Zastosowanie reaktorów z przepływem kroplowym i obrotowym dyskiem do analizy biofilmu Staphylococcus aureus

Summary

Szczegółowo przedstawiono protokoły wykorzystania biofilmów przepływowych w systemie otwartym z reaktorami przepływowymi i reaktorami z obrotowym dyskiem.

Abstract

Uważa się, że większość mikrobów w naturze istnieje jako społeczności związane z powierzchnią w biofilmach. ¹ Biofilmy bakteryjne są zamknięte w matrycy i przyczepione do powierzchni. ² Tworzenie i rozwój biofilmu są powszechnie badane w laboratorium przy użyciu systemów wsadowych, takich jak płytki do mikromiareczkowania, lub systemów przepływowych, takich jak komory przepływowe. Metodologie te są przydatne do badań przesiewowych zmutowanych i bibliotek chemicznych (płytki do mikromiareczkowania)³ lub do hodowli biofilmów w celu wizualizacji (komórki przepływowe)⁴. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe protokoły hodowli Staphylococcus aureus w dwóch dodatkowych typach biofilmów systemu przepływowego: reaktorze biofilmu z przepływem kroplowym i reaktorze biofilmu z obrotowym dyskiem.

Reaktory biofilmu z przepływem kroplowym są przeznaczone do badania biofilmów hodowanych w warunkach niskiego ścinania. ⁵ Reaktor przepływowy kroplowy składa się z czterech równoległych kanałów testowych, z których każdy może pomieścić jeden standardowy szklany mikroskop wielkości szkiełka mikroskopowego lub odcinek cewnika lub wsuwki. Reaktor z przepływem kroplowym jest idealny do monitorowania mikroczujników, ogólnych badań biofilmu, próbek kriosekcji biofilmu, produkcji wysokiej biomasy, oceny materiałów medycznych i testowania urządzeń medycznych na miejscu. ^6,7,8,9

Obrotowy reaktor dyskowy składa się z teflonowego dysku zawierającego wgłębienia na wymienne kupony. ¹⁰ Wymienne kupony mogą być wykonane z dowolnego materiału nadającego się do obróbki. Dno obracającego się dysku zawiera magnes sztabkowy, który umożliwia obrót dysku w celu wytworzenia ścinania powierzchni cieczy na kuponach spłukiwanych powierzchniowo. Cały dysk zawierający 18 kuponów umieszczony jest w szklanym zbiorniku reaktora z bocznym ramieniem o pojemności 1000 ml. Płynna pożywka wzrostowa krąży w naczyniu, podczas gdy dysk jest obracany przez mieszadło magnetyczne. Kupony są wyjmowane ze zbiornika reaktora, a następnie zeskrobywane w celu pobrania próbki biofilmu do dalszych badań lub obrazowania mikroskopowego. Reaktory z obrotowym dyskiem są przeznaczone do laboratoryjnych ocen skuteczności biocydów, usuwania biofilmu i wydajności materiałów przeciwporostowych. ^9,11,12,13

Protocol

1. Reaktor biofilmu z przepływem kroplowym

1. Reaktor biofilmu z przepływem kroplowym (dostępny w firmie Biosurface Technologies lub wersje zaprojektowane na zamówienie mogą być zwykle wykonane przez uniwersyteckie warsztaty mechaniczne, patrz rysunek 1) jest montowany i sterylizowany w autoklawie. Montaż polega na umieszczeniu kuponów w komorach oraz zabezpieczeniu pokryw komór. Komora wraz z podłożem biofilmowym (bulion sojowy tryptyczny 2 gramy/L i glukoza 2 gramy/L) oraz rurki doprowadzające składniki odżywcze są sterylizowane przez autoklawowanie.
2. Zaszczepianie reaktora z przepływem kroplowym odbywa się poprzez umieszczenie reaktora na płaskiej powierzchni, zaciśnięcie przewodów odprowadzających, napełnienie każdej komory 10 ml tryptycznego bulionu sojowego i dodanie 10 μl kultury S. aureus wyhodowanej przez noc w tryptycznym bulionie sojowym. Zaszczepiony reaktor umieszcza się następnie w inkubatorze o temperaturze 37°C na 18 godzin.
3. Po 18 godzinach inkubacji rurki odprowadzające ścieki są odkręcane, a reaktor umieszcza się na drewnianym klocku przyciętym pod kątem 10°.
4. W asepcie podłączyć rurkę doprowadzającą pożywkę do butelki zawierającej bulion z pożywką o ciągłym przepływie. Przeprowadź przewód rurowy przez pompę i zalej rurki, uruchamiając pompę z maksymalną prędkością (będzie się różnić w zależności od modelu pompy).
5. Po zalaniu rurki doprowadzającej zatrzymaj pompę i przymocuj igły łączące (rozmiar 22, 1 cal) do końca każdej rurki. Przetrzeć korek wlotu komory chusteczką na etanol i aseptycznie wprowadzić igły przez korek wlotowy.
6. Włącz pompę i pozwól, aby media powoli kapały (natężenie przepływu ~125 μL/minutę) na kupony. Media powinny spływać w dół wzdłuż kuponu od portu korka wlotowego do portu odpływowego. Eksploatuj reaktor w ciągłym przepływie przez 2-5 dni (w zależności od zastosowania), od czasu do czasu sprawdzając reaktor pod kątem prawidłowego drenażu.
7. Aby zebrać biofilmy reaktora z przepływem kroplowym, zatrzymaj pompę i ostrożnie wyjmij igły z reaktora. Reaktor można następnie umieścić na płaskiej powierzchni, a kupony można usunąć w asepcie za pomocą sterylnych kleszczy. Jeśli pożądana jest mikroskopia, kupony można teraz odpowiednio przetworzyć (rysunek 2B to skaningowy mikroskop elektronowy biofilmu S. aureus wyhodowanego w kroplowym reaktorze biofilmu). Jeśli celem badania jest ilościowe określenie biomasy biofilmu lub badania fizjologiczne, biofilm można usunąć z kuponu za pomocą skrobaka komórkowego. Trzymając kupony kleszczami, delikatnie zeskrob biofilm z kuponu do stożkowej probówki zawierającej sól fizjologiczną buforowaną fosforanami za pomocą skrobaka do komórek. Uwaga: w celu ilościowego określenia jednostek tworzących kolonie w biofilmach konieczne jest homogenizowanie zebranych biofilmów za pomocą homogenizatora tkankowego w celu rozdrobnienia grudek i utworzenia jednorodnej zawiesiny. Do tego zastosowania nadają się różne modele homogenizatorów tkankowych. Używamy homogenizatora Fisher Scientific Tissuemiser (produkt # 15-338-420) z pełną prędkością przez 1 minutę do homogenizacji próbek biofilmu. Brak homogenizacji biofilmu spowoduje niedoszacowanie jednostek tworzących kolonie obecnych w próbce.

2. Reaktor biofilmu z obrotowym dyskiem

1. Reaktor biofilmu z obrotowym dyskiem (dostępny w wersji dostępnej w Biosurface Technologies lub wykonany na zamówienie, patrz rysunek 3) jest montowany i sterylizowany w autoklawie. Zmontuj reaktor, najpierw umieszczając kupony wirującego dysku w szczelinach obracającego się dysku i umieszczając go w 1-litrowej szklanej zlewce z portem przelewowym. Jako nasadkę reaktora służy 15-gumowy korek z wywierconymi w nim otworami umożliwiającymi przepływ i napowietrzanie mediów. Reaktor, pożywki biofilmowe (bulion sojowy tryptyczny 2 g/l i glukoza 2 g/l) oraz rurki wlotowe są następnie sterylizowane przez autoklawowanie.
2. Reaktor biofilmu z obrotowym dyskiem zaszczepia się poprzez umieszczenie 250 ml sterylnego podłoża w reaktorze i dodanie 0,5 ml nocnej kultury S. aureus wyhodowanej w tryptycznym bulionie sojowym. Reaktor jest następnie umieszczany na płytce mieszającej ustawionej na 250 obr./min i inkubowany przez noc w żądanej temperaturze.
3. Po 16 godzinach inkubacji podłącz rurkę doprowadzającą do portu na zbiorniku pożywki i podłącz ją do pompy perystaltycznej. Następnie włącza się pompę, a przepływ ustawia się na ~0,25 ml/min (przepływ można zmieniać w zależności od pożądanej szybkości wzrostu).
4. Po 24 godzinach zatrzymać reaktor i aseptycznie usunąć dysk, nie dotykając odcinków biofilmu. Usuń kupony za pomocą sterylnych kleszczy i zanurz każdy z nich w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, aby usunąć luźno przyczepione bakterie.
5. W celu badania związków przeciwdrobnoustrojowych chipy można umieścić w indywidualnych dołkach 96-dołkowej płytki zawierającej interesujące związki. Po inkubacji wióry przenosi się do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml zawierających 1 ml soli fizjologicznej w buforze fosforanowym i homogenizuje się homogenizatorem tkankowym w celu rozproszenia nienaruszonego biofilmu.
6. Komórki są następnie seryjnie rozcieńczane i posiewane na pożywce agarowej w celu określenia żywotnych jednostek tworzących kolonie.
7. Uwaga: powyższy protokół może być interpretowany w wielu wariantach. Na przykład kupony z wirującym dyskiem mogą być pokryte potencjalnymi związkami przeciwdziałającymi biofilmowi lub wykonane z nich w celu przetestowania skuteczności. Dyspergatory biofilmu można również oceniać jako kupony inkubacyjne w związkach dyspergujących i określając ilościowo bakterie przyłączone i oderwane.

3. Reprezentatywne wyniki

Przykład ustawionego reaktora kropelkowego jest pokazany, jeśli Rysunek 1. Po trzech dniach przepływu na powierzchni kuponu zgromadzą się duże ilości biofilmu, Rysunek 2A. Całkowita biomasa będzie się różnić w zależności od szczepów bakterii i dokładnych warunków wzrostu. Skaningowy mikroskop elektronowy biofilmu S. aureus wyhodowanego w reaktorze kroplowym pokazano na rysunku 2B.

Obrotowy reaktor dyskowy jest pokazany na rysunku 3A. Opisany protokół można dostosować do specyficznych wymagań zasadniczo każdego mikroorganizmu zdolnego do tworzenia biofilmu. Rysunek 3B przedstawia obracający się dysk z przymocowanymi 18 plastikowymi dyskami. Te biofilmy hodowane na dysku szczególnie dobrze nadają się do testów przeciwdrobnoustrojowych i dają wysoce powtarzalne wyniki¹¹.

Rysunek 1. Konfiguracja reaktora z przepływem kroplowym. Ważne komponenty są oznaczone.

Rysunek 2. Przykład biofilmu S. aureus z przepływem kroplowym. A) Ten biofilm był hodowany przez trzy dni zgodnie z opisanym protokołem. Pokrywy z pierwszych dwóch komór reaktora są usuwane, aby pokazać żółtą biomasę biofilmu S. aureus. B) Mikrofotografia elektronowa biofilmu S. aureus wyhodowanego w reaktorze kroplowym.

Rysunek 3. Reaktor z obrotowym dyskiem. A) Przykład działającego reaktora z wirującym dyskiem. Kluczowe komponenty są oznaczone. B) Zbliżenie na obracający się dysk.

Discussion

Biofilmy hodowane w różnych reaktorach często mają różne cechy, a każdy reaktor ma inne zastosowania. W niniejszej pracy opisano zastosowanie dwóch reaktorów biofilmu: reaktora biofilmu z przepływem kroplowym i reaktora z dyskiem obrotowym. Reaktory z przepływem kroplowym są przydatne do hodowli biofilmów o niskim ścinaniu na granicy faz powietrze-ciecz i można je dostosować do różnych warunków. Uważamy, że są one niezwykle wygodne w badaniach, w których pożądana jest duża ilość biomasy biofilmu. Taką konfigurację moż...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktory z przepływem kroplowym	BioSurface Technologies Corporation	DFR 110
Reaktory z obrotowym dyskiem	BioSurface Technologies Corporation