Film demonstruje wykrywanie pośredników dsRNA wirusa Zika w zainfekowanych komórkach nabłonkowych przy użyciu immunocytochemii. Zainfekowane komórki są utrwalane, a następnie blokowane za pomocą roztworu blokującego. Następnie dodaje się przeciwciała pierwotne i wtórne. Jądra komórkowe są barwione barwnikiem fluorescencyjnym. Oznakowane dsRNA wirusa jest następnie obserwowane pod mikroskopem fluorescencyjnym.
Artykuł metodologiczny
Wykrywanie pośredników replikacji dsRNA wirusa Zika z wykorzystaniem immunocytochemii
14 wyświetleń
⸱
30 września 2026
W tym artykule
Streszczenie
Protokół
1. Analiza replikacji genomu wirusa Zika
- Wysiać naiwne komórki Vero w zagęszczeniu 1 x 105 komórek na studzienkę w objętości 2 ml przy użyciu płytki 12-dołkowej. Następnego dnia przygotować inokulaty wirusowe (wielokrotność infekcji (MOI) 0,01 i 0,1; 400 µl/wello niskim i wysokim mianie, wykorzystując medium bezsurowicze w trzech powtórzeniach. W przypadku infekcji pozorowanej należy zastosować wyłącznie medium bezsurowicze (400 µl/well) tylko.
- Inkubować zaszczepioną płytkę w 37 °C z 5% CO22 przez 4–6 godz. Rozprowadzić inokulum, delikatnie przechylając płytkę na boki co godzinę.
- Po zakończeniu inkubacji zastąpić inokulum pożywką z dodatkiem surowicy (2 ml na dołek).
- W punktach czasowych 48 i 96 godzin pobrać próbki do immunocytochemii (ICC).
- Przeprowadź immunocytochemię (ICC) przy użyciu komórek utrwalonych metanolem.
- Umyć utrwalone komórki trzykrotnie 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS) i zablokować buforem blokującym do ICC (3% surowicy koziej, 3% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 0,1% Triton-x 100 w PBS).
- Użyj mysiego monoklonalnego przeciwciała anty-dsRNA J2 (1 µg/ml) w rozcieńczeniu 1:100 w buforze blokującym i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
- Przemyć komórki 1x PBS i dodać przeciwciało wtórne kozie anty-mysie IgG-594 (1 µg/ml) w rozcieńczeniu 1:1000 w buforze blokującym i inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.
- Przemyć komórki 1x PBS, zabarwić jądra komórkowe barwnikiem Hoechst, a następnie poddać komórki obserwacji przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego z powiększeniem 100X (Rycina 1).
Wyniki
Rysunek 1: Analizy służące do oceny replikacji wirusa Zika (ZIKV). (A) Wykres przedstawia zawartość genomu wirusa Zika zmierzoną za pomocą ilościowej reakcji PCR z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR). Zarówno primery pan-genotypowe (ZIKV GEN), jak i dla szczepu PRVABC59 (ZIKV UNI) wykazały taką samą czułość i swoistość. Zgodnie z oczekiwaniami, primery dla wirusa zapalenia wątroby C (HCV) nie amplifikowały żadnego produktu. (B) Wykres przedstawia kinetykę wzrostu wirusa Zika w określonych punktach czasowych w komórkach zainfekowanych niskim i wysokim mianem w porównaniu do niezinfekowanej kontroli pozornej (mock). Podano wartości średnie oraz odchylenia standardowe. (C) Analiza immunocytochemiczna w celu zbadania replikacji wirusa. Komórki zainfekowane wirusem Zika zostały specyficznie zabarwione przeciwciałami przeciwko dsRNA. W 48 hpi zainfekowane komórki tworzą kilka skupisk, natomiast w 96 hpi zainfekowana jest większość komórek. Do wizualizacji jąder zastosowano barwienie Hoechst (skala = 50 µm). BF: obraz w polu jasnym.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma Life Science | D5796 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Mysie przeciwciało monoklonalne anty-dsRNA J2 | English & Scientific Consulting Kft. | 10010200 | |
| Kozie przeciwciało anty-rabbit IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11020 | |
| Linia komórkowa Vero | ATCC | CCL-81 | |
| Szczep wirusa Zika PRVABC59 | Centers for Disease Control and Prevention (CDC) | ||
| Mikroskop immunofluorescencyjny Nikon Eclipse Ti z Nikon Intenselight C-HGFI | Nikon | Visit Nikon for Request |
