. Połóż pipetę na boku na 10 min, tak aby siatki były zorientowane poziomo. Ma to na celu zapewnienie równomiernego rozkładu cząstek wirusa na powlekanych siatkach.
3. Inaktywuj wirusa wewnątrz kapsułki w komorze BSC w strefie biocontainment.
   1. Podnieś pipetę i naciśnij tłok, aby odprowadzić roztwór wirusa do pojemnika na odpady.
   2. Naciągnij 40 µL 2% utrwalacza glutaraldehydu do kapsułek. Uwaga: Glutaraldehyd jest substancją niebezpieczną i wymaga odpowiedniej ochrony. Glutaraldehydu można używać przez krótkie okresy w zwykłej komorze BSC, jednak dłuższa ekspozycja na otwarty odczynnik wymaga pracy w komorze BSC z wyciągiem lub w dygestorium chemicznym.
   3. Połóż pipetę na boku na 20 min. Ma to zapewnić odpowiednie utrwalenie próbek.
   4. Wypuść utrwalacz i naciągnij 40 µL wody DI (dejonizowanej) do kapsułek, aby wypłukać utrwalacz. Powtórz ten etap płukania łącznie 3 razy.
4. Naciągnij 40 µL 1% octanu uranylu (UA) lub 1% kwasu fosfotungstowego potasu (PTA) do kapsułek i pozostaw na 30 s.
   UWAGA: Czas barwienia może wynosić od 10 s do 1 min w zależności od próbki wirusa.
   OSTRZEŻENIE:: UA jest emitorem cząstek alfa i toksyną kumulatywną. Należy z nim obchodzić się przy zastosowaniu odpowiedniej ochrony.
5. Zdejmij kapsułkę z pipety i osusz siatki, dotykając krawędzi siatek kawałkiem papieru filtracyjnego, podczas gdy siatki pozostają wewnątrz kapsułki.
6. Procedura inaktywacji oparami tetratlenku osmu.
   1. Umieść kapsułkę z otwartą pokrywką w probówce wirówkowej o pojemności 50 mL zawierającej papier filtracyjny nasączony 1% roztworem tetratlenku osmu. Uwaga: Tetratlenek osmu jest niezwykle toksyczny i charakteryzuje się niską prężnością par. Musi być używany w komorze BSC z wyciągiem lub w dygestorium chemicznym. Należy z nim obchodzić się przy zastosowaniu odpowiedniej ochrony. W miejscu pracy należy umieścić informacje ostrzegawcze.
   2. Szczelnie zamknij probówkę wirówkową 50 mL na 1 h, aby umożliwić całkowite przeniknięcie oparów tetratlenku osmu. Następnie odkaź probówkę i przenieś ją ze strefy biocontainment do laboratorium EM (mikroskopii elektronowej) poziomu BSL-2.
7. Wyjmij siatki EM z kapsułki.
   1. W laboratorium EM BSL-2 wyjmij kapsułkę z probówki wirówkowej i nałóż ją na pipetę.
   2. Naciągnij 40 µL wody DI do kapsułki i trzy razy odprowadź wodę do pojemnika na odpady.
   3. Zdejmij kapsułkę z pipety i osusz siatki, dotykając krawędzi siatek papierem filtracyjnym.
   4. Po wysuszeniu na powietrzu przechowuj siatki do późniejszego obrazowania TEM (transmisyjnej mikroskopii elektronowej).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Siatki TEM powlekane Formvarem/węglem	SPI	3420C-MB	200 mesh Cu Pk/100
Kapsułki mPrep/g	EMS	85010-01	box
Łączniki mPrep/f	EMS	85010-11	standard 16/Pk
Glutaraldehyd	EMS	16320	50% solution, EM grade
Tetratlenek osmu	EMS	19190	4% aqueous solution
Octan uranylu	EMS	22400	powder
Kwas fosfotungstowy	EMS	19500	powder
Papier filtracyjny	Whatman	1450-090	size 50
Transmisyjny mikroskop elektronowy	JEOL	JEM-1011	TEM