Koncentracja i oczyszczanie cząsteczek wirusowych

Streszczenie

Źródło: Fricano-Kugler, C. J., et al. Designing, Packaging, and Delivery of High Titer CRISPR Retro and Lentiviruses via Stereotaxic Injection. J. Vis. Exp. (2016).

W niniejszym filmie zaprezentowano krok po kroku proces zagęszczania i oczyszczania cząstek lentiwirusowych z mieszaniny zawierającej szczątki komórek gospodarza. Procedura wykorzystuje wirowanie, filtrację oraz wytrącanie solą i PEG w celu wyizolowania cząstek wirusa przy jednoczesnym usunięciu rozpuszczalnych zanieczyszczeń. Produkt końcowy zostaje resuspendowany w buforze i przechowywany w ultra-niskich temperaturach, aby zachować zakaźność wirusa oraz jego integralność strukturalną.

Protokół

1. Zagęszczanie i oczyszczanie wirusa

1. Przygotować 5x roztwór glikolu polietylenowego 6000, dodając 40% glikol polietylenowy 6000 oraz 1,5 M NaCl do ddH₂O. Autoklawować roztwór w cyklu dla cieczy przez 45 min w temperaturze 121 °C. Powoli mieszać roztwór podczas chłodzenia.
   UWAGA: Roztwór początkowo będzie mętny, a następnie stanie się klarowny w miarę stygnięcia.
2. Wirować probówkę stożkową o pojemności 50 ml zawierającą obie porcje supernatantu wirusowego przy 2 000 x g przez 10 min w celu osadzenia materiału nierozpuszczalnego. Oczyścić medium wirusowe, filtrując je przez strzykawkowy filtr o rozmiarze porów 0,45 µm o niskim powinowactwie do białek (PES lub PVDF).
3. Dodać 5x roztwór glikolu polietylenowego 6000 do medium (stężenie końcowe powinno wynosić 8% glikolu polietylenowego 6000 oraz 0,3 M NaCl). Pomieszać, kilkakrotnie odwracając probówkę (nie mieszać w vorteksie). Inkubować roztwór glikolu polietylenowego zawierający wirusy w temperaturze 4 °C przez 12 lub więcej godzin, od czasu do czasu mieszając.
4. (Dzień 9) Wirować roztwór glikolu polietylenowego zawierający wirusy przy 2 500 x g przez 45 min. Odessać i usunąć supernatant, a następnie ponownie wirować przez 2 min. Ponownie odessać i usunąć supernatant.
5. Resuspendować osad, dodając 320 µl sterylnego soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (320 µl stanowi 1/100 pierwotnej objętości zebranego medium zawierającego wirusy) i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Opcjonalnie resuspendować osad w temperaturze pokojowej na kołysce przez 30 min.
6. Po resuspensji osadu podzielić wirusa na alikwoty (5-10 µl na probówkę 0,5 ml) i zamrozić alikwoty w temperaturze -80 °C (cykle zamrażania i rozmrażania lub przechowywanie w 4 °C drastycznie obniżą miano).
7. Wyznaczyć miano wirusów zgodnie ze standardowymi protokołami, t.j. wykonać serię rozcieńczeń na płytce 6-dołkowej z komórkami HEK293T i po 48 h ręcznie policzyć kolonie fluorescencyjne.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Lista odczynników do transfekcji
probówki polistyrenowe 5 ml	Fisher Scientific	352054
glikol polietylenowy 6000 (PEG 6000)	Millipore	528877
(10x) roztwór soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS)	Diagnostyka Narodowa	CL-253
probówki do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 ml	USA Scientific	1605-0000
Matrigel	Fisher Scientific	CB-40230A