Ocena systemu płynnej warstwy nakładkowej w testach tworzenia placków wirusowych

Streszczenie

Źródło: Baer, A. and Kehn-Hall, K. Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems. J. Vis. Exp. (2014).

W tym filmie zaprezentowano zastosowanie płynnej warstwy pokrywającej na bazie mikrokrystalicznej celulozy w teście plackowym, porównując jej skuteczność w tworzeniu placków wirusowych z tradycyjnej półstałej warstwy agarowej.

Protokół

1. Przygotowanie komórek i odczynników

1. Dzień przed wykonaniem testu wysiej odpowiednie komórki gospodarza dla badanego wirusa (Tabela 1 i Tabela 2) przy 90–100% konfluencji.
2. Przygotować roztwór utrwalający zawierający 10% formaldehydu w H2O₂O. Na przykład zmieszać 5,56 ml 36% roztworu formaldehydu z 14,44 ml destylowanej wody H₂$H_2O$ (dH$_2$O)₂O).
   UWAGA: Podczas pracy z formaldehydem należy stosować odpowiednie zasady bezpiecznego obchodzenia się z odczynnikami oraz zapewnić właściwą wentylację.
3. Przygotuj barwnik fioletowy krystaliczny: 1% fioletu krystalicznego (CV) w 20% etanolu i dH2O₂O.
4. Przygotować pożywkę do testu plackowego 2x (zależnie od typu komórek, w stężeniu 2x; patrz Tabela 2). Przefiltrować za pomocą 0.2 µm przefiltrować, jeśli którekolwiek z odczynników nie jest sterylne.
5. Przygotowanie warstw immobilizujących (Tabela 3)
   1. W przypadku nakładków w formie płynnej należy przygotować sterylną 2,4% roztwór Avicel w wodzie destylowanej (dH2O)₂O. Aby zapobiec powstawaniu grudek, należy dodać proszek do kolby z wodą intensywnie mieszaną za pomocą mieszadła magnetycznego; Avicel należy wsypywać powoli, szybko mieszając w temperaturze pokojowej (RT). Gdy roztwór stanie się zbyt lepki, aby można go było ujednolicić za pomocą mieszadła magnetycznego, należy przenieść go do inkubatora z wytrząsarką w celu >30 min przy intensywnym mieszaniu w celu zapewnienia równomiernej homogenizacji.
      UWAGA: Roztwory zapasowe można przygotować w niższych stężeniach, jednak roztwory te mogą ulec rozwarstwieniu i będą wymagały ponownego wymieszania w celu zapewnienia homogenizacji. Można stosować roztwory robocze Avicel w zakresie stężeń od 0,6% do 3%.
   2. Po homogenizacji należy poddać roztwór autoklawowaniu, a następnie przechowywać go w szczelnym zamknięciu w temperaturze pokojowej.
   3. W przypadku nakładek z agarozy i karboksymetylocelulozy (CMC) należy przygotować roztwór zapasowy w dH2O₂do 2% CMC lub 0,6% agarozy. Mieszać za pomocą mieszadła magnetycznego, a następnie autoklawować lub podgrzewać w kuchence mikrofalowej do całkowitego rozpuszczenia.

2. Rozcieńczenia i infekcje

1. Dzień po wysianiu, przed rozpoczęciem testu, wizualnie sprawdź konfluencję i żywotność komórek. Upewnij się, że morfologia komórkowa jest standardowa i obecna jest monowarstwa o konfluencji ~90%.
2. Wykonaj dziesięciokrotne rozcieńczenia seryjne próbek zakaźnych. Jako rozcieńczalnika użyj pożywki do wzrostu komórek stosowanej do propagacji wirusa (Tabela 2). Dostosuj liczbę wymaganych rozcieńczeń do oczekiwanego miana analizowanego wirusa i zawsze stosuj niezinfekowaną próbkę kontrolną, aby niezależnie potwierdzić żywotność komórek i ułatwić identyfikację placków.
3. Z rozcieńczeń seryjnych zakaź komórki na okres od 45 min do 1 h (Tabela 1). Użyj objętości inokulum wystarczającej do pokrycia komórek, utrzymując jednocześnie objętość na jak najniższym poziomie, aby zmaksymalizować kontakt wirusa z monowarstwą (Tabela 4). Delikatnie kołysz płytkami co 20 min, aby zapewnić równomierne pokrycie i zapobiec wysychaniu monowarstwy komórkowej.
4. Po infekcji nałóż odpowiednią objętość medium immobilizującego bezpośrednio na inokulum w dołku (Tabela 2), stosując mieszaninę 1:1 pożywki do placków 2x oraz wybranego overlayu immobilizującego (CMC, agarozę lub Avicel). Delikatnie kołysz, aby wymieszać.
   1. W przypadku overlayów ciekłych, wymieszaj w stosunku 1:1 podgrzaną pożywkę do placków 2x i roztwór stokowy Avicel 1,2-2,4% w temperaturze pokojowej, aby uzyskać roztwór roboczy medium overlay Avicel o stężeniu 0,6-1,2%.
   2. W przypadku overlayu agarozowego, użyj mieszaniny 1:1 podgrzanej pożywki do placków 2x i roztworu stokowego podgrzanej agarozy 0,6%, umieść w kąpieli wodnej o temperaturze 56 °C na 30 min w celu wyrównania temperatury, uzyskując końcowe stężenie agarozy/overlayu 0,3%.
   3. Dla CMC przygotuj 2% roztwór stokowy i postęp zgodnie z opisem dla overlayu agarozowego.
   4. Nakładając overlay na monowarstwę, zawsze wyrównuj temperaturę gorącej agarozy lub CMC w wodzie o temperaturze 56 °C, aby zapobiec uszkodzeniu monowarstwy. Upewnij się, że roztwór jest ciepły, ale nie gorący w dotyku, aby zapobiec śmierci komórek i obniżeniu mian wirusa. Większość overlayów agarozowych zaczyna tężeć poniżej 42 °C; pracuj szybko i/lub przygotowuj małe partie, aby zapobiec tężeniu podczas manipulacji.
5. Po dodaniu overlayu inkubuj płytki, aby uzyskać wyraźne i łatwo policzalne placki. Formowanie placków może trwać od 2 do 14 dni w zależności od analizowanego wirusa (Tabela 1).
   UWAGA: Po umieszczeniu płytek z overlayem ciekłym w inkubatorze nie przesuwaj ich. Poruszanie ciekłymi overlayami w okresie inkubacji spowoduje rozmazanie placków. Overlaye agarozowe i CMC są półstałe i mogą być przemieszczane lub okresowo sprawdzane pod mikroskopem świetlnym w celu monitorowania rozwoju placków.

3. Fixowanie i barwienie komórek

1. Aby utrwalić komórki, odlać lub odessać warstwę Avicel, a następnie utrwalić komórki, stosując 10% roztwór formaldehydu przez 30 min do całej nocy (<1 ml na dołek dla płytki 6-dołkowej).
   1. W przypadku agarozy lub CMC dodać roztwór formaldehydu bezpośrednio do warstwy nakładki na 1 h lub przez całą noc.
      UWAGA: Próbki można przechowywać przez dłuższy czas w utrwalaczu, pod warunkiem, że nie wyparuje on i nie wyschnie, ponieważ może to zniekształcić monowarstwę.
2. Przed barwieniem, a po utrwaleniu, usunąć formaldehyd i usunąć półstałe zatory agarozy oraz CMC za pomocą bieżącej wody lub ręcznie szpatułką. Przepłukać plaki Avicel wodą, aby usunąć pozostałości nakładki/utrwalacza przed barwieniem.
3. W celu barwienia przykryć komórki minimalną ilością roztworu fioletu krystalicznego na ok. 15 min. W razie potrzeby kołysać płytkami, aby zapewnić równomierne pokrycie.
4. Ostrożnie wypłukać barwnik fioletu krystalicznego wodą. Po utrwaleniu, zabarwieniu i wysuszeniu plaki można przechowywać bezterminowo do przyszłych analiz.

Tabela 1. Warunki inokulacji w teście plackowym oraz typy komórek

	RVFV	VEEV	Influenza B
Typ komórek	Vero	Vero	MDCK
Okres infekcji	1 hr	1 hr	45 min
Czas inkubacji	3 days	2 days	3 days

 

Tabela 2. Pożywki do tworzenia placków oraz wzrostu wirusowego/komórkowego

	RVFV	VEEV	Grypa B
Typ komórek	Vero	Vero	MDCK
Typ hodowli	DMEM1	DMEM1	DMEM2
Pożywka do tworzenia placków	2xEMEMA	2xEMEMA	2xEMEMB

1. Modyfikowane podłoże Eagle'a (Dulbecco's Modified Eagle Medium) uzupełnione o 10% płodowej surowicy bydlęcej (Fetal Bovine Serum), 1% L-glutaminy oraz 1% penicyliny/streptomycyny.

2. Modyfikowane podłoże Eagle'a Dulbecco (DMEM) uzupełnione o 1% L-glutaminy, 1% penicyliny/streptomycyny, 0,2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 0,025% HEPES oraz 50ug/ml DEAE-dekstranu.

A. 2x Minimalne Podłoże Podstawowe (500 ml) uzupełnione o 5% FBS (25 ml), 1% niezbędnych aminokwasów (5 ml), 1% pirogronianu sodu (5 ml), 1% L-glutaminy (5 ml), 2% penicyliny/streptomycyny (10 ml).

B. 2x Minimal Essential Media (500 ml) uzupełnione o 0,2% albuminy surowicy bydlęcej (Bovine Serum Albumin), 1% niezbędnych aminokwasów (Minimum Essential Amino Acids) (5 ml), 50ug/ml, 0,025% HEPES, DEAE-Dekstran, Trypsyna-TPCK*

*Bezpośrednio przed przygotowaniem, dodaj 1 µl na 25 ml z roztworu zapasu TPCK-Trypsin o stężeniu 2 µg/ml do alikwoty, której będziesz używać do mieszania z agarozą w celu wytworzenia placków.

Tabela 3. Zapasy warstw pokrywowych

	RVFV	VEEV	Influenza B
Typ komórek	Vero	Vero	MDCK
Okres infekcji	1 hr	1 hr	45 min
Czas inkubacji	3 days	2 days	3 days

 

Tabela 4. Formaty płytek

	6 dołków	12 dołków	96 dołków
Liczba komórek/dołek	5 x 105	2.5 x 105	3 x 104
Objętość inokulum (μl)	400	200	50
Objętość warstwy wierzchniej (ml)	3	1.5	0.100

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Fiolet krystaliczny	Sigma Aldritch	C3886-25G
Roztwór formaldehydu	Sigma Aldritch	F8775-500ml
Avicel RC-591 NF	FMC BioPolymer USA	RC-591 NF	Podczas rekonstytuowania mieszać energicznie przez >30 min w celu homogenizacji
Agaroza UltraPure	Invitrogen	16500-100
Karboksymetyloceluloza, sól sodowa, średnia lepkość	Sigma Aldrich	C4888