Wykorzystanie reaktorów przepływowych kropelkowych oraz reaktorów z obracającym się dyskiem do analizy biofilmu Staphylococcus aureus

Podsumowanie

Szczegółowo przedstawiono protokoły wykorzystania biofilmów w otwartych systemach przepływowych z zastosowaniem reaktorów z przepływem kropelkowym oraz reaktorów z obracającym się dyskiem.

Streszczenie

Uważa się, że większość mikroorganizmów w naturze występuje w postaci wspólnot związanych z powierzchnią w obrębie biofilmów.¹ Biofilmy bakteryjne są zamknięte w macierzy i przytwierdzone do powierzchni.² Tworzenie i rozwój biofilmów są powszechnie badane w laboratorium z wykorzystaniem systemów okresowych, takich jak płytki mikrotitracyjne, lub systemów przepływowych, takich jak komory przepływowe. Metodologie te są przydatne do przesiewania bibliotek mutantów i związków chemicznych (płytki mikrotitracyjne)³ lub hodowli biofilmów do celów wizualizacji (komory przepływowe)⁴. W niniejszej pracy przedstawiamy szczegółowe protokoły hodowli Staphylococcus aureus w dwóch dodatkowych typach przepływowych systemów do hodowli biofilmów: kroplowym reaktorze biofilmowym oraz reaktorze biofilmowym z obracającym się dyskiem.

Reaktory biofilmu z przepływem kropelkowym są przeznaczone do badania biofilmów hodowanych w warunkach niskiego ścinania.⁵ Reaktor z przepływem kropelkowym składa się z czterech równoległych kanałów testowych, z których każdy może pomieścić jeden kupon w rozmiarze standardnego szkiełka przedmiotowego, fragment cewnika lub stentu. Reaktor z przepływem kropelkowym jest idealny do monitorowania za pomocą mikrosensorów, ogólnych badań biofilmów, przygotowywania próbek do kriosekcjonowania biofilmu, wysokiej produkcji biomasy, oceny materiałów medycznych oraz testowania implantowanych urządzeń medycznych.^6,7,8,9

Reaktor z obracającym się dyskiem składa się z teflonowego dysku zawierającego wgłębienia na wymienne kupony.¹⁰ Wymienne kupony mogą być wykonane z dowolnego materiału poddającego się obróbce skrawaniem. W dolnej części obracającego się dysku znajduje się magnes trwały, który umożliwia rotację dysku, wytwarzając ścinanie powierzchni cieczy nad kuponami zlicowanymi z powierzchnią. Cały dysk zawierający 18 kuponów jest umieszczany w szklanym naczyniu reaktora z bocznym wylotem o pojemności 1000 mL. Przez naczynie przepompowywane jest ciekłe medium wzrostowe, podczas gdy dysk jest obracany za pomocą mieszadła magnetycznego. Kupony są wyjmowane z naczynia reaktora, a następnie skrobane w celu pobrania próbki biofilmu do dalszych badań lub obrazowania mikroskopowego. Reaktory z obracającym się dyskiem są przeznaczone do laboratoryjnej oceny skuteczności biocydów, usuwania biofilmu oraz właściwości materiałów przeciwdziałających osadzaniu (anti-fouling).^9,11,12,13

Protokół

1. Reaktor biofilmu z przepływem kropelkowym

1. Reaktor biofilmu z przepływem kroplowym (dostępny w firmie Biosurface Technologies lub wersje projektowane na zamówienie, które zazwyczaj mogą zostać wykonane w uniwersyteckich warsztatach mechanicznych, patrz Rysunek 1) zostaje złożony i autoklawowany. Montaż polega na przymocowaniu kuponów w komorach i zabezpieczeniu pokryw komór. Komora, wraz z pożywką do biofilmu (bulion sojowo-tryptykowy 2 g/L i glukoza 2 g/L) oraz rurkami doprowadzającymi składniki odżywcze, są sterylizowane w autoklawie.
2. Inokulacja reaktora z przepływem kroplowym jest przeprowadzana poprzez ustawienie reaktora na płaskiej powierzchni, zaklemowanie linii rurek odpływowych, napełnienie każdej komory 10 mL bulionu sojowo-tryptykowego i dodanie 10 μL kultury S. aureus hodowanej przez noc w bulionie sojowo-tryptykowym. Zainokulowany reaktor jest następnie umieszczany w inkubatorze w temperaturze 37°C na 18 godzin.
3. Po 18 godzinach inkubacji rurki odpływowe zostają odblokowane, a reaktor jest ustawiany na drewnianym bloku dociętym pod kątem 10°.
4. Aseptycznie podłącz rurkę doprowadzającą składniki odżywcze do butelki zawierającej bulion odżywczy do przepływu ciągłego. Przeciągnij linię rurek przez pompę i zapowietrz rurki, uruchamiając pompę z maksymalną prędkością (różni się ona w zależności od modelu pompy).
5. Po zapowietrzeniu rurki doprowadzającej zatrzymaj pompę i przymocuj igły łączące (rozmiar 22G, 1 cal) do końca każdej rurki. Przetrzyj korek wlotowy komory chusteczką nasączoną etanolem i aseptycznie wprowadź igły przez korek wlotowy.
6. Włącz pompę i pozwól pożywce powoli kapać (szybkość przepływu ~125 μL/minuta) na kupony. Pożywka powinna spływać w dół wzdłuż kuponu od otworu korka wlotowego do otworu odpływowego. Eksploatuj reaktor w przepływie ciągłym przez 2-5 dni (w zależności od zastosowania), okresowo sprawdzając, czy w reaktorze zachodzi prawidłowy odpływ.
7. Aby zebrać biofilmy z reaktora z przepływem kroplowym, zatrzymaj pompę i ostrożnie wyjmij igły z reaktora. Reaktor można następnie ustawić na płaskiej powierzchni, a kupony aseptycznie usunąć za pomocą sterylnej pincety. Jeśli planowana jest mikroskopia, kupony można teraz odpowiednio przetworzyć (Rysunek 2B przedstawia mikrofotografię z elektronowego mikroskopu skanującego biofilmu S. aureus wyhodowanego w reaktorze biofilmu z przepływem kroplowym). Jeśli celem badania jest ilościowe określenie biomasy biofilmu lub badania fizjologiczne, biofilm można usunąć z kuponu za pomocą skrobaka do komórek. Trzymając kupony pincetą, delikatnie zeskrob biofilm z kuponu do probówki stożkowej zawierającej roztwór soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, używając skrobaka do komórek. Uwaga: aby określić liczbę jednostek tworzących kolonie w biofilmach, konieczne jest zhomogenizowanie zebranych biofilmów za pomocą homogenizatora do tkanek w celu rozbicia grudek i utworzenia jednorodnej zawiesiny. Do tego zastosowania nadają się różne modele homogenizatorów do tkanek. My wykorzystujemy homogenizator Fisher Scientific Tissuemiser (produkt nr 15-338-420) przy pełnej prędkości przez 1 minutę w celu zhomogenizowania próbek biofilmu. Brak homogenizacji biofilmu spowoduje niedoszacowanie liczby jednostek tworzących kolonie obecnych w próbce.

2. Rotacyjny dyskowy bioreaktor biofilmu

1. Reaktor biofilmu z obracającym się dyskiem (dostępny w Biosurface Technologies lub wykonany na zamówienie, patrz Rycina 3) zostaje zmontowany i autoklawowany. Montaż reaktora polega na umieszczeniu kuponów dysku obrotowego w szczelinach dysku obrotowego, a następnie umieszczeniu go w 1-litrowym zlewce szklanym z otworem przelewowym. Jako zatyczka reaktora stosowany jest gumowy korek nr 15 z wywierconymi otworami umożliwiającymi przepływ pożywki i napowietrzanie. Następnie reaktor, pożywka do biofilmu (bulion sojowo-kazeinowy 2 g/L i glukoza 2 g/L) oraz rurki doprowadzające są sterylizowane w autoklawie.
2. Reaktor biofilmu z obracającym się dyskiem zostaje zaszczepiony poprzez wlanie 250 mL sterylnej pożywki do reaktora i dodanie 0,5 mL nocnej kultury S. aureus hodowanej w bulionie sojowo-kazeinowym. Reaktor jest następnie umieszczany na mieszadle magnetycznym ustawionym na 250 rpm i inkubowany przez noc w pożądanej temperaturze.
3. Po 16 godzinach inkubacji podłącz rurkę doprowadzającą do portu w zbiorniku z pożywką, a następnie do pompy perystaltycznej. Następnie uruchamia się pompę i ustawia przepływ na ~0,25 mL/min (przepływ można zmieniać w zależności od pożądanej szybkości wzrostu).
4. Po 24 godzinach zatrzymaj reaktor i aseptycznie wyjmij dysk, nie dotykając kuponów biofilmu. Wyjmij kupony za pomocą sterylnej pęsety i zanurz każdy z nich w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym, aby usunąć luźno przytwierdzone bakterie.
5. W celu testowania związków przeciwdrobnoustrojowych chipy można umieścić w poszczególnych studzienkach płytki 96-dołkowej zawierającej badane związki. Po inkubacji chipy przenosi się do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL zawierających 1 mL soli fizjologicznej z buforem fosforanowym i homogenizuje za pomocą homogenizatora tkankowego, aby rozproszyć nienaruszony biofilm.
6. Następnie komórki poddaje się rozcieńczeniom seryjnym i wysiewa na pożywkę agarową Nutrient Agar w celu oznaczenia żywych jednostek tworzących kolonie.
7. Uwaga: powyższy protokół można modyfikować na wiele sposobów. Na przykład kupony dysku obrotowego można powlekać potencjalnymi związkami przeciwbiofilmowymi lub wykonywać z nich, aby przetestować ich skuteczność. Można również oceniać środki rozpraszające biofilm, inkubując kupony w związkach rozpraszających i kwantyfikując bakterie przytwierdzone w stosunku do oderwanych.

3. Reprezentatywne wyniki

Przykład przygotowanego reaktora przepływowego typu kropelkowego przedstawiono na rysunku 1. Po trzech dniach przepływu na powierzchni kuponu nagromadzą się znaczne ilości biofilmu, rysunek 2A. Całkowita biomasa będzie się różnić w zależności od szczepów bakteryjnych i dokładnych warunków wzrostu. Mikrografia z elektronowego mikroskopu skaningowego biofilmu S. aureus wyhodowanego w reaktorze przepływowym typu kropelkowego przedstawiona jest na rysunku 2B.

Reaktor z obracającym się dyskiem przedstawiono na rysunku 3A. Opisany protokół można dostosować do konkretnych wymagań niemal każdego mikroorganizmu zdolnego do tworzenia biofilmu. Rysunek 3B przedstawia wirujący dysk z przymocowanymi 18 plastikowymi dyskami. Biofilmy hodowane na takich dyskach są szczególnie odpowiednie do testów przeciwdrobnoustrojowych i dają wysoce powtarzalne wyniki¹¹.

Rysunek 1. Układ reaktora przepływowego kroplowego. Oznaczono najważniejsze komponenty.

Rycina 2. Przykład biofilmu S. aureus w przepływie kropelkowym. A) Biofilm ten był hodowany przez trzy dni zgodnie z opisanym protokołem. Pokrywy z dwóch pierwszych komór reaktora zostały zdjęte, aby ukazać żółtą biomasę biofilmu S. aureus. B) Skaningowa mikrografia elektronowa biofilmu S. aureus wyhodowanego w reaktorze z przepływem kropelkowym.

Rycina 3. Reaktor z obracającym się dyskiem. A) Przykład działającego reaktora z wirującym dyskiem. Oznaczono kluczowe komponenty. B) Zbliżenie na wirujący dysk.

Dyskusja

Biofilmy hodowane w różnych reaktorach często wykazują odmienne charakterystyki, a każdy reaktor znajduje zastosowanie w innych obszarach. W niniejszej pracy opisujemy zastosowanie dwóch reaktorów do biofilmu: reaktora kroplowego (drip flow biofilm reactor) oraz reaktora z obracającym się dyskiem. Reaktory kroplowe są użyteczne do hodowli biofilmów o niskim ścinaniu na granicy fazy powietrze-ciecz i można je dostosować do różnych warunków. Okazują się one niezwykle wygodne w badaniach, w których pożądana jest duża ilość ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Reaktory przepływowe kropelkowe	BioSurface Technologies Corporation	DFR 110
Reaktory z dyskiem obrotowym	BioSurface Technologies Corporation