Artykuł metodologiczny

Technika heterokarionu do analizy lokalizacji specyficznej dla typu komórek

19.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2488

⸱

11 marca 2011

 ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, Worcester Polytechnic Institute- WPI

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano elastyczną i wydajną metodę charakteryzacji specyficznej dla typu komórek lokalizacji białek oraz ich transportu nukleocytoplazmatycznego. To podejście z wykorzystaniem heterokaryonów wykorzystuje fluorescencyjnie znakowane białka fuzyjne do obrazowania lokalizacji białek po fuzji komórek. Protokół ten można zastosować do określania lokalizacji w stanie stacjonarnym lub do bardziej dynamicznych analiz w oparciu o obrazowanie żywych komórek.

Streszczenie

Znaczna liczba białek jest regulowana przez transport wewnątrzkomórkowy lub transport nukleocytozolowy. Białka te pełnią zróżnicowany szereg funkcji komórkowych, w tym import i eksport RNA oraz białek do jądra, regulację transkrypcji oraz apoptozę. Co interesujące, główne reorganizacje komórkowe, w tym podział komórki, różnicowanie i transformacja, często obejmują takie procesy3,4,8,10. Szczegółowe badanie tych białek oraz ich odpowiednich mechanizmów regulacyjnych może być trudne, ponieważ bodźce wywołujące te zmiany lokalizacji mogą być nieuchwytne, a same ruchy mogą być bardzo dynamiczne i trudne do śledzenia. Badania dotyczące onkogenezy komórkowej, na przykład, wciąż czerpią korzyści z rozumienia szlaków i aktywności białek, które różnią się między normalnymi komórkami pierwotnymi a komórkami transformowanymi6,7,11,12. Ponieważ wiele białek wykazuje zmienioną lokalizację podczas transformacji lub w jej wyniku, metody pozwalające na efektywną charakteryzację tych białek oraz szlaków, w których uczestniczą, mogą przyczynić się do lepszego zrozumienia onkogenezy i otworzyć nowe obszary dla celowanego działania leków.

Przedstawiamy tutaj metodę analizy transportu białek i aktywności przemieszczania się między pierwotnymi a transformowanymi komórkami ssaków. Metoda ta łączy generowanie fuzji heterokaryonowych z mikroskopią fluorescencyjną, zapewniając elastyczny protokół, który może być wykorzystany do wykrywania lokalizacji białek w stanie stacjonarnym lub dynamicznym. Jak pokazano na Ryc. 1, dwa oddzielne typy komórek są przejściowo transfektowane konstruktami plazmidowymi zawierającymi gen fluoroproteinowy połączony z badanym genem. Po ekspresji komórki są łączone za pomocą glikolu polietylenowego, a następnie lokalizacje białek mogą być obrazowane przy użyciu różnych metod. Przedstawiony tutaj protokół stanowi fundamentalne podejście, do którego można dodać techniki specjalistyczne.

Protokół

1. Transfekcja linii komórkowych

Metoda transfekcji 1

(Nukleofekcja Lonza w celu zwiększenia wydajności transfekcji komórek pierwotnych)

  1. Przed transfekcją komórki powinny być z niedawnego pasażu i znajdować się w logarytmicznej fazie wzrostu. Przemyć komórki roztworem soli fosforanowej w buforze (PBS) i zebrać je poprzez trypsynizację.
  2. Zebrać komórki poprzez wirowanie przy 1500 x g przez 5 minut.
  3. Do płytki 6-dołkowej dodać wysterylizowane szkiełka podstawowe. Szkiełka mogą być powlekane w celu zwiększenia adhezji komórek. Do każdego dołka wlać 1,5 mL pożywki hodowlanej (w tym przypadku DMEM z 10% FBS) i wyrównać temperaturę pożywki w inkubatorze.
  4. Zebrać komórki poprzez trypsynizację i resuspender w minimalnej objętości roztworu soli fosforanowej w buforze (PBS).
  5. Policzyć komórki i odwirować odpowiednią ilość suspensji, aby uzyskać ~5x10 5 komórek na próbkę.
  6. Ostrożnie resuspender komórki w 100 μL roztworu do nukleofekcji w temperaturze pokojowej na próbkę.
  7. Połączyć 100 μL suspensji komórkowej z 5 μg plazmidowego DNA i przenieść próbkę do kuwety do nukleofektora, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.
  8. Wybrać odpowiedni program nukleofektora (może to wymagać wcześniejszych testów w celu ustalenia optymalnej wydajności transfekcji przy minimalnej śmiertelności).
  9. Włożyć kuwetę zawierającą suspensję komórek i DNA do uchwytu kuwet nukleofektora i uruchomić wybrany program.
  10. Po zakończeniu wyjąć kuwetę i dodać do niej ~500 μL uprzednio wyrównanej temperatury pożywki hodowlanej (pobranej z płytki 6-dołkowej).
  11. Niezwłocznie przenieść próbkę do płytki 6-dołkowej do końcowej objętości 1,5 mL na dołek. Komórki należy wysiać w populacjach mieszanych lub osobno, w przypadku kontroli.

Metoda transfekcji 2

(Transfekcja linii komórkowych przy użyciu Qiagen Effectene)

  1. Przygotować kompleksy do transfekcji przy użyciu odczynnika Qiagen Effectene, dodając najpierw 0,8 μg każdej próbki plazmidowego DNA do 200 μL buforu EC.
  2. Dodać 6,4 μL odczynnika wzmacniającego (enhancer reagent) do każdej próbki, wymieszać krótko poprzez potrząsanie probówką i inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
  3. Dodać 20 μL odczynnika Effectene do każdej próbki, wymieszać poprzez potrząsanie probówką i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Podczas inkubacji przygotować do transfekcji dwie interesujące linie komórkowe. Niedawno pasażowane komórki (<80% konfluencji) wypłukać raz w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS). Dodać 1,5 mL świeżej, ogrzanej i zrównoważonej pożywki wzrostowej (w tym przypadku pożywka DMEM uzupełniona o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS)).
  5. Po 15-minutowej inkubacji kompleksów do transfekcji, przenieść 1,2 mL pożywki do każdej próbki. Wymieszać za pomocą pipety i natychmiast przenieść ~700 μL kompleksów do każdego z dwóch dołków na płytce 6-dołkowej. Dodawać kroplowo i mieszać, delikatnie obracając płytkę. Pozostawić komórki do transfekcji na co najmniej 3 godziny (czas ten może różnić się w zależności od typu komórek).
  6. Do nowej płytki 6-dołkowej włożyć sterylizowane szkiełka nakrywkowe. Szkiełka nakrywkowe mogą być powlekane w celu zwiększenia adhezji komórek.
  7. Po zakończeniu transfekcji komórki wypłukać dwukrotnie PBS i zebrać komórki poprzez minimalną trypsynizację: dodać około 100 μL roztworu trypsyny do każdego dołka, krótko wstrząsnąć płytką, aby w pełni pokryć każdy dołek, a następnie natychmiast odessać trypsynę. Po oderwaniu się komórek dodać 1,5 mL świeżej pożywki.
  8. Na tym etapie komórki należy wysiać na sterylne szkiełka nakrywkowe w formie populacji mieszanych lub oddzielnych (dla kontroli).
  9. Pozostawić komórki do regeneracji na 12 godzin.

2. Fuzja komórek

  1. Usunąć pożywkę z komórek i przemyć je dwukrotnie PBS.
  2. Na tym etapie zaleca się potraktowanie komórek cykloheksymidą (100 μg/mL) w celu zahamowania syntezy białek. Inkubować komórki przez 2 godziny, a następnie przemyć je dwukrotnie PBS.
  3. Przeprowadzić fuzję komórek poprzez wystawienie ich na działanie 50% roztworu glikolu polietylenowego 1000 (PEG 1000) w DMEM bez surowicy przez 125 sekund w temperaturze pokojowej.
  4. Przemyć komórki PBS, aby usunąć roztwór PEG 1000, a następnie dodać 2 mL świeżo ogrzanej i wyrównanej osmotycznie pożywki.
  5. Inkubować komórki przez 18 - 24 godziny.

Mikroskopia fluorescencyjna

  1. Usunąć pożywkę hodowlaną i dwukrotnie przemyć komórki w PBS.
  2. Utrwalić komórki, dodając do każdej studni 1 mL 4% roztworu paraformaldehydu (w PBS). Delikatnie mieszać przez 15 minut.
  3. Dwukrotnie przemyć utrwalone komórki w PBS.
  4. Ostrożnie wyjąć szkiełka nakrywkowe z płytki i odsączyć nadmiar PBS. Odwrócić szkiełka na preparaty mikroskopowe z jedną kroplą medium montażowego (90% glicerolu, 100mM Tris pH 7.5, 2% DABCO (1,4-diazabicoyclo-octane) zawierającego DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole).
  5. Usunąć nadmiar medium montażowego z preparatów i zabezpieczyć szkiełka nakrywkowe lakierem do paznokci.
  6. Wizualizować komórki za pomocą mikroskopii konfokalnej lub epifluorescencyjnej.

3. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 2 przedstawia przykładowy eksperyment z heterokaryonami z wykorzystaniem pierwotnych fibroblastów oraz komórek raka niedrobnokomórkowego płuca H1299. Białko będące przedmiotem badania w tym eksperymencie (Chicken Anemia Virus-VP3) wykazuje głównie lokalizację cytoplazmatyczną w pierwotnych typach komórek i lokalizację jądrową w typach komórek transformowanych, co zobrazowano za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej. Białko jest eksprymowane jako białko fuzyjne z GFP (wektor pEGFP-N1, Clontech) w pierwotnych fibroblastach napletka (PFF) lub z dsRed (wektor dsRed-N1, Clontech) w komórkach H1299. Próbki kontrolne obejmujące autofuzje (dwie górne rzędy) wykazują komórki wielojądrowe bez zmian w stacjonarnych wzorcach lokalizacji. Takie zmiany mogłyby w przeciwnym razie wystąpić z powodu wrażliwości na warunki fuzji lub tworzenia się syncytiów. Fuzje heterokaryonów (dolny rząd) wykazują wniknięcie do jądra białka pochodzącego z komórki pierwotnej połączonego z GFP oraz kolokalizację z białkiem połączonym z dsRed w odpowiedzi na wprowadzenie materiału z komórki transformowanej. Przedstawiony przykład to stosunkowo rzadka fuzja heterokaryonu powstała z zaledwie dwóch komórek, jednej każdego typu, co potwierdza obecność sygnałów obu fluoroprotein. Oprócz wykrywania tego typu przejść lokalizacyjnych, aktywność transportu jądrowo-cytoplazmatycznego można łatwo wykryć poprzez obecność pojedynczego fluoroforu w obu jądrach. Ten rodzaj oznaczenia jest jasny podczas badania fuzji komórek w stosunku 1:1 i byłby zależny od inhibicji translacji.

Schemat fuzji komórek; transfekcja plazmidem GFP/dsRed; tworzenie heterokaryonu po 18-24 h; obrazowanie.
Rysunek 1. Schemat metody heterokaryonu z wykorzystaniem pierwotnych fibroblastów oraz komórek raka niedrobnokomórkowego H1299. Geny zainteresowania są klonowane w celu wytworzenia fuzji w ramce odczytu z jednym z dwóch genów białek fluorescencyjnych. Następnie linie komórkowe są przejściowo transfekowane wybranym konstruktem i poddawane rekuperacji. Tworzenie heterokaryonu jest indukowane krótką ekspozycją na glikol polietylenowy (PEG), a następnie dalszą inkubacją. Na koniec, za pomocą różnych form mikroskopii fluorescencyjnej, obserwuje się lokalizację subkomórkową badanego białka.

Schemat analizy mikroskopii konfokalnej, barwienia GFP/dsRed/DAPI, fuzji komórek i tworzenia heterokaryonów.
Rysunek 2. Transport nukleocytoplazmatyczny i aktywność wahadłowa białka VP3 wirusa anemii kurcząt (Chicken Anemia Virus) zwizualizowane za pomocą fuzji heterokaryonów. Górny rząd: Reprezentatywne obrazy samoistnie zfuzjowanych komórek H1299 wykazujących ekspresję dsRed-VP3. Środkowy rząd: Reprezentatywne obrazy epifluorescencyjne pierwotnych fibroblastów napletka (PFF) wykazujących ekspresję GFP-VP3 po fuzji indukowanej PEG. Dolny rząd: Fuzja heterokaryonów komórek PFF i H1299. Kolor żółty oznacza kolokalizację sygnałów GFP i dsRed. Obrazy komórek wykonano przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego Leica AF6000E i oprogramowania obrazowego Leica.

Dyskusja

Przedstawiony tutaj protokół tworzenia heterokariotów zapewnia wydajną i łatwą do interpretacji metodę charakterystyki zachowania lokalizacji specyficznej dla typu komórek, a także aktywności transportu nukleocytoplazmatycznego. Metoda ta wykorzystuje czułość analizy fluorescencyjnej oraz możliwość obrazowania żywych komórek i prowadzenia badań nad dynamiką białek. Technika ta jest łatwo adaptowalna do wielu różnych typów komórek i nadaje się zarówno do obrazowania komórek żywych, jak i utrwalonych. Na przykład mikroskopia fluorescencyjna w odwróceniu może być stosowana do obrazowania na żywo i rejestracji wideo time-lapse. Z kolei komórki zamontowane na szkiełkach mogą być poddawane mikroskopii epifluorescencyjnej w celu określenia lokalizacji w stanie stacjonarnym lub bardziej szczegółowemu obrazowaniu konfokalnemu w celu analizy dyskretnych lokalizacji. Ponadto techniki takie jak odzyskiwanie fluorescencji po fotobleachingu (FRAP) lub utrata fluorescencji w fotobleachingu (FLIP) mogą być wykorzystywane do wyznaczania kinetyki lokalizacji1. Wprowadzenie do protokołu alternatywnych fluoroforów pozwoliłoby na równoległe przeprowadzenie eksperymentów dotyczących oddziaływań białkowych, takich jak transfer energii rezonansowej fluorescencji (FRET)2. Różnorodne inhibitory transportu wewnątrzkomórkowego, takie jak leptomycyna B lub dominujące negatywne konstrukty Ran GTPaza, mogą być stosowane w celu ustalenia zależności od konkretnych szlaków importu lub eksportu5,6,9.

  • W niektórych eksperymentach dotyczących aktywności transportu wahadłowego (shuttling) należy zachować ostrożność, aby uniknąć efektów lokalizacji wynikających z syntezy nowych białek. W takich przypadkach należy zastosować inhibitory translacji lub ograniczone punkty czasowe. Niemniej jednak możliwe jest wystąpienie artefaktów spowodowanych inhibicją translacji. Dla jasnej interpretacji zachowania transportu i lokalizacji najbardziej pożądane są fuzje komórek zawierające po jednej komórce każdego typu. Może być konieczna optymalizacja liczby komórek oraz warunków fuzji (czasu i stężenia), aby sprzyjać takim korzystnym zdarzeniom fuzji w stosunku 1:1.
  • Należy zauważyć, że w zależności od zastosowanych typów komórek konieczna będzie optymalizacja niektórych etapów protokołu. Aspekty procedury eksperymentalnej, takie jak wydajność fuzji, wydajność transfekcji oraz żywotność po fuzji, mogą się znacznie różnić w zależności od typu komórek. W szczególności pierwotne typy komórek mogą być trudne w obsłudze ze względu na złożone warunki hodowli i niską wydajność transfekcji. Zastosowanie technologii takich jak urządzenie Lonza Nucleofector może umożliwić szybkie przetwarzanie komórek, a także drastyczne zwiększenie wydajności transfekcji. Dodatkowo metody elektroporacji pozwalają na łatwe przeniesienie komórek w zawiesinie do kolejnych etapów fuzji.

Oświadczenia

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Pragniemy podziękować Katedrze Chemii i Biochemii Worcester Polytechnic Institute za sfinansowanie badań.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
odczynnik EffecteneQiagen301425
roztwór soli fosforanowo-buforowany (PBS)Sigma-AldrichP5493
TrypsynaFisher ScientificSH3023602
Dulbecco’zmodyfikowana pożywka Eagle’pożywka (DMEM)Fisher ScientificSH30243FSWysokie stężenie glukozy
paraformaldehydFisher ScientificO4042-500
4’,6-diamidyno-2-fenyloindol (DAPI)Sigma-AldrichD9542-10MG
Surowica Hyclone (płodowa bydlęca)Thermo Fisher Scientific, Inc.SH3008803HI
płytki 6-dołkowe FalconFisher Scientific08-772-1B
Glikol polietylenowy 1000Fisher Scientific528875-25GM
Szkiełka nakrywkoweFisher Scientific12-545-85
DABCOSigma-AldrichD2522-25G
zestaw do nukleofekcji HDFLonza Inc.VPD-1001

Bibliografia

  1. Belaya, K. FLIPing heterokaryons to analyze nucleo-cytoplasmic shuttling of yeast proteins. RNA. 12, 921-930 (2006).
  2. Bhaumik, S. R. In vivo target of a transcriptional activator revealed by fluorescence resonance energy transfer. Genes Dev. 18, 333-343 (2004).
  3. Cohen, H. R., Panning, B. XIST RNA exhibits nuclear retention and exhibits reduced association with the export factor TAP/NXF1. Chromosoma. 116, 373-383 (2007).
  4. Gao, X. Dapper1 is a nucleoplasmic shuttling protein that negatively modulates Wnt signaling in the nucleus. J. Biol. Chem. 51, 35679-3588 (2008).
  5. Grespin, M. E. Thyroid Hormone Receptor α1 Follows a Cooperative CRM1/Calreticulin-mediated Nuclear Export Pathway. J. Biol. Chem. 283, 25576-25588 (2008).
  6. Heilman, D. W., Teodoro, J. G., Green, M. R. Apoptin Nucleocytoplasmic Shuttling Is Required for Cell Type-Specific Localization, Apoptosis, and Recruitment of the Anaphase-Promoting Complex/Cyclosome to PML Bodies. J. Virology. 80, 7535-7545 (2006).
  7. Jeffries, S., Capobianco, A. J. Neoplastic transformation by Notch requires nuclear localization. Mol Cell Biol. 20, 3928-3941 (2000).
  8. Keaton, M. A. Nucleocytoplasmic trafficking of G2/M regulators in yeast. Mol. Biol. Cell. 19, 4006-4018 (2008).
  9. Ling, P. D. Nuclear-Cytoplasmic Shuttling Is Not Required for the Epstein-Barr Virus EBNA-LP Transcriptional Coactivation Function. J. Virology. 83, 7109-7116 (2009).
  10. Lin, X. -F. RXRα acts as a carrier for TR3 nuclear export in a 9-cis retinoic acid-dependent manner in gastric cancer cells. J. Cell Science. 117, 5609-5621 (2004).
  11. Vissinga, C. S. Nuclear Export of NBN Is Required for Normal Cellular Responses to Radiation. Mol Cell Biol. 29, 1000-1006 (2009).
  12. Zimmerman, R. S., Rosenberg, N. Changes in p19Arf localization accompany apoptotic crisis during pre-B-cell transformation by Abelson murine leukemia virus. J. Virol. 82, 8383-8391 (2008).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Lokalizacja bia ekfuzja kom rekmikroskopia fluorescencyjnaglikol polietylenowymetody transfekcjitraktowanie cykloheksymidmikroskopia konfokalnabadania nad onkogenez

Powiązane artykuły