Lokalizacja białek w trójwymiarowej kulturze komórek macierzystych neuronów: hybrydowa metodologia wizualizacji

Podsumowanie

W niniejszej pracy opisujemy sposób wytwarzania, namnażania i immunoznakowania postnatalnych neuralnych komórek progenitorowych (NPCs) hipokampa w kulturze trójwymiarowej (3D). Następnie, wykorzystując hybrydowe technologie wizualizacji, demonstrujemy, w jaki sposób cyfrowe obrazy immunoznakowanych kriosrezy mogą służyć do rekonstrukcji i mapowania położenia przestrzennego komórek immunopozytywnych w całej trójwymiarowej neurosferze.

Streszczenie

Znaczenie topografii trójwymiarowej (3D) w wywieraniu wpływu na fenotyp neuronalnych komórek macierzystych i progenitorowych (NPC) jest powszechnie uznane, choć trudne do zbadania. Po odseparowaniu od embrionalnego lub postnatalnego mózgu, pojedyncze NPC proliferują w zawiesinie, tworząc neurosfery. Komórki potomne w tych kulturach spontanicznie przyjmują odrębne linie rozwojowe (neurony, oligodendrocyty i astrocyty) w trakcie ekspansji, mimo wystawienia na to samo środowisko zewnątrzkomórkowe. Proces ten odtwarza wiele etapów obserwowanych podczas neurogenezy i gliogenezy w mózgu postnatalnym i jest często wykorzystywany do badania podstawowej biologii NPC w kontrolowanym środowisku. Ocena pełnego wpływu topografii 3D oraz rozmieszczenia komórkowego w tych kulturach na los NPC jest jednak trudna. Aby zlokalizować białka docelowe i zidentyfikować linie NPC za pomocą immunocytochemii, swobodnie pływające neurosfery muszą zostać wysiane na podłożu lub poddane seryjnemu cięciu. Obróbka ta jest niezbędna, aby zapewnić równomierną permeabilizację komórek i dostęp przeciwciał w całej sferze. W rezultacie obrazy epifluorescencyjne 2D kriosnittów lub rekonstrukcje konfokalne stosów Z w 3D mogą dostarczyć informacji przestrzennych o pozycji komórek jedynie w obrębie dyskretnych fizycznych lub cyfrowych przekrojów 3D i nie pozwalają na wizualizację pozycji komórkowej w nienaruszonej sferze. W niniejszej pracy, aby odtworzyć topografię kultury neurosfer i umożliwić analizę przestrzenną ekspresji białek w całej kulturze, przedstawiamy protokół izolacji, ekspansji i seryjnego cięcia postnatalnych neurosfer hipokampalnych, odpowiedni do epifluorescencyjnej lub konfokalnej immunodetekcji białek docelowych. Jako przykład przeanalizowano koneksynę 29 (Cx29). Następnie, wykorzystując hybrydę oprogramowania do edycji graficznej i modelowania 3D, rygorystycznie zastosowaną w celu zachowania szczegółów biologicznych, opisujemy sposób ponownego złożenia trójwymiarowego rozmieszczenia strukturalnego tych obrazów i cyfrowego mapowania znakowanych komórek w obrębie kompletnej neurosfery. Metodologia ta umożliwia wizualizację i analizę pozycji komórkowej białek docelowych oraz komórek w całej topografii kultury 3D i ułatwi bardziej szczegółową analizę relacji przestrzennych między komórkami w przebiegu neurogenezy i gliogenezy in vitro.

Zarówno Imbeault, jak i Valenzuela przyczynili się do pracy w równym stopniu i powinni być uznani za współautorów pierwszych.

Protokół

1. Izolacja komórek progenitorowych neuronów

Przez cały czas trwania protokołu izolacji należy utrzymywać tkanki i roztwory w niskiej temperaturze!

1. Przed rozpoczęciem hodowli należy przygotować następujące roztwory stokowe:
   • Pożywka do dysocjacji (26 mM NaHCO₃, 124 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.1 mM CaCl₂*2H₂O, 3.2 mM MgCl₂*6H₂O, 10 mM D-glucose, 100 U/mL penicyliny, 100 μg/mL streptomycyny. Przefiltrować sterylnie i przechowywać w aliquotach 10-15 mL w temperaturze -20°C. Przygotować stężenia stokowe enzymów stosowanych do dysocjacji komórkowej w podwójnie destylowanej wodzie H₂O, przefiltrować sterylnie i przechowywać aliquoty w temperaturze -20°C: proteaza neuronalna (25 mg/mL), papaina (10 mg/mL), DNAseI (10 mg/mL). W dniu eksperymentu dodać enzymy do 15 mL pożywki do dysocjacji do następujących stężeń końcowych: 1 mg/mL proteazy, 0.1mg/mL papainy, 0.1 mg/mL DNAse I. Roztwór do dysekcji zawierający końcowe stężenia enzymów można przechowywać w lodzie podczas procesu dysekcji.
   • Pożywka do utrzymania: pożywka Eagle'a modyfikowana przez Dulbecco F12 (DMEM/F12), 2 mM L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/mL streptomycyny, suplement B27 1X. Można przechowywać do 3 miesięcy w 4°C bez suplementu B27 oraz do jednego miesiąca w 4°C z suplementem B27.
   • Czynniki wzrostu: Przygotować aliquoty stokowe 0.1 μg/mL ludzkiego rekombinowanego epidermalnego czynnika wzrostu (hEGF) oraz 10 μg/mL czynnika wzrostu fibroblastów-2 (FGF-2) w DMEM/F12 + 0.1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Przechowywać w -20°C.
2. W celu przeprowadzenia eutanazji szczeniąt myszy C57BL/6, w 0-3 dniu po urodzeniu wykonuje się wstrzyknięcie domięśniowe preparatu Euthansol.
3. Ostrożnie usunąć mózgi standardową metodą dysekcji i umieścić w szalce 60 mm zawierającej sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF: 26 mM NaHCO₃, 124 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl₂*2H₂O, 1.3 mM MgCl₂*6H₂O, 10 mM D-glucose, 100 U/mL penicyliny, 100 μg/mL streptomycyny). Jeśli to konieczne, dostosować pH do 7.3, przefiltrować sterylnie do aliquotów 50 mL i przechowywać w -20°C.
4. Za pomocą żyletki przyciąć mózg poprzez usunięcie móżdżku, a następnie przykleić go klejem Krazy Glue do uchwytu wibratomu stroną rostralną do góry, a stroną grzbietową do siebie. W niniejszym protokole stosowany jest wibratom Leica Microsystems VT1000S.
5. Umieścić uchwyt w wibratomie i dodać ACSF oraz lód do odpowiednich komór.
6. Wyciąć plastry o grubości 500 μm, stosując prędkość od 3.5 do 4.5 i częstotliwość 8.5.
7. Zebrać plastry zawierające formację hipokampa do szalek z ACSF.
8. Za pomocą stereomikroskopu wyciąć hipokampy w zakresie od bregmy -1.60 mm do -2.40 mm (aż do momentu, gdy region CA3 zaczyna zakrzywiać się brzusznie) i umieścić w nowej suchej szalce (bez ACSF). W niniejszym protokole stosowany jest mikroskop dysekcyjny Leica MZ6.
9. Po zebraniu wszystkich hipokampów posiekać tkankę skalpelem (aż do uzyskania jednorodnego i upłynnionego wyglądu).
10. Przenieść posiekaną tkankę do probówki polipropylenowej 15 mL zawierającej 2.5 mL pożywki do dysocjacji z proteazą neuronalną, papainą i DNAse I (patrz krok nr 1 w celu przygotowania roztworu). Uwaga: w przypadku dużej ilości tkanki wyjściowej (np. z 6 szczeniąt) zaleca się użycie 2 probówek po 2.5 mL pożywki do dysocjacji, aby utrzymać optymalny stosunek enzymu do tkanki. Inkubować w 37°C przez 45-60 min z rotacją. W niniejszym protokole stosowany jest piec do hybrydyzacji Labnet ProBlot 6 (zakupiony przez Mandel Scientific) ustawiony na 4 stopień rotacji.
11. Dodać 10 mL sterylnego roztworu soli fosforanowej z potasem do hodowli tkankowych (kPBS: 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM buforu fosforanowego, pH 7.4) i wirować przy 300 x g przez 5 min. W niniejszym protokole stosowana jest wirówka Eppendorf (model 5702).
12. Odlać nadosad i zawiesić osad w 5 mL kPBS.
13. Zdysocjować tkankę poprzez tryturację za pomocą pipety Pasteura.
14. Wirować zawiesinę komórkową przy 300 x g przez 5 min.
15. Zawiesić komórki w 3 mL pożywki do utrzymania, policzyć komórki przy użyciu błękitu trypanu i wysiać komórki do nieprzylepnych szalek 60 mm (w niniejszym protokole stosowane są szalki Corning Ultra-Low adherence binding, patrz Materiały) z gęstością 2.5 x 10⁵ komórek/szalka w 5 mL pożywki do utrzymania. Zamiast szalek Ultra-Low adherence można użyć szalek Petriego, jednak podczas ekspansji przez pierwsze 6 dni in vitro (DIV) hodowle będą wymagały delikatnego opukiwania rano i po południu każdego dnia, aby zapobiec przywieraniu i spontanicznej różnicowaniu.
16. Bezpośrednio po wysianiu dodać hEGF do stężenia końcowego 20 ng/mL oraz FGF-2 do stężenia końcowego 10 ng/mL. Dodawać kolejne czynniki wzrostu co dwa dni w fazie ekspansji aż do dnia zbioru w 14 DIV. (Paski skali w filmie przedstawiającym rozrastające się neurosfery odpowiadają 100 μm).

**Uwaga: pożywka może przybrać żółty kolor około 10. dnia (DIV 10) fazy ekspansji. W takim przypadku należy dodać kolejny 1 mL pożywki Maintenance. Jeśli pożywka ponownie stanie się żółta następnego dnia, należy dodać kolejny 1 mL pożywki Maintenance – czynność tę należy powtarzać w razie potrzeby podczas fazy ekspansji – należy pamiętać o odpowiednim dostosowaniu objętości czynników wzrostu, aby zachować prawidłowe stężenia końcowe.**

2. Seryjne mrożenie i krojenie

1. Przed utrwaleniem delikatnie ostukaj neurosfery, aby upewnić się, że w momencie fiksacji sfery są dobrze odseparowane.
2. Dodaj formaldehyd klasy molekularnej bezpośrednio do kultur do końcowego stężenia 3,7% i inkubuj w temperaturze pokojowej (RT) przez 20 min przy powolnym wstrząsaniu. W niniejszym protokole zastosowano urządzenie Stovall Belly Dancer ustawione na prędkość obrotową 2,5.
3. Zebierz neurosfery do polipropylenowej probówki o pojemności 15 mL i odwiruj przy 300 x g przez 5 min.
4. Odlej supernatant i resuspenduj osad w 10 mL soli buforowej z fosforanem sodu (nPBS: 154 mM NaCl, 10 mM bufor fosforanowy). Zwróć uwagę na zmianę stosowanego roztworu z kPBS na nPBS.
5. Odwiruj przy 300 x g przez 5 min.
6. Resuspenduj w 5-10 mL 20% (w/v) roztworu sacharozy w nPBS.
7. Przechowuj neurosfery w temperaturze 4°C przez co najmniej 24 h w celu krioprotekcji kultur.
8. Wypełnij jednorazową formę do kriozalewania związkiem Optimal Cutting Temperature (OCT).
9. Delikatnie wlej roztwór sacharozy zawierający neurosfery do szalki.
10. Użyj stereomikroskopu, aby zlokalizować reprezentatywne sfery o różnych rozmiarach z najmniejszymi oznakami uszkodzeń mechanicznych. Podczas pierwszego wykonywania tej procedury niektóre kultury mogą być uszkodzone lub rozerwane. Wraz z praktyką morfologia będzie dobrze zachowana.
11. Delikatnie odessij każdą neurosferę do końcówki pipety o pojemności 1 mL (usuwając minimalną objętość roztworu sacharozy) i umieść ją w związku OCT. Zaznacz przybliżoną lokalizację na formie, aby móc później odnaleźć sfery.
12. Po umieszczeniu kilku sfer w formie do kriozalewania, błyskawicznie zamroź próbki za pomocą CO₂, aż OCT stanie się biały.
13. Zaznacz położenie sfer na kostce i wyjmij kostkę z formy.
14. Używając schłodzonej wcześniej pęsety, umieść kostkę na kawałku papieru filtracyjnego, uprzednio przymocowanym do uchwytu (chuck) za pomocą OCT.
15. Nałóż więcej związku OCT wokół kostki i zamroź za pomocą CO₂, aby przytwierdzić blok zawierający sfery. Alternatywnie umieść uchwyt (z papierem filtracyjnym) w kriosztacie, nanieś związek OCT na papier filtracyjny i umieść kostkę bezpośrednio w OCT. Odczekaj, aż OCT stanie się biały i twardy. W tym protokole zastosowano kriosztat Leica CM1900.
16. Gdy związek OCT stanie się biały, można umieścić uchwyt na bloku tnącym, a następnie odczekać co najmniej 30 min do wyrównania temperatury.
17. Wykonaj seryjne cięcia o grubości 10 μm, orientując się według zaznaczeń i często sprawdzając pod mikroskopem obecność przekrojów neurosfer. Umieść jak najwięcej przekrojów na jednym szkiełku. Uwaga: pierwsze kilka plastrów neurosfery może nie być widoczne pod mikroskopem, dlatego zbieraj wszystkie przekroje, aż zobaczysz komórki, i zachowaj 3-5 przekrojów przed rozpoczęciem oraz po zakończeniu danej sfery. Te sekcje przednie i tylne zostaną również poddane immunocytochemii. Dlatego kluczowe jest zastosowanie przeciwbarwienia jąder podczas immunobarwienia, co pozwoli wykryć pojedyncze komórki na biegunach neurosfery, które nie są łatwo widoczne w standardowej mikroskopii fazowej odwróconej.
18. Przechowuj przekroje w temperaturze -20°C.

3. Immunocytochemia

1. Wyjąć preparaty z temperatury -20°C i rozmrozić, delikatnie polewając wszystkie skrawki nPBS i inkubując w temperaturze pokojowej przez 5 min.
2. Odrzuć nadmiar nPBS i niezwłocznie nanieś przeciwciało pierwszorzędowe rozcieńczone w buforze Ab (0,3% Triton X-100, 0,3% albuminy surowiczej wołowej w nPBS, pH 7,2). Na każdy preparat będzie potrzebne około 100 μL. W niniejszym protokole lokalizujemy Cx29 w poszczególnych potomkach NPC obecnych w trójwymiarowej kulturze neurosfer.
3. Przykryć parafilmem dociętym tak, aby zakrywał skrawki, lecz nie przekraczał rozmiaru szkiełka przedmiotowego, ponieważ w przypadku, gdyby parafilm osiągnął lub przekroczył szerokość szkiełka, przeciwciała zostaną odciągnięte z jego powierzchni na drodze osmozy. Parafilm zapobiegnie parowaniu. Inkubować przez noc w temperaturze 4°C w komorze wilgotnej. Należy uważać, aby parafilm swobodnie spłynął na skrawki i nie przylegał do szkiełka. Po nałożeniu nie wolno jednak usuwać ani zmieniać położenia parafilmu, ponieważ należy unikać wywierania jakichkolwiek sił ścinających na skrawki, aby nie zaburzyć morfologii.
4. Dodać ok. 1 ml nPBS bezpośrednio na skrawki, aby parafilm odkleił się i wypłynął. Alternatywnie można umieścić preparat pionowo bezpośrednio w naczyniu Coplina, aż parafilm sam oddzieli się od powierzchni. Nie należy usuwać parafilmu ręcznie, dopóki nie oddzieli się on samoistnie, aby nie uszkodzić delikatnej struktury neurosfery. Po oddzieleniu się parafilmu od szkiełka inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej. Odlać nPBS i powtórzyć procedurę płukania jeszcze 3 razy w temperaturze pokojowej przez 5 min.
5. Nanieś przeciwciało wtórne rozcieńczone w buforze Ab i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 h w komorze wilgotnościowej, zgodnie z powyższym opisem. Ponownie będziesz potrzebować około 100 μL na preparat.
6. Powtórz przemycia w nPBS opisane w kroku 4. Nałóż barwnik przeciwbarwiący jądra w 3^rd płukać (Hoechst 33258 0,5 μg/mL w nPBS) przez 5 min, a następnie przeprowadzić końcowe płukanie przez 5 min w temperaturze pokojowej.
7. Zamontuj preparat w wybranym medium montażowym zapobiegającym blaknięciu (anti-fade) i przykryj szkiełkiem podstawowym, zabezpieczając szkiełko lakierem do paznokci – najpierw w narożnikach, a następnie wokół wszystkich krawędzi, aby zapobiec utracie próbki (w przypadku stosowania medium na bazie glicerolu).
8. Przejdź do akwizycji obrazów przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego lub konfokalnego. W niniejszym protokole zastosowano mikroskop Leica DMRA2, kamerę Hamamatsu Orca ER oraz oprogramowanie OpenLab v3.56. W tym przykładzie obrazy są rejestrowane w trzech kanałach: (1) kontrast fazowy, (3) Blue UV (kostka Leica A4: kombinacje filtrów Ex 360/40, Di 400, Sp BP470/40) oraz Red (kostka Leica Y3: kombinacje filtrów Ex BP535/50, Di 565, Sp 610/75). Wykonaj zdjęcia każdego przekroju seryjnego, zwracając szczególną uwagę na pierwszy i ostatni przekrój poprzez śledzenie biegunów z wykorzystaniem znakowania DNA barwnikiem Hoechst 33258 w przypadkach, gdy detekcja pojedynczych komórek w kontraście fazowym jest utrudniona.

4. Dopasowanie

1. Podczas montowania rozmrożonych krioskrawków na szkiełkach mikroskopowych będą one minimalnie przesuwać się i obracać. Odchylenia te muszą zostać skorygowane. Co więcej, podczas obrazowania każdego seryjnego przekroju środek każdego obrazu może znajdować się w innym miejscu na ekranie. W rezultacie każdy zdigitalizowany przekrój seryjny musi zostać starannie wyrównany z poprzednim przekrojem, aby zachować dokładną morfologię. Wyrównanie to wymaga uważnego i precyzyjnego zwrócenia uwagi na cytoarchitekturę oraz szczegóły topograficzne.
2. Obrazy seryjne z każdego kanału wraz z wbudowanymi paskami skali 10 μm i 50 μm (ustalonymi w oprogramowaniu OpenLab v3.56) są zapisywane jako oddzielne pliki TIFF i importowane do programu Photoshop CS4 przy standardowym rozmiarze obszaru roboczego 3300 x 2550 pikseli i rozdzielczości 72 pikseli/cal. Podczas importu należy zwrócić szczególną uwagę na rozmiar obszaru roboczego, aby zachować dokładną skalę. Rozmiar obszaru roboczego i rozdzielczość są kluczowe dla późniejszego modelowania w programie Maya. Pasek skali, zapisany jako oddzielna warstwa w Photoshopie, powinien służyć do weryfikacji, czy podczas wyrównywania w Photoshopie nie nastąpiła zmiana wymiarów X-Y.
3. Następnie połącz trzy (lub więcej) warstwy odpowiadające temu samemu przekrojowi (tj. połącz serie obrazów fazy, UV i Cy3 dla każdego przekroju). Zapewnia to, że po wyrównaniu jednej warstwy pozostałe warstwy przypisane do tego przekroju zostaną wyrównane jednocześnie. Alternatywnie można zablokować warstwę fazową po ustawieniu jej w odpowiedniej pozycji (patrz poniżej), a następnie wyrównać powiązane warstwy tego przekroju do warstwy fazowej.
4. Aby rozpocząć, ukryj wszystkie warstwy, klikając ikonę „oka” w oknie warstw.
5. Włącz pierwszy i drugi obraz kontrastowy fazowy seryjnych przekrojów neurosfer, klikając ikony „oka” w oknie warstw. Zwiększ przezroczystość drugiego przekroju. W karcie „Image” otwórz opcję „image rotation” i wybierz „arbitrary”. Obracaj drugi przekrój, aż zdołasz zidentyfikować punkty ciągłości geometrycznej i strukturalnej między obrazami. Pomocne jest porównywanie obrazów z kanałem UV (przekroje znakowane Hoechst 33258).
6. Powtarzaj czynność dla wszystkich kolejnych przekrojów seryjnych, porównując „najbliższych sąsiadów” (tj. bezpośredni przekrój przedni z bezpośrednim przekrojem tylnym), aż wszystkie przekroje i wszystkie kanały zostaną dokładnie wyrównane.
7. Utwórz w programie Maya v10 płaszczyznę o tych samych proporcjach, co plik w programie Photoshop.

5. Typologia komórek

1. W pasku stanu interfejsu użytkownika programu Maya zmień ustawienie paska menu z domyślnego Animation na Surfaces.
2. Użyj prymitywnej sfery podziałowej (subdivision sphere), aby stworzyć ciało komórki.
3. Mając zaznaczoną neurosferę, rozpocznij manipulowanie jej wierzchołkami, klikając prawym przyciskiem myszy na obiekcie i wybierając Vertex z menu znakującego (Marking Menu). Dalsze dopracowanie powierzchni sfery wykonaj, zmieniając Display Level w menu znakującym.
4. W zakładce Subdivision Surfaces menu głównego otwórz okno opcji Collapse Hierarchy i ustaw liczbę poziomów na 2. Wykonaj operację Collapse dla sfery.
5. Zmień ustawienie paska menu z Surfaces na Polygons.
6. Mając zaznaczoną sferę, uruchom narzędzie Sculpt Geometry z zakładki Mesh menu głównego.
7. Wygładź powierzchnię komórki do jej ostatecznej formy, korzystając z zestawu narzędzi Sculpt Geometry w zakładce Tool Settings.
8. Powtórz ten proces, aby stworzyć różne ciała komórkowe, symulując różnorodność NPC i potomstwa NPC obecnych w neurosferze. W tej demonstracji podstawą neurosfery jest dziesięć różnych ciał komórkowych.
9. Zaznacz typologię komórek i wybierz opcję Freeze Transformations.
10. Po ustaleniu typologii komórek, zaprojektowane zostaną dwa shadery powierzchni reprezentujące zarówno komórki wykazujące ekspresję białka zainteresowania (w naszym przykładzie komórki Cx29-dodatnie), jak i komórki, w których białko to nie występuje. Tutaj każda komórka z immunoreaktywnością Cx29 jest określana jako Cx29-dodatnia. W tym przykładzie nie modelowano lokalizacji subkomórkowej, choć taka analiza jest możliwa po wprowadzeniu modyfikacji w shaderach.
11. Otwórz okno Hypershade z zakładki Windows > Rendering Editors menu głównego.
12. Wybierz Ramp Shader z zakładki Surface materials.
13. Otwórz Edytor Atrybutów (Attribute Editor) i ustaw atrybuty Color, Incandescence, Ambient Color, Bump Map oraz Specular Color shaderów.
14. Przypisz teksturę Brownian 3D do węzła Ambient Color oraz teksturę 2D Fractal do węzła Bump Mapping.
15. Zaznacz połączenia wejściowe i wyjściowe (Input and Output Connections) powstałych shaderów i wyeksportuj zaznaczoną sieć.
16. Zaznacz typologię komórek i otwórz okno opcji Export Selection.
17. Wybierz typ pliku mayaAscii i odznacz pole Include these inputs. Wykonaj Export Selection.

6. Mapowanie komórek

1. Otwórz plik z wyrównanymi seryjnymi przekrojami w programie Photoshop CS4.
2. Ustal legendę pociągnięć narzędzia Ołówek, aby zaznaczyć położenie każdej komórki progenitorowej w seryjnych przekrojach. W tej demonstracji zostanie użyta legenda trzech pociągnięć – pełnego kwadratu, kwadratu z linią przerywaną oraz kwadratu z krzyżykiem – aby wskazać, czy komórka znajduje się w jednym, dwóch czy trzech przekrojach. Legenda pociągnięć jest dodatkowo zdefiniowana kolorem – w tym przykładzie kolor czerwony reprezentuje komórki wykazujące ekspresję badanego białka Cx29, a biały reprezentuje komórki niewykazujące ekspresji Cx29.
3. Włącz warstwę Phase i zacznij zaznaczać środek każdej komórki progenitorowej białym pociągnięciem narzędzia Ołówek. Do tworzenia map użyj oddzielnej warstwy w folderze przekroju.
4. Przełączaj się między przekrojami, aby zlokalizować pozycję komórek, upewniając się, że komórki widoczne na więcej niż jednym przekroju są prawidłowo oznaczone.
5. Przy włączonej warstwie Cx29 zaznacz komórki znajdujące się w regionach, w których stwierdzono pozytywną ekspresję Cx29.
6. Wybierz polecenie Wypełnij z karty Edycja w głównym pasku menu programu Photoshop i zmień białe pociągnięcia na czerwone.
7. Po ukończeniu map zapisz każdy przekrój jako osobny obraz jpeg w folderze sourceimages projektu Maya. Aby to zrobić, należy najpierw utworzyć nowy projekt Maya.

7. Importowanie i składanie map w 3D

1. W pasku stanu interfejsu użytkownika programu Maya zmień ustawienie paska menu z domyślnego Animation na Polygons.
2. Zaimportuj pliki planes.mb oraz scaleBar.mb z folderu scenes projektu.
3. Przy zaznaczonej płaszczyźnie przypisz cieniowanie Lambert, klikając prawym przyciskiem myszy na obiekcie i otwierając zakładkę Assign New Material.
4. W edytorze atrybutów (Attribute Editor) kliknij w kratkowane pole po prawej stronie atrybutu Color materiału.
5. Z menu rozwijanego wybierz opcję File z sekcji 2D Textures.
6. W sekcji File Attributes w edytorze atrybutów kliknij ikonę pliku po prawej stronie atrybutu Image Name.
7. Wybierz pierwszy przekrój z folderu sourceimages.
8. Zmień kamerę w oknie Workspace z widoku Perspective na domyślny ortograficzny widok Top, otwierając zakładkę Panels.
9. Wybierz narzędzie Create Polygon Tool z zakładki Mesh menu głównego i obrysuj kontur przekroju.
10. Wybierz pierwszą mapę z folderu sourceimages i przypisz ją do nowo utworzonej płaszczyzny poligonowej, postępując zgodnie z krokami ustalonymi dla tworzenia płaszczyzny poligonowej.
11. Przy zaznaczonym obiekcie wybierz opcję UV z menu Marking Menu, klikając prawym przyciskiem myszy na płaszczyźnie.
12. Zaznacz wszystkie punkty UV płaszczyzny i otwórz edytor UV Texture Editor z zakładki Windows menu głównego.
13. Zmień skalę UV proporcjonalnie tak, aby pasowała do płaszczyzny przekroju.
14. Powtórz ten proces dla każdego przekroju neurosfery, upewniając się, że odstępy między poszczególnymi przekrojami odpowiadają wysokości paska skali.

8. Lokalizacja typologii komórek progenitorowych w 3D

1. W pasku stanu interfejsu użytkownika programu Maya zmień ustawienie paska menu z domyślnego Animation na Dynamics.
2. Pozostawiając widoczną tylko pierwszą sekcję neurosfery, ukryj wszystkie pozostałe sekcje, zmieniając ustawienia wyświetlania w karcie Display menu głównego.
3. Przy otwartym oknie opcji narzędzia CV Curve Tool, w ustawieniach CV Curve Settings wybierz opcję 1 Linear.
4. Obserwując scenę z kamery widoku Top, zacznij przypisywać punkty do map komórkowych, tworząc jedną krzywą dla komórek Cx29-ujemnych i jedną dla komórek Cx29-dodatnich.
5. Krzywe wynikowe są płaskie przy oglądaniu z kamery widoku Side. Ustal grubość sekcji, przesuwając punkty krzywej w osi y, posługując się za pomocą zaimportowanego z obrazów mikroskopowych paska skali.
6. Powtórz ten proces dla każdej sekcji neurosfery.
7. Zaimportuj plik cellTyoplogy.ma z folderu scen projektu i zduplikuj typologię komórek dla komórek Cx29-ujemnych i Cx29-dodatnich wewnątrz neurosfery.
8. Otwórz okno Hypershade z karty Windows > Rendering Editors menu głównego.
9. Zaimportuj wcześniej zbudowane shadery, przypisując je do komórek typologii.
10. W oknie Outliner usuń nazwę pliku z początku zaimportowanych obiektów. Będzie to istotne na późniejszych etapach procesu modelowania.
11. Wybierz kartę Particles z menu głównego i utwórz emitera cząsteczek dla pierwszej krzywej CV Curve.
12. Otwórz kartę particleShape1 i w sekcji Emission Attributes zmień wartość Max Count z -1 na liczbę punktów na pierwszej krzywej.
13. W karcie Render Attributes zmień Particle Render Type na Blobby Surface (s/w). Kliknij poniżej pole Current Render Type i zmień promień (Radius) cząsteczek na 0.010.
14. Przypisz cząsteczki do wierzchołków krzywej, wybierając najpierw cząsteczki, a następnie wybierając krzywą z wciśniętym klawiszem shift. Otwórz opcje Goal w karcie Particles menu głównego i ustaw Goal Weight na 1. Kliknij Create.
15. W oknie Outliner wybierz kolejno komórki od numeru 1 do 10 i otwórz okno opcji Instancer (Replacement) z karty Particles menu głównego. W polu Instance Objects powinny być wymienione wszystkie dziesięć komórek w odpowiedniej kolejności.
16. Z listy rozwijanej w karcie Particle Object to Instance wybierz odpowiednią nazwę particleShape. Kliknij Create.
17. Domyślnie tylko pierwsza wybrana komórka zastąpi cząsteczki wzdłuż krzywej. Aby pojawiło się wszystkie dziesięć typów i cyklicznie zmieniały się losowo pomiędzy cząsteczkami, wymagane jest wprowadzenie wyrażenia. Drugie wyrażenie zapewni, że komórki będą emitowane losowo w ten sam sposób za każdym razem, gdy suwak Range Slider zostanie przesunięty.
18. Przy zaznaczonym emiterze otwórz Attribute Editor. W karcie particleShape, w sekcji Add Dynamic Attribute, kliknij pole General. W polu Long Name wpisz random_index. W Attribute Type zmień Scalar na Per particle (array) i kliknij Add.
19. W karcie Per Particle (Array) Attributes dodano pole random_index. Klikając prawym przyciskiem myszy w pustym obszarze, wybierz z listy rozwijanej opcję Create Expression...
20. W polu Expression: wpisz tekst: particleShape1.random_index=rand(10); if (particleShape1.particleId==1)seed(1);
21. Aby ukończyć wyrażenie, otwórz kartę Instancer (Geometry Replacement) w Attribute Editor i w General Options > Object Index wybierz z listy rozwijanej random_index. Przesuń suwak czasu na pierwszą klatkę i naciśnij play; typy komórek są teraz losowo rozmieszczone pomiędzy cząsteczkami.
22. Powtórz ten proces dla każdej sekcji neurosfery. Upewnij się, że każdy nowy emiter, instancer i random index są rozróżnialne pod względem nazwy i odpowiednio zorganizowane w oknie Outliner.

9. Renderowanie / Kompozycja

1. W sekcji Render Using okna Render Settings zmień renderer z Maya Software na mental ray.
2. Otwórz kartę Quality i w sekcji Raytracing zmień ustawienie Reflections na zero. Otwórz kartę Framebuffer, zmień Colorclip z Raw na Alpha i odznacz opcję Premultiply.
3. Otwórz Channel Box/Layer Editor i zmień ustawienie Layer Editor z Display na Render.
4. Zaznacz zaimportowane komórki typologii i kliknij ikonę Create new layer and assign selected objects.
5. Zmień nazwę warstwy na ambient occlusion.
6. Kliknij prawym przyciskiem myszy na nowo utworzoną warstwę i wybierz z menu opcję Attributes.
7. Po prawej stronie pola renderLayer kliknij przycisk Presets i wybierz z listy rozwijanej opcję Occlusion.
8. Wybierz kartę mib_amb_occlusion1 i zmień wartość Samples z 16 na 256.
9. Ponownie otwórz Channel Box/Layer Editor i w karcie Options otwórz pole opcji Render All Layers.
10. Wybierz Composite oraz keep layers.
11. Przy zaznaczonej warstwie ambientOcclusion zmień jej tryb z Normal na Multiply w polu rozwijanym znajdującym się tuż nad listą warstw.
12. Wyrenderuj dwie przebiegi neurosfery: raz z włączoną warstwą ambientOcclusion i raz z włączoną warstwą masterLayer. Zapisz obrazy jako pliki iff w folderze images projektu.
13. Otwórz oba obrazy w programie Photoshop CS4. Umieść warstwę ambientOcclusion nad warstwą masterLayer i ustaw jej tryb na Multiply. Utwórz tło i spłaszcz obraz.

Dyskusja

Niniejszy protokół opisuje procedurę hodowli i seryjnego mrożenia oraz cięcia kriostatowego postnatalnych NPC hipokampa, lokalizacji ekspresji białek za pomocą detekcji immunologicznej, a następnie rekonstrukcji i analizy topograficznego położenia komórek immunopozytywnych w obrębie całej 3D neurosfery. Łącząc techniki hodowli i przetwarzania z zakresu biologii komórki, obrazowanie mikroskopowe (oprogramowanie OpenLab, Improvision i inne oprogramowanie do analizy obrazu), możliwości programów do edycji grafiki (Adobe Photoshop) oraz możliwości oprogramowania do animacji i kompozycji 3D (Autodesk Maya), przedstawiamy metodologię rekonstrukcji pełnego składu komórkowego hodowli 3D z seryjnych obrazów 2D, co pozwala na wierną rekonstrukcję pozycji komórek i ekspresji białek w całej hodowli neurosfery. Protokół ten może być z równą skutecznością łączony z rejestracją i rekonstrukcją cienkich seryjnych przekrojów epifluorescencyjnych lub stosów Z z mikroskopii konfokalnej przez grubsze przekroje seryjne. Ponieważ klonalna ekspansja pojedynczych NPC w hodowli neurosfer odtwarza wiele etapów obserwowanych w przebiegu neurogenezy i gliogenezy w mózgu postnatalnym, wpływ struktury 3D stanowi istotny czynnik determinujący los NPC w potomstwie wystawionym na to samo środowisko eksperymentalne¹. Różnice w linii komórkowej i ekspresji białek w rdzeniu i na peryferiach seryjnych przekrojów neurosfer sugerują, że wiele czynników fizycznych, w tym pozycja komórki, stres mechaniczny i siły ścinania, odgrywa istotną rolę w regulacji biologii NPC². Co więcej, wykazano, że ekspresja białek konneksyn, analizowana w niniejszej pracy, zmienia się w zależności od tego, czy NPC są hodowane jako 3D neurosfery w zawiesinie, czy wysiewane na podłożu z lamininy, przy czym funkcjonalna komunikacja zapśredniczona przez konneksyny ulega zmianie w zależności od tego, czy komórki są hodowane na plastiku i podłożu, czy w 3D wolno pływających hodowlach³. Wpływ pozycji komórkowej na los NPC pozostaje niejasny. Analiza wpływu lokalizacji przestrzennej w hodowli 3D na biologię NPC jest trudna pod względem technicznym, ponieważ ocena antygenowa białek linii komórkowej i sygnałowych wymaga naruszenia architektury 3D w celu umożliwienia permeabilizacji komórek i dostępu przeciwciał do wszystkich komórek. Tutaj wykazujemy, że hybrydowa metodologia wizualizacji umożliwia ustalenie, czy określone białka wykazują unikalne lokalizacje pozycyjne w hodowli 3D, może być wykorzystana do wnioskowania i testowania funkcji oraz regulacji białek w odniesieniu do lokalizacji regionalnej w obrębie neurosfery i, co być może najważniejsze, dostarcza danych pozycyjnych niezbędnych do badania wpływu topografii 3D i rozmieszczenia komórek na los NPC w hodowli 3D.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Euthansol	Odczynnik	Merck & Co.
Krazy Glue	Odczynnik	Home Hardware
Wibratom VT1000S	Sprzęt	Leica Microsystems
Proteaza neuronalna	Odczynnik	Sigma-Aldrich	P6141	Roztwory zapasowe przechowywane w -20°C
Papaina	Odczynnik	Sigma-Aldrich	P4762	Roztwory zapasowe przechowywane w -20°C
DNAza I	Odczynnik	Roche Group	11 284 932 001	Roztwory zapasowe przechowywane w -20°C
Mikroskop sekcyjny MZ6	Sprzęt	Leica Microsystems
Piec do hybrydyzacji ProBlot 6	Sprzęt	Labnet International
Wirówka 5702	Sprzęt	Eppendorf
kPBS	Odczynnik	BioShop Canada	PBS404
Suplement B27	Odczynnik	Invitrogen	17504-044
Naczynia do hodowli tkankowej o bardzo niskim wiązaniu (Ultra Low Binding)	Materiał jednorazowy	Corning	3261
Ludzki czynnik wzrostu naskórka (EGFr)	Odczynnik	Invitrogen	13247-051	Roztwory zapasowe przechowywane w -20°C
Czynnik wzrostu fibroblastów-2	Odczynnik	Invitrogen	13256-029	Znany również jako podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF) Roztwory zapasowe przechowywane w -20°C
37% formaldehyd (stopień czystości molekularnej)	Odczynnik	Sigma-Aldrich	F8775
Wstrząsarka Belly Dancer	Sprzęt	Stovall Life Sciences, IBI Sciences
Forma kriogeniczna Tissue-Tek	Materiał jednorazowy	Sakura Finetek	4566
Związek Tissue-Tek OCT	Odczynnik	Sakura Finetek	4583
Papier do blottingu Whatman stopień 703	Materiał jednorazowy	VWR international	28298-020
Kriostat CM1900	Sprzęt	Leica Microsystems
Poliklonalne przeciwciało pierwotne anty-Cx29	Odczynnik	Udostępnione przez dr Davida Paula, Harvard Medical School		Przechowywane 1:1 w glicerolu w -20°C
Koniugowane z Cy3 przeciwciało osiołkowe anty-królicze IgG	Odczynnik	Jackson ImmunoResearch		Przechowywane 1:1 w glicerolu w -20°C
H–chst 33258	Odczynnik	Sigma-Aldrich	861405
Mikroskop epifluorescencyjny DMRA2, kamera Orca ER, OpenLab v3.56	Sprzęt/Oprogramowanie	Leica Microsystems		Protokół ten można przeprowadzić przy użyciu dowolnego mikroskopu epifluorescencyjnego lub konfokalnego.
Photoshop CS4	Oprogramowanie	Adobe		Oprogramowanie graficzne
Maya v10	Oprogramowanie	Autodesk		Oprogramowanie do modelowania
Komputer	Sprzęt	Intel		Procesor: Intel Corei7 920, Pamięć: 12GB DDR3 Karta graficzna: Nvidia GTX 285 (1GB RAM)
* Wszystkie pozostałe standardowe odczynniki chemiczne wymienione w protokole pochodzą z firmy Sigma-Aldrich. Wszystkie pozostałe standardowe odczynniki do hodowli tkankowej pochodzą z firmy Invitrogen.