Oczyszczanie progenitorów z mięśni szkieletowych

Podsumowanie

Metoda enzymatycznej dysocjacji, znakowania powierzchniowego i oczyszczania za pomocą cytometrii przepływowej progenitorów fibro/adipogennych i miogennych z mięśni szkieletowych myszy.

Streszczenie

Mięśnie szkieletowe zawierają wiele populacji progenitorów o odrębnym pochodzeniu embrionalnym i potencjale rozwojowym. Progenitory miogenne, zazwyczaj znajdujące się w „pozycji komórek satelitarnych” pomiędzy błoną plazmatyczną włókna mięśniowego a otaczającą je, bogatą w lamininę błoną podstawwną, są komórkami zdolnymi do samoodnawiania, które są ściśle przypisane do linii miogennej^1,2. Opisaliśmy niedawno drugą klasę progenitorów związanych z naczyniami, które mogą generować myofibroblasty i białe adipocyty; reagują one na uszkodzenia poprzez efektywne przejście w stan proliferacji i zapewniają wsparcie troficzne komórkom miogennym podczas regeneracji tkanki^3,4. Jednym z najbardziej wiarygodnych testów służących do określenia potencjału rozwojowego i regeneracyjnego danej populacji komórek jest ich izolacja i transplantacja^5-7. W tym celu zoptymalizowaliśmy protokoły ich oczyszczania za pomocą cytometrii przepływowej z enzymatycznie rozdzielonych mięśni, które przedstawimy w niniejszym artykule. Populacje otrzymane tą metodą będą zawierać albo miogenne, albo fibro/adipogenne komórki tworzące kolonie: żadne inne typy komórek nie są zdolne do ekspansji in vitro lub przetrwania po podaniu in vivo. Należy jednak pamiętać, że gdy populacje te są wykorzystywane do analizy molekularnej (np. qRT-PCR) bezpośrednio po sortowaniu, świeżo posortowane podgrupy mogą zawierać inne komórki zanieczyszczające, które nie posiadają zdolności tworzenia kolonii ani przylegania do biorców.

Protokół

1. Pobieranie tkanek:

1. Należy użyć myszy w wieku od 7 do 12 tygodni. Zazwyczaj wykorzystuje się co najmniej dwa zwierzęta: jedno służy do przygotowania jednobarwnych kontroli FACS niezbędnych do kompensacji oraz próbek kontrolnych izotypów fluorescence-minus-one, a drugie stanowi właściwą próbkę do sortowania.
2. Myszy należy uśmiercić poprzez inhalację CO₂ lub zgodnie z wybranym protokołem etycznym. Myszy należy położyć na ręczniku papierowym grzbietem do góry i dokładnie spryskać 70% etanolem, aby zapobiec zanieczyszczeniu futrem myszy.
3. Za pomocą pęsety należy unieść skórę w okolicy brzusznej, a następnie wykonać niewielkie cięcie podłużne ostrymi nożyczkami.
4. Dwa płaty skóry należy odsunąć w przeciwnych kierunkach (do góry i w dół), aby całkowicie odsłonić znajdujące się pod nimi mięśnie kończyn tylnych.
5. Tkankę mięśniową należy wyciąć, wkładając nożyczki i prowadząc je wzdłuż obu stron piszczeli.
6. Ten sam proces należy powtórzyć dla kości udowej w celu wycięcia tkanki mięśniowej.
7. Wszelką wyciętą tkankę mięśniową należy umieścić w 60-milimetrowych szalkach Petriego, używając osobnej szalki dla tkanki od każdej myszy.
8. Powyższe czynności należy powtórzyć dla wszystkich myszy.

2. Rozdzielenie tkanki na pojedyncze komórki poprzez trawienie enzymatyczne:

W całej tej części protokołu należy używać sterylnych odczynników i narzędzi oraz pracować w warunkach sterylnych.

9. Do każdej płytki Petri dodać 2 mL kolagenazy II (Sigma, kat#6885, 50u/ mL) oraz 20 μL roztworu CaCl₂ (250mM).
10. Rozdzielić tkankę mięśniową na małe fragmenty (około 1 mm³) za pomocą dwóch pęset (jednej ząbkowanej i jednej dwuzębnej, z Fine Science Tools, kat#1051-10, 154-10), dbając o usunięcie i odrzucenie jak największej ilości zanieczyszczonej tkanki pozamięśniowej.
11. Przykryć płytki Petri i inkubować je w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
12. Wyjąć płytki Petri i za pomocą tłoka strzykawki 3 mL dokładnie rozgnieść fragmenty tkanki. Do każdej próbki należy użyć osobnego tłoka, aby uniknąć zanieczyszczeń krzyżowych.
13. Do każdej płytki Petri dodać niewielką ilość (~ 5 mL) sterylnego zimnego PBS i przenieść zawiesinę tkankową do probówki Falcon 50 mL (w razie potrzeby przepłukać płytkę Petri, aby odzyskać całą tkankę).
14. Energicznie wstrząsnąć probówką Falcon, dopełnić ją PBS, odwirować przy 80 rpm przez 5 minut (Eppendorf bench top Model: 5810R), a następnie odessać nadsącz (powtórzyć czynność 3 razy).
15. Do każdej probówki dodać 1 mL mieszaniny kolagenazy D (Roche, kat# 1088201, 1.5u/ mL) / dispazy II (Roche, kat#: 0494207801, 2.4u/ mL) oraz 10 μL CaCl₂ (250mM); inkubować w temperaturze 37 °C z rotacją przez jedną godzinę.
16. Dodać 5-10 mL zimnego, sterylnego PBS, wymieszać w vortexie i dokładnie pipetować w celu homogenizacji tkanki.
17. Dopełnić probówki PBS i dobrze wymieszać.
18. Przenieść ciecz przez sitko komórkowe 40 μm umieszczone na probówce Falcon 50 mL, aby odfiltrować pozostałe duże fragmenty tkanki. Każdą próbkę podzielić równomiernie pomiędzy trzy probówki Falcon 50 mL. Dopełnić każdą z probówek PBS, a następnie odwirować przy 1600 rpm przez 5 minut w temperaturze 8 °C.
19. Odlać nadsącz i zebrać komórki do barwienia.

3. Barwienie przeciwciałami i sortowanie:

Przez cały czas trwania tej sekcji protokołu należy używać sterylnych buforów FACS i buforów do zbierania próbek oraz pracować w warunkach sterylnych. Przeciwciała komercyjne są zazwyczaj uznawane za sterylne, pod warunkiem właściwego obchodzenia się z nimi.

20. W przypadku próbek z kontrolą pojedynczego koloru oraz kontrolą izotypową, resuspendować próbkę w 1 ml buforu FACS, a następnie podzielić zawiesinę komórek do dziewięciu wcześniej oznakowanych probówek Eppendorf o pojemności 1,5 ml (100 μL do każdej probówki).
    1. Przygotować mieszaniny do barwienia jednobarwnego zgodnie z poniższą tabelą:
       UWAGA: Końcowe stężenie przeciwciał kontrolnych izotypowych w barwieniu powinno być zgodne ze stężeniem przeciwciała pierwszorzędowego, dla którego stanowią one kontrolę. Na przykład, jeśli przeciwciało anty-Sca-1 jest stosowane dla 1 μg/10⁶ komórek, odpowiadający mu izotyp musi być zastosowany w tym samym stężeniu.
       

       Probetka nr	Nazwa probówki	Firma	Nr kat.	klonować	izotyp	rozcieńczanie
       1	Bezbarwienie
       2	Hoechst 342	sigma	B261			2-5 µg/ml
       3	PI (współczynnik wpływu / indeks wydajności / główny badacz)	sigma	P4864			1 µg/ml
       4	CD31-FITC CD45-FITC	ebioscience	11-0311-85	390	IgG2a szczura	500
       		Własnego wykonania		I3/2	IgG2b szczura	500
       5	Sca1-PECY7	biowiedza	25-5981-82	D7	IgG2a szczura	5000
       6	α-7 APC	Własnej produkcji		R2F2	rat IgG2b	1000

    2. Przygotować mieszaniny do barwienia kontrolnego izotypowego zgodnie z poniższą tabelą:
       

       Probówka nr	Nazwa probówki	Hoechst	PI	CD31- FITC	CD45- FITC	Skal- PE-Cy7	a-7- APC	Szczur- IgG2b- APC	Szczur- IgG2a- pecy7	Szczur- IgG2a- FITC	Szczur- IgG2b- FITC
       7	Iso- CD31 /CD45	+	+	-	-	+	+	-	-	+	+
       8	Izo- Skal- pecy7	+	+	+	+	-	+	-	+	-	-
       9	Izo- α-7-APC	+	+	+	+	+	-	+	-	-	-

    3. Nanieś pipetą mieszaniny barwiące dla pojedynczych kolorów oraz kontroli izotopowych (zazwyczaj dostosowujemy stężenie przeciwciał tak, aby mieściło się w przedziale od 5 do 10 μL (odpowiednia objętość mieszaniny barwiącej do każdej próbki) do właściwej probówki Eppendorf z kroku 20. Dokładnie wymieszać i inkubować w lodzie przez 1 godzinę.
21. Barw komórki z próbki myszy za pomocą 800μL koktajlu przeciwciał (poniżej) do sortowania komórek metodą FACS. Wymieszać dokładnie i inkubować w lodzie przez 1 godzinę.
    Koktajl przeciwciał: Hoechst, PI, CD31-FITC, CD45-FITC, Sca1-PECY7, α-7 APC
    UWAGA: Optymalny stosunek przeciwciał do komórek należy określić poprzez indywidualne miareczkowanie każdego przeciwciała, ponieważ między partiami mogą występować znaczące różnice. Optymalna ilość użytego przeciwciała powinna być wyrażona w μgs przeciwciała na 10⁶ komórki docelowe i pozostaje stała przy użyciu tej samej partii przeciwciała. Oczywiście, jeśli liczba komórek docelowych nie zmienia się znacząco między eksperymentami lub jeśli objętość barwiąca jest skalowana zgodnie z liczbą komórek, można również stosować stałe rozcieńczenie każdego przeciwciała.
22. Przemywanie: do każdej z 9 probówek kontrolnych dodać około 1 ml buforu FACS; do probówki z próbką dodać około 20 ml buforu FACS.
23. Odwiruj probówki Eppendorf przy 300 obr./min przez 5 minut (wirówka nakładkowa Eppendorf, model: 5417C). Odwiruj probówkę z próbką przy 160 obr./min przez 5 minut (wirówka nakładkowa Eppendorf, model: 5810R).
24. Odssać i usunąć nadsącz ze wszystkich probówek.
25. Resuspender komórki w buforze FACS (1 ml dla każdej z próbek kontrolnych, 4 ml dla próbki do sortowania). Przenieść komórki pipetą do „probówek FACS” przez nakrętkę z filtrem (BD Falcon nr kat. 35235, 40μm (wielkość porów), aby usunąć pozostałe aglomeraty, które mogłyby wpłynąć na pracę cytometru.
26. Skonfiguruj sorter FACS, używając kontroli dla pojedynczych barwników oraz kontroli izotypowych.
27. Należy zebrać posortowane komórki oddzielnie do 3,5 ml buforu zbierającego (95% DMEM, 5% FBS), zgodnie z poniższą tabelą. Zazwyczaj, przy pobieraniu materiału z obu kończyn tylnych, jedna mysz typu dzikiego pozwala na uzyskanie około 150 0 miogennych komórek progenitorowych lub 10 0 adipogennych komórek progenitorowych, przy przeżywalności powyżej 95%, co potwierdzono poprzez ponowną analizę posortowanych komórek metodą FACS na koniec procedury (Rysunek 1).
    Definicja progenitorów miogenicznych i adipogenicznych na podstawie barwienia powierzchniowego
    

    Przeciwciało/barwnik	Progenitor miogenny (MP)	progenitor adipogenny (AP)
    Hoechst	+	+
    PI	-	-
    CD31-FITC	-	-
    CD45-FITC	-	-
    Sca1-PECY7	-	+
    α-7 APC	+	-

4. Transplantacja:

28. Odwiruj posortowane komórki przy 150rpm przez 5 minut, usuń supernatant i przenieś komórki do autoklawowanych probówek Eppendorf (1,5 mL), przepłucz komórki 50 μL sterylnego PBS (bez surowicy!), a następnie odwiruj przy 30rpm przez 5 minut. Zachowując sterylność wszystkich odczynników i pracując w dygestorze do hodowli tkanek, resuspenduj progenitory miogenne w PBS lub progenitory adipogenne w Matrigel (BD kat# 354234) w stężeniu około 10⁶ komórek/mL.
29. Przeszczep progenitory miogenne lub adipogenne do myszy biorców.
    1. Zanurz mysz w narkozie przy użyciu izofluranu zgodnie z procedurami Twojej instytucji.
    2. Zgol sierść wokół miejsca wstrzyknięcia, a następnie zdezynfekuj skórę, przecierając ją 70% etanolem.
    3. Wstrzyknij 20μL progenitorów miogennych lub adipogennych (= 20k komórek), używając strzykawki insulinowej 3/10 CC (BD kat# 309300).
30. Po odpowiednim czasie (dobrze sprawdza się trzy tygodnie, ale włókna mięśniowe wykazujące transgeniczne markery pochodzące od dawcy są zazwyczaj widoczne w ciągu jednego tygodnia od przeszczepienia), z narkozuj myszy biorców z kroku 29 poprzezt dopaczasowe wstrzyknięcie 40 μL Avertin (Sigma Kat# T04840-2, 25 mg/mL), a następnie przeprowadź perfuzję transkardialną najpierw 50mL PBS (zawierającego 10 μM EDTA), a następnie 15mL 4% PFA. Pobierz tkankę docelową, w razie potrzeby utrwal wtórnie w 4% PFA przez noc, a następnie przenieś do 20% sacharozy na noc. Zatop w OCT, zamroź i wykonaj kriosekcje.

5. Reprezentatywne wyniki:

Gdy MP zostaną przeszczepione do mięśni szkieletowych myszy, łatwo łączą się one z istniejącymi włóknami mięśniowymi. W związku z tym każda etykieta genetyczna obecna w komórkach dawcy będzie łatwo wykrywalna we włóknach, które je przyjęły. Rysunek 2 przedstawia przykład, w którym przeszczepione komórki wykazywały ekspresję ludzkiej fosfatazy zasadowej, ujawnionej histochemicznie.

W przypadku przeszczepienia AP wynik jest w dużym stopniu zależny od środowiska miejsca transplantacji: po podaniu podskórnym komórki te różnicują się w adipocyty i myofibroblasty (patrz ryc. 2). W wielu innych miejscach, w tym w mięśniach, nie przeżywają one, chyba że uprzednio wywołano degenerację tłuszczową³.

Rycina 1. Strategia sortowania w celu izolacji populacji progenitorowych z mięśnia szkieletowego. (A) Strategia sortowania: Żywe komórki zidentyfikowano na podstawie rozproszenia światła w przód (forward scatter) i rozproszenia światła pod kątem (side scatter). Barwienie Hoechstem zastosowano w celu wykluczenia bezzątkowych szczątków komórkowych, a barwienie jodkiem propidium (PI) w celu wykluczenia martwych komórek. Komórki krwiotwórcze (CD45) i śródbłonkowe (CD31) wykluczono z bram sortowania. α7⁺ Hoechst⁺ PI^- CD45^- CD31^- Skalowanie^- podzbiór zawiera wszystkie progenitorowe komórki miogenne (MP). Scal⁺ Hoechst⁺ PI^- CD45^- CD31^- α7^- populacja zawiera progenitory adipogenne (AP). (B) Kontrole izotypowe fluorescence-minus-one (FMO) potwierdzają swoistość barwienia. (C) Kontrola czystości subpopulacji MP i AP po sortowaniu.

Rycina 2. Reprezentatywne wyniki po transplantacji MP i AP. Przeszczepiono AP podskórnie (górny panel) oraz MP domięśniowo (dolny panel). W obu przypadkach komórki dawcy pochodziły z myszy wykazującej ekspresję transgenicznej ludzkiej fosfatazy alkalicznej, zidentyfikowanej za pomocą brunatnego barwienia.

Dyskusja

Celem niniejszego protokołu jest osiągnięcie rozsądnego kompromisu pomiędzy wysoką wydajnością a wysoką żywotnością oczyszczonych komórek. Najbardziej krytycznym krokiem zapewniającym odzyskanie zdrowych komórek jest, jak można się spodziewać, enzymatyczna dysocjacja tkanki wyjściowej. Manipulacja tkanką powinna być szczególnie delikatna, co jest trudne do zademonstrowania lub docenienia nawet w formacie audiowizualnym. Kolejnym kluczowym czynnikiem jest czas trwania procedury. Im więcej czasu upłynie od pobrania materiału od zwierzęcia dawcy do transferu do zwierzęcia biorcy, tym niższa jest żywotność, a w konsekwencji wydajność engraftmentu. W przypadku jakichkolwiek wątpliwości co do żywotności, których nie można natychmiast rozstrzygnąć na podstawie częstotliwości zdarzeń PI-dodatnich w próbkach oczyszczonych komórek po sortowaniu, sugerujemy przeprowadzenie testu rozcieńczeń ograniczających w celu pomiaru klonogenności³. Typowe sortowania z nieuszkodzonego mięśnia rutynowo dają około 1 na 15-20 komórek zdolnych do inicjowania kolonii miogennych lub fibro/adipogennych in vitro. Podczas gdy praktycznie 100% kolonii zainicjowanych z MP zawiera zróżnicowane miotuby, tylko około jednej trzeciej kolonii uzyskanych z FAP zawiera adypocyty oprócz myofibroblastów wykazujących dodatni wynik dla aktyny mięśni gładkich.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kolagenaza II	Sigma-Aldrich	C-6885,	500 u/ml
Kolagenaza D	Roche Group	11088882001	1.5 u/ml
Dispase II	Roche Group	04942078001	2.4 u/ml
sitko do komórek	BD Biosciences	352340	40 μm
Probówka z sitkiem do komórek	BD Biosciences	352235	40 μm
H–chst33342	Sigma-Aldrich	B2261	2-5 ug/ml
CD31-FITC	eBioscience	11-0311-85	Klon 390
CD45-FITC	Własne opracowanie		Klon I3/2
Sca1-PECY7	eBioscience	25-5981-82	Klon D7
α-7 integryna APC	Własne opracowanie	Zapytaj laboratorium Rossi	R2F2