Rekonstytucja in vitro i oczyszczanie wirusowych cząstek przypominających nukleokapsyd

Streszczenie

Źródło: Gao, Y., et al. Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus. J. Vis. Exp. (2021)

Film prezentuje montaż in vitro swoistych dla wirusa nukleokapsydów z oczyszczonego kompleksu nukleoproteiny i fosfoproteiny pozbawionego RNA, ich oczyszczanie za pomocą chromatografii wykluczania molekularnego oraz walidację pełnowymiarowego wirusowego RNA wewnątrz zmontowanych cząsteczek.

Protokół

1. Klonowanie molekularne

UWAGA: Do stworzenia plazmidu dwucistronowej konstrukcji koekspresyjnej wirusa RSV (respiratory syncytial virus) wykorzystano klonowanie niezależne od ligazy (LIC). LIC to opracowana na początku lat 90. metoda, która wykorzystuje aktywność egzonukleazy 3’-5’ polimerazy DNA T4 do tworzenia nawisów wykazujących komplementarność pomiędzy wektorem a insertem DNA. Konstrukcje przygotowano z wykorzystaniem DNA wektora 2BT-10, który zawiera znacznik 10x His na końcu N-terminalnym otwartej ramki odczytu (ORF) (Rysunek 1).

1. Przeprowadź linearyzację wektorów LIC poprzez trawienie enzymem SspI.
   1. Połączyć 10 μL buforu SSPI 10X, 4 μL enzymu SSPI w stężeniu 5 U/μL, równoważna objętość 5 μg DNA z miniprep vektora oraz sterylnej wody ddH₂O to 100 μL.
   2. Inkubować produkt trawienia przez 3 godziny w temperaturze 37 °C.
   3. Przeprowadź elektroforezę produktów trawienia na żelu agarozowym o stężeniu 1,0% w celu wyodrębnienia DNA wektora.
   4. Do ekstrakcji i oczyszczania należy użyć zestawu do izolacji z żelu. Końcową objętość DNA wektora należy zawiesić w 30 μL ddH2O₂O i przechowywać w temperaturze -20 °C.

2. Przygotować inserty DNA dla N1-391 i P1-126, wykorzystując startery N1-391 Forward Primer, N1-391 Reverse Primer, P1-126 Forward Primer oraz P1-126 Reverse Primer (Tabela 1).

   UWAGA: Istnieje wystarczający obszar nakładania się z linearyzowanym wektorem, aby zapewnić temperaturę topnienia w zakresie od 55 °C i 60 °CW przypadku primera odwrotnego, z tego samego powodu występuje wystarczające nakładanie się z nicią odwrotną komplementarną do zlinearyzowanego wektora.

   Tabela 1. Sekwencje starterów.

   Startery	Sekwencja
   N1-391 Forward	5’-TACTTCCAATCCAATGCAATGGCCCTGAGCAAAGTGAAG-3’
   N1-391 Reverse	5’-TTATCCACTTCCAATGTTATTACAGTTCCACGTCGTTGTCCTTGG-3'
   P1-126 Forward	5’-TACTTCCAATCCAATGCAATGGAAAAGTTCGCCCCCGAG-3'
   P1-126 Reverse	5’-TTATCCACTTCCAATGTTATTACTGGTCGTTGATTTCCTCGTAGC-3’

   1. Przeprowadzić amplifikację wstawki DNA za pomocą reakcji polimerazy łańcuchowej (PCR) zgodnie z warunkami określonymi w Tabela 2 i Tabela 3.
   2. Wyizoluj amplifikowany insert DNA. Produkty PCR z poprzedniego etapu rozdziel w żelu agarozowym o stężeniu 1,0%, a następnie wyizoluj i oczyść prążki metodą ekstrakcji z żelu. Końcową objętość wyizolowanego DNA zawieś w 15 μL z ddH2O₂O.

   Tabela 2. Odczynniki do amplifikacji PCR insertu DNA.

   Amplifikacja PCR insertu DNA
   15 μL	10x bufor reakcyjny do polimerazy Pfu
   3 μL	Starter forward (100 μM stężenie)
   3 μL	Starter odwrotny (100 μM stężenie)
   15 μL	Mieszaninatrio-fosforanów deoksynukleotydów (dNTP) o stężeniu 2,5 mM
   6 μL	Plazmidowe DNA zawiera gen N lub P (100 ng/ μL)
   7 μL	Dimetylosulfoksyd (DMSO)
   3 μL	polimeraza Pfu w stężeniu 2,5 j./μL
   Objętość do uzupełnienia do 150 μL	Sterylna ddH2O2O

   Tabela 3. Program termocyklingu dla amplifikacji PCR insertu DNA.

   Amplifikacja PCR wstawki DNA
   Krok	Czas	Temperatura	Cykle
   Denaturacja	4 min.	95 ºC	1
   Denaturacja	45 s	95 ºC	30
   Hybrydyzacja	30 s	62 ºC
   Rozszerzenie*	90 s	72 ºC
   Rozszerzenie	10 min.	72 ºC	1
   Przytrzymaj	∞	4 ºC	1
   The 150 μL mieszaninę można poddać trzem oddzielnym reakcjom PCR (3 x 50μL).
   W przypadku polimerazy DNA Pfu zalecana prędkość dla fazy elongacji wynosi 1 kb/min. W niniejszym przypadku długość genu N1-391 oraz genu P1-126 jest krótsza niż 1,5 kb. Z tego względu w etapie elongacji zastosowano czas 90 sekund.

3. Obróbka wektora i insertu DNA za pomocą polimerazy DNA T4 (Tabela 4).

   Tabela 4. Traktowanie polimerazą DNA T4.

   Obróbka polimerazą DNA T4
   Bufor 10x	2 μL
   DNA wektora/wkładki (0,1 pmol wektora lub 0,2 pmol wkładki)	5 μL
   dNTP* w stężeniu 25 mM	2 μL
   DTT w stężeniu 100 mM	1 μL
   polimeraza DNA T4 (do LIC)	0.4 μL (1,25 U)
   Sterylna ddH2O2O	9.6 μL
   Do wektora użyto dGTP, a do insertu DNA dCTP.

   UWAGA: Obróbkę należy przeprowadzić oddzielnie dla DNA wektora i DNA wkładki.

   1. Inkubować mieszaninę przez 40 minut w temperaturze pokojowej. Następnie inaktywować polimerazę termicznie w temperaturze 75 °C przez 20 minut. Przechowywać mieszaninę reakcyjną w temperaturze -20 °C.
4. Przeprowadź hybrydyzację wektora LIC i wektora wstawki.
   1. Przygotować kontrolę negatywną z 2 μL DNA wektora LIC i 2 μL sterylnej wody ddH2O₂O.
   2. Połączyć 2 μL DNA wkładki i 2 μL DNA wektora LIC z poprzednich reakcji z polimerazą DNA T4 w probówce o pojemności 0,2 ml.
   3. Reakcję hybrydyzacji przeprowadzić w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
   4. Zatrzymać reakcję poprzez dodanie 1.3 μL kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) o stężeniu 25 mM.
   5. Przenieś reakcję do 100 μL z Escherichia coli Komórki kompetentne Top10 i wysieje je na płytkę z ampicyliną.
5. Zidentyfikuj pozytywne konstrukty.
   1. Przygotować roztwór z minipreparatyki plazmidu. Można to zrobić poprzez wybór kolonii i inokulację w pożywce Luria Broth (LB). Zazwyczaj wystarczy 3 kolonie.
   2. Inkubować mieszaninę przez noc w temperaturze 37 °C.
   3. Wirować mieszaninę z prędkością 4560 x g przez 10 minut, a następnie odrzucić nadsącz.
   4. Resuspendować osady w 250 μL buforu P1 i przygotować miniprepy plazmidów przy użyciu zestawu do miniprepu w kolumnach wirowych.
   5. Przeprowadź analizę trawienia produktu miniprepu za pomocą enzymu AseI lub innych enzymów restrykcyjnych.
   6. Naniesienie próbek na żel agarozowy o stężeniu 0,8% i elektroforeza trawionego plazmidu. Analiza żelu pod lampą UV.
   7. Skorzystaj z usługi sekwencjonowania, aby potwierdzić sekwencję otrzymanego produktu pozytywnego.

6. Pozyskać insert DNA do koekspresji.

   1. Przeprowadzić reakcję PCR w celu otrzymania N1-391 i P1-126, wykorzystując wcześniej przygotowane 2BT-10 N1-391 oraz 2BT-10 P1-126 w качестве matryc.
   2. Przeprowadź pierwszą reakcję PCR w celu otrzymania fragmentu N1-391 z konstruktu 2BT-10 N1-391, stosując warunki PCR określone w Tabela 2 i Tabela 3 z wykorzystaniem startera forward N1-391 oraz startera reverse 5 ́-GTGAAGATCCTGGCTGATGCAATGCGGCGGCGCGCCGCGATCGCGGATCC-3 ́.
   3. Przeprowadź drugą reakcję PCR w celu otrzymania P1-126 z konstruktu 2BT-10 P1-126, wykorzystując starter Forward: 5’-CCGCCGCATTGCATCAGCCAGGATCTTCACTGCAGGACTCGAGTTCTAGA-3’ ́oraz primer odwrotny P1-126 (należy zastosować warunki PCR opisane w Tabela 2 i Tabela 3).
   4. Na koniec przeprowadź PCR z nakładaniem (overlap PCR) na zmieszanych produktach z dwóch poprzednich reakcji PCR, aby połączyć N1-391 i P1-126. Użyj prawego starteru N1-391 Forward oraz lewego starteru P1-126 Reverse. Zastosuj warunki PCR opisane w Tabela 5 i Tabela 6.

   Tabela 5. Odczynniki do PCR z nakładaniem (overlap PCR).

   PCR z nakładaniem (Overlap PCR)
   15 μL	10X bufor reakcyjny do polimerazy Pfu
   3 μL	Starter bezpośredni (100 μM)
   3 μL	Starter odwrotny (100 μM)
   15 μL	Mieszanina dNTP (2,5 mM)
   3 μL	DNA z pierwszej rundy PCR zawierające gen N1-391 (100 ng/μL )
   3 μL	DNA z pierwszej rundy PCR zawierający gen P1-126 (100 ng/μL )
   7 μL	DMSO
   3 μL	Polimeraza Pfu (2,5 j/μL)
   Objętość do uzupełnienia do 150 μL	Sterylna ddH2O2O

   Tabela 6. Program cykli termicznych dla PCR z nakładaniem (overlap PCR).

   PCR z nakładaniem (Overlap PCR)
   Krok	Czas	Temperatura	Cykle
   Denaturacja	4 min.	95 °C	1
   Denaturacja	45 s	95 °C	30
   Hybrydyzacja	30 s	62 °C
   Rozszerzenie*	2 min.	72 °C
   Rozszerzenie	10 min.	72 °C	1
   Przytrzymaj	∞	4 °C	1
   The 150 μL mieszaninę można poddać trzem oddzielnym reakcjom PCR (3 x 50 μL).
   W przypadku polimerazy DNA Pfu zalecana prędkość w fazie elongacji wynosi 1 kb/min. W niniejszym przypadku całkowita długość genów N1-391 i P1-126 jest krótsza niż 2,0 kb. W związku z tym do etapu elongacji wykorzystano czas 2 minut.

7. Połącz wektor z insertem DNA.
   1. Produkt reakcji overlap PCR poddać działaniu polimerazy DNA T4 zgodnie z protokołem opisanym w punkcie 1.3.
   2. Przeprowadź annealing wektora LIC oraz produktu PCR zgodnie z protokołem opisanym w kroku 1.4.
   3. Zidentyfikować pozytywne konstrukty zgodnie z protokołem opisanym w kroku 1.5.

2. Ekspresja i oczyszczanie białek

UWAGA: Do dwucistronowej konstrukcji do koekspresji białek N i P należy użyć E. coli. Komórki należy hodować w temperaturze 37 °C, natomiast ekspresję przeprowadzić w obniżonej temperaturze (16 °C) przez noc. Kompleksy białkowe należy oczyścić, stosując kombinację chromatografii na kolumnie kobaltowej, wymiany jonowej oraz wykluczania molekularnego (Rycina 2).

1. Do produkcji białka należy użyć szczepu E. coli BL21(DE3). Hodować 4 L kultur komórkowych w temperaturze 37 °C w medium LB (Luria Broth) do momentu osiągnięcia OD₆₀₀ na poziomie 0,6.
2. Obniżyć temperaturę do 16 °C. Po godzinie indukować ekspresję za pomocą 0,5 mM izopropyl-β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) przez noc.
3. Wirować komórki z prędkością 4 104 x g przez 25 min, a następnie odrzucić nadsącz.
4. Resuspender osad komórkowy w 200 mL buforu lizującego A (50 mM fosforanu sodu, pH 7,4, 500 mM NaCl, 5 mM imidazolu, 10% glicerolu i 0,2% NP40). Należy użyć 50 mL buforu lizującego do resuspensji osadu komórkowego z 1 L kultury komórkowej.

5. Lizować komórki za pomocą sonikacji przez 15 min (cykle: 3 sekundy pracy, 3 sekundy przerwy). Następnie wirować komórki z prędkością 37 888 x g przez 40 min.

   UWAGA: Protokół można wstrzymać, zamrażając komórki przed sonikacją w zamrażarce o temperaturze -80 °C.

6. Nałożyć nadsącz na kobaltową kolumnę grawitacyjną (średnica x długość: 2,5 cm x 10 cm) zawierającą ~10 mL kulek uprzednio równoważonych 5–10 objętościami kolumny (CV) buforu lizującego.
7. Przemyć kolumnę 5 CV buforu B (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 1 M NaCl, 10% glicerolu i 5 mM imidazolu) oraz 5 CV buforu C (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 500 mM NaCl, 10% glicerolu i 5 mM imidazolu).
8. Eluować białko z kulek, używając 2 CV buforu D (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 500 mM NaCl i 250 mM imidazolu).
9. Rozcieńczyć elłowane białko 5-krotnie buforem QA (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 5% glicerolu) przed nałożeniem na kolumnę Q.
10. Przemyć 5 mL kolumny Q buforem QA w celu jej zrównoważenia, a następnie nałożyć rozcieńczoną próbkę na kolumnę Q przy użyciu pompy perystaltycznej (np. Rabbit).
11. Zamontować kolumnę Q w urządzeniu HPLC wraz z buforem QA i buforem QB (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 1,5 M NaCl, 5% glicerolu). Ustawić szybkość przepływu na 1 mL/min.
12. Uruchomić program „pump wash”, aby przemyć urządzenie buforem QB, a następnie buforem QA (po 1–2 CV każdego z nich). Ustawić przepływ systemu na 3 mL/min.
13. Ustawić detektor UV1 na 280 nm, a UV2 na 260 nm. Do zbierania frakcji użyć 96-dołkowej płytki głębokiej.
14. Eluować białka za pomocą stopniowego gradientu czynnika eluującego (bufor QB), stosując 3–4 CV każdego stężenia i zwiększając procent zawartości o 5% w każdym kroku, zaczynając od 0% QB. Kompleks białkowy N0P zostanie wypłukany przy 15% buforu QB.
15. Po eluowaniu całego białka przemyć kolumnę 100% buforem QB (2 CV).
16. Wyizolować białko za pomocą filtracji żelowej na kolumnie Superdex 200 Increase 10/300 GL (średnica x długość: 1,0 cm x 30 cm) zrównoważonej buforem E (20 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego lub HEPES pH 7,4 oraz 200 mM NaCl).
17. Przeanalizować frakcje zawierające białko za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE).

3. Montaż in vitro specyficznych dla wirusa nukleokapsydów (NC)

UWAGA: Montaż in vitro NC specyficznego dla RSV (N:RNA) przeprowadzono poprzez inkubację przygotowanego kompleksu N0P z oligonukleotydami RNA. Następnie wykorzystano chromatografię wykluczania cząsteczek (SEC) w celu oddzielenia kompleksu montażowego od N0P i nadmiaru RNA (Ryc. 2).

1. Wymieszać i inkubować oczyszczony kompleks N0P z RNA oligo w stosunku molowym 1:1,5 w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę; zazwyczaj 1 mL białka N0P o stężeniu 1 mg/mL jest wystarczające dla kolejnego etapu. Przygotować próbkę kontrolną, zawierającą jedynie tę samą ilość białka N0P.
2. Wstępnie równoważyć kolumnę do filtracji żelowej Superdex 200 Increase 10/300 GL buforem E (20 mM HEPES, pH 7,4, 200 mM NaCl).
3. Wirować próbkę z prędkością 21 130 ×g przez 15 min, usunąć wszelkie osady i nałożyć supernatant na kolumnę SEC.
4. Porównać obrazy z chromatografii SEC dla próbki kompleksu N:RNA oraz próbki kontrolnej N0P, uwzględniając stosunek A260/A280 w celu zidentyfikowania, które piki odpowiadają zmontowanemu N-RNA, N0P oraz wolnemu RNA.
5. Zebrać frakcje piku, przeprowadzić elektroforezę SDS-PAGE lub przygotować siatki do mikroskopii.
6. W przypadku zmontowanego kompleksu N-RNA zebrać wszystkie frakcje piku N-RNA, przeprowadzić ekstrakcję RNA i wykonać elektroforezę Urea-PAGE, aby ponownie sprawdzić długość specyficznego RNA, która powinna być taka sama jak w przypadku RNA użytego do mieszania i inkubacji w pierwszym kroku.

Wyniki

Rycina 1. Ilustracja konstrukcji plazmidów. A. Konstrukcja RSV N1-391; B. Konstrukcja RSV P1-126; C. Konstrukcja bicistroniczna do koekspresji N1-391 i P1-126. Pierwszy gen RSV N1-391, drugi gen RSV P1-126, gen oporności na antybiotyk (AmpR) oraz promotory są wyróżnione odpowiednio w żółtych, cyjanowych, różowych i pomarańczowych ramkach. Podsumowując, inserty genowe RSV N1-391 oraz RSV P1-126 zostały skonstruowane oddzielnie, a następnie zmontowane.

Rysunek 2. Schemat blokowy oczyszczania kompleksu białkowego N1-391P1-126. Przedstawia on proces inokulacji i wielkoskalowej hodowli kultur komórek E. coli oraz zbieranie komórek poprzez wirowanie. Następnie, po lizie komórek, próbki białek są oczyszczane za pomocą chromatografii powinowactwa (tzn. kolumny Co2+), chromatografii wymiany jonowej (tzn. kolumny Q) oraz chromatografii żelowej z wykluczaniem cząsteczek (SEC). Próbki białek są następnie analizowane za pomocą żelu SDS-PAGE.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agarose	SIgma	A9539-500G	tworzenie konstruktu metodą LIC
Sód ampicyliny	GOLD BIOTECHNOLOGY	5118.111317A	antybiotyk do hodowli komórkowych
AseI	NEB	R0526S	tworzenie konstruktu metodą LIC
Kuleczki agarozowe z kobaltem (wysokiej gęstości)	Gold Bio	H-310-500	Do oczyszczania białek z His-tagiem
Corning LSE Digital Dry Bath Heater	CORNING	6885-DB	Podgrzewanie próbki
dCTP	Invitrogen	10217016	tworzenie konstruktu metodą LIC
dGTP	Invitrogen	10218014	tworzenie konstruktu metodą LIC
Glicerol	Sigma	G5516-4L	przygotowanie roztworu
HEPES	Sigma	H3375-100G	przygotowanie roztworu
HiTrap Q HP	Sigma	GE29-0513-25	Oczyszczanie białek
Imidazol	Sigma	I5513-100G	przygotowanie roztworu
IPTG (Izopropyl-beta-D-tiogalaktopiranozyd)	GOLD BIOTECHNOLOGY	1116.071717A	indukcja ekspresji białka
Probówki do mikrocentryfugi	VWR	47730-598	do PCR
Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid Processor	SpectraLab	MSX-XL-2020	sonikator do lizy komórek
New Brunswick Innova 44/44R	eppendorf	M1282-0000	Inkubator wytrząsany do hodowli komórek
Zamiennik Nonidet P 40	Sigma	74385-1L	przygotowanie roztworu
OneTaq DNA Polymerase	NEB	M0480L	PCR
QIAquick Gel Extraction Kit	QIAGEN	28706	Oczyszczanie DNA
SSPI-HF	NEB	R3132S	tworzenie konstruktu metodą LIC
Superose 6 Increase 10/300 GL	Sigma	GE29-0915-96	Oczyszczanie białek
T4 DNA polymerase	Sigma	70099-3	tworzenie konstruktu metodą LIC
Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Centrifuge	Fisher Scientific	36-101-0816	Wirówka, prędkość maksymalna 20,000 rpm
Trizma hydrochloride	Sigma	T3253-250G	przygotowanie roztworu