Izolacja komórek macierzystych gruczołów ślinowych myszy

Podsumowanie

Opisano zoptymalizowany protokół izolacji komórek macierzystych z gruczołu ślinowego myszy. Metoda ta wykorzystuje trawienie enzymatyczne i mechaniczne oraz umożliwia izolację salisfer zawierających komórki o charakterystyce komórek macierzystych.

Streszczenie

Dojrzałe gruczoły ślinowe pochodzenia ludzkiego i mysiego składają się z co najmniej pięciu typów komórek, z których każdy wspomaga produkcję i wydalanie śliny do jamy ustnej. Komórki acinarne surowicze i śluzowe stanowią odpowiednio fabryki białek i śluzu w gruczole i są miejscem powstawania śliny. Po syntezie różne komponenty enzymatyczne i białkowe śliny są wydzielane poprzez szereg komórek przewodowych o morfologii nabłonkowej, aż do ostatecznego wyrzutu śliny przez główny przewód do jamy ustnej. Podczas tego procesu skład śliny jest również modyfikowany przez komórki przewodowe.

W przebiegu schorzeń takich jak zespół Sjögrena, a także w niektórych sytuacjach klinicznych, np. podczas radioterapii nowotworów głowy i szyi, produkcja śliny przez gruczoły jest drastycznie zmniejszona ^1,2. Wynikająca z tego kserostomia, czyli subiektywne odczucie suchości w jamie ustnej, wpływa nie tylko na zdolność pacjenta do połykania i mówienia, ale także sprzyja rozwojowi próchnicy zębów i może prowadzić do wykluczenia społecznego osoby cierpiącej.

Przywrócenie produkcji śliny w wyżej wymienionych stanach klinicznych stanowi zatem niezaspokojoną potrzebę medyczną, w związku z czym w kilku badaniach wykazano zdolności regeneracyjne gruczołów ślinowych ^3-5. Po wyizolowaniu populacji komórek o charakterze macierzystym z różnych tkanek organizmu myszy i człowieka ^6-8, za pomocą opisanego метода wykazaliśmy, że komórki macierzyste wyizolowane z gruczołów ślinowych myszy mogą zostać wykorzystane do przywrócenia produkcji śliny w napromieniowanych gruczołach ślinowych ^9,10. Odkrycie to otwiera drogę do opracowania terapii opartych na komórkach macierzystych w leczeniu kserostomii u ludzi, a także do badania gruczołów ślinowych jako mikrośrodowiska zawierającego komórki o multipotencjalnych zdolnościach do samoodnawiania.

Protokół

1. Przygotowanie odczynników

1. Bufor: 1 % (w/v) albuminy surowicy bydlęcej w zrównoważonym roztworze soli Hanksa
2. Rekonstytucja enzymów. Hialuronidaza: 40mg / mL, rozpuszczona w buforze. Kolagenaza II: 23mg / mL, rozpuszczona w buforze. Do każdej izolacji należy używać świeżo przygotowanych roztworów enzymów. Po rozpuszczeniu przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu trawienia.
3. 50 mM chlorku wapnia w wodzie destylowanej. Sterylizować przez filtr o rozmiarze porów 0.2 uM.
4. Pożywka do hodowli gruczołów ślinowych myszy (MSG): DMEM:F12 z penicyliną (100 I.U. / mL), streptomycyną (100 μg / mL), glutamaxem (2 mM), epidermalnym czynnikiem wzrostu-2 (20 ng / mL), fibroblastycznym czynnikiem wzrostu-2 (20 ng / mL), suplementem N2 (1 %), insuliną (10 μg / mL) i deksametazonem (1 μM).

2. Mechaniczne i enzymatyczne trawienie tkanki

1. Zważyć wypreparowane gruczoły ślinowe.
2. Posiekać gruczoły na jednorodną masę w małej szalce Petriego, używając sterylnych zakrzywionych nożyczek preparacyjnych.
3. Przenieść posiekaną tkankę do probówek o pojemności 14 mL, stosując 1 mL buforu na każde 80 mg tkanki podżuchwowej. Przepłukać szalki Petriego pozostałościami buforu, aby usunąć resztki tkanki.
4. Dodać kolejne 1 mL buforu na każde 80 mg tkanki, a następnie 25 μL roztworu kolagenazy II, 25 μL roztworu hialuronidazy oraz 250 μL roztworu chlorku wapnia na każde 80 mg tkanki. W przypadku pracy z dużymi ilościami tkanki, kroki 2.4 – 2.9 można dla wygody przeprowadzić w kolbach do hodowli tkankowej T25.
5. Inkubować w wytrząsanej łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 20 minut. Wyjąć probówki i utrzeć zawartość za pomocą pipety, aby ponownie dokładnie wymieszać enzymy z tkanką.
6. Umieścić ponownie w łaźni wodnej na kolejne 20 minut.
7. Zebrać tkankę poprzez wirowanie przy 400 x g przez 8 minut. Odpiłować nadsącz.
8. Resuspendować w 2 mL buforu na każde 80 mg tkanki i powtórzyć dodawanie enzymów oraz chlorku wapnia jak opisano powyżej. Inkubować przez 20 minut w wytrząsanej łaźni wodnej. Wyjąć probówki i utrzeć zawartość za pomocą pipety w celu dokładnego wymieszania enzymów.
9. Inkubować przez ostatnie 20 minut w wytrząsanej łaźni wodnej. Zebrać komórki poprzez wirowanie jak opisano powyżej, a następnie odpiłować nadsącz.

3. Etapy płukania

1. Resuspender każde 80 mg tkanki w 2 mL buforu i pipetować, aby wypłukać enzymy z tkanki.
2. Wirować jak wcześniej w celu zebrania osadu. Odpiłować nadsącz.
3. Powtórzyć płukanie, używając 1 mL buforu na 80 mg tkanki. Wirować w celu zebrania osadu, a następnie odpiłować nadsącz.

4. Filtrowanie

1. Resuspender roztwór tkankowy w 1 mL buforu na 80 mg tkanki.
2. Przenieść roztwór na filtr o rozmiarze porów 100 μm umieszczony nad probówką Falcon 50 mL. Nie nakładać więcej niż 3 mL roztworu rozdrobnionej tkanki na kolumnę, ponieważ filtry mogą się zapchać. Pozostawić do przefiltrowania. Materiał odfiltrowany zawieszony pod filtrem usunąć za pomocą pipety i dodać do filtratu.
3. Za pomocą strzykawki z igłą 26G pobrać filtrat z probówek 50 mL i nanieść go na filtry o rozmiarze porów 50 μm na probówkach 5 mL. Pozostawić do przefiltrowania, w razie potrzeby pomagając poprzez poluzowanie zakrętek.
4. Odwirować probówki w sposób opisany wcześniej w celu zebrania osadu. Odrzucić nadsącz.

5. Wysiewanie i podłoże

1. Połączyć wszystkie osady w jednej probówce. Policzyć komórki za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru.
2. Wysiać komórki z gęstością 0,4 x 10⁶ komórek na dołek w płytce 12-dołkowej lub 2,67 x 10⁶ komórek na kolbę do hodowli tkankowej T25. Do każdego dołka dodać 1 mL pożywki MSG lub 6 mL do każdej kolby T25.
3. Inkubować w temperaturze 37 °C. Sfery powinny być wyraźnie widoczne do 2. dnia.

6. Reprezentatywne wyniki:

Po dwóch do trzech dniach hodowli w kulturach pojawią się małe agregaty komórek (salisfery). Salisfery będą nadal zwiększać swoje rozmiary przez okres dziesięciu dni hodowli. Reprezentatywne obrazy salisfer wykonane za pomocą mikroskopii kontrastowej w fazie przedstawiono na Rysunku 1. Z tych sfer można wyizolować proliferujące komórki wykazujące ekspresję białek markerowych związanych z komórkami macierzystymi, optymalnie między 3. a 5. dniem po izolacji; komórki te są zdolne do różnicowania się w funkcjonalne, produkujące ślinę komórki acinarne.

Rycina 1. Tworzenie się salisfer in vitro. Po trawieniu mechanicznym i enzymatycznym zgodnie z niniejszym protokołem, w hodowlach pływających można zaobserwować sfery o zwiększającej się wielkości. Panele przedstawiają reprezentatywne obrazy mikroskopii w kontraście fazowym sfer z dni 0 (A), 4 (B), 7 (C) i 10 (D). Pasek skali = 50 μm.

Dyskusja

Opisana tutaj metoda hodowli tkankowej stanowi powtarzalny protokół izolacji salisfer zawierających komórki macierzyste z gruczołów ślinowych myszy. Badania z wykorzystaniem komórek izolowanych w ten sposób podkreśliły zdolność regeneracyjną komórek macierzystych gruczołów ślinowych ⁹. Transplantacja stu komórek c-Kit+ pochodzących z salisfer wywołała funkcjonalną regenerację napromieniowanych gruczołów ślinowych myszy. Dane te są obiecujące i stanowią punkt wyjścia do badania terapii kserostomii opartej na komórkach macierzystych. Pozostaje jednak do zbadania wiele kwestii, w tym pełny profil ekspresji białek markerowych komórek macierzystych, zdolność gruczołów podżuchwowych do przywrócenia funkcji napromieniowanych gruczołów ślinowych ślinowych i odwrotnie, a także charakterystyka domniemanej niszy komórek macierzystych in vivo. Ostatecznie, przeniesienie tego protokołu na ludzkie próbki tkanek i wynikający z tego potencjał terapii kserostomii u pacjentów z wykorzystaniem izolowanych komórek jest najbardziej ekscytującym zastosowaniem opisanej metody.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Hialuronidaza	Sigma-Aldrich	H3506	Przechowywać w – 20 °C
Kolagenaza II	GIBCO, by Life Technologies	17101-015	Przechowywać w 4 °C
Epidermalny czynnik wzrostu-2	Sigma-Aldrich	E9644	Przygotować roztwór stokowy o stężeniu 10 μg / mL w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS). Przechowywać w – 20 °C w alikwotach jednorazowych.
Fibroblastyczny czynnik wzrostu-2	Sigma-Aldrich	F0291	Przygotować roztwór stokowy o stężeniu 25 μg / mL w PBS. Przechowywać w – 20 °C w alikwotach jednorazowych.
Suplement N2	GIBCO, by Life Technologies	17502-048	Zgodnie z instrukcją producenta.
Insulina	Sigma-Aldrich	I6634	Przygotować roztwór stokowy o stężeniu 2 mg / mL w wodzie z kranu. Przed rozpuszczeniem dostosować pH wody do wartości 2-3 za pomocą lodowatego kwasu octowego.
Deksametazon	Sigma-Aldrich	D4902
Sterylne sita do komórek o rozmiarze porów 100 μM	BD Biosciences	352360
Polistyrenowe probówki z okrągłym dnem i nakrętkami z sitami do komórek (rozmiar porów 50 μM)	BD Biosciences	352235