Opracowywanie spersonalizowanych testów białek komórek gospodarza z linii Chinese Hamster Ovary z wykorzystaniem technologii akustycznej mikrocząsteczkowej membrany

Podsumowanie

Opisano opracowanie niestandardowych analiz na platformie ViBE w celu uzyskania bardziej czułych, powtarzalnych i zautomatyzowanych wyników w złożonych matrycach. Uniwersalny kartridż pozwala na łatwe dostosowanie analiz do zastosowań niestandardowych. Ta wszechstronność umożliwia szybkie opracowanie i walidację nowych analiz lub zautomatyzowanych wersji istniejących analiz manualnych, co zostało zilustrowane w tym filmie.

Streszczenie

Dostosowane testy dla unikalnych białek są często ograniczone do czasochłonnych, ręcznych technik detekcji i kwantyfikacji, takich jak ELISA lub Western blot, ze względu na złożoność opracowywania ich na alternatywnych platformach. Własna technologia Acoustic Membrane MicroParticle (AMMP) firmy BioScale pozwala na łatwe opracowanie testów immunoenzymatycznych typu kanapka (sandwich immunoassays) do zastosowania na platformie ViBE, zapewniając lepszą czułość, powtarzalność oraz zautomatyzowany przebieg pracy. Jako przykład, niniejszy protokół opisuje procedurę opracowywania dostosowanego testu na białka komórek gospodarza jajnika chińskiego chomika (CHO-HCP). Opisane tutaj ogólne zasady mogą być stosowane przy opracowywaniu szerokiej gamy testów immunoenzymatycznych.

Test AMMP mierzy stężenie antygenu poprzez pomiar zmian częstotliwości oscylacji wywołanych wiązaniem mikrocząsteczek z powierzchnią czujnika. Składa się on z czterech głównych komponentów: (1) kartridża zawierającego funkcjonalizowany chip z ośmioma czujnikami, (2) magnetycznych mikrocząsteczek znakowanych przeciwciałami, (3) przeciwciał znakowanych haptenem, które wiążą się z powierzchnią funkcjonalizowanego chipu, (4) próbek zawierających badany antygen. Biosensor firmy BioScale jest urządzeniem rezonansowym zawierającym osiem oddzielnych membran z osobnymi ścieżkami przepływu płynów. Membrany zmieniają częstotliwość oscylacji w odpowiedzi na gromadzenie się masy na powierzchni, a ta zmiana częstotliwości jest wykorzystywana do ilościowego określenia wartości dodanej masy.

Aby umożliwić zastosowanie w szerokiej gamie testów immunoanalitycznych, sensor zostaje funkcjonalizowany przeciwciałem antyhaptenowym. Przeciwciała specyficzne dla danego testu są modyfikowane poprzez kowalencyjną koniugację znacznika haptenowego z jednym przeciwciałem oraz biotyny z drugim. Znacznik biotynowy służy do związania przeciwciała z magnetycznymi kulkami sprzężonymi ze streptawidyną, które w połączeniu z przeciwciałem znakowanym haptenem są wykorzystywane do wychwytywania anality w układzie kanapkowym. Kompleks wiąże się z chipem poprzez oddziaływanie antyhapten/hapten. Po zakończeniu każdego cyklu pomiarowego sensory są oczyszczane rozcieńczonym kwasem, co umożliwia sekwencyjną analizę kolumn z płytki 96-dołkowej.

W niniejszym materiale przedstawiamy metodę opracowania specjalistycznego testu AMMP dla białek gospodarza CHO (CHO-HCP) na potrzeby rozwoju bioprocesów. Opracowanie testów AMMP lub modyfikacja istniejących testów w celu przekształcenia ich w testy AMMP może zapewnić lepsze parametry (powtarzalność, czułość) w próbkach złożonych oraz skrócić czas pracy operatora. Protokół opisuje etapy opracowania, a sekcja dyskusji przedstawia reprezentatywne wyniki. W celu uzyskania bardziej szczegółowych wyjaśnień dotyczących optymalizacji testów i parametrów dostosowania prosimy o kontakt z firmą BioScale. Zestaw ten oferuje ogólne testy do rozwoju bioprocesów, takie jak testy na pozostałą Proteinę A, miano produktu oraz CHO-HCP.

Protokół

1. Przygotowanie mikrocząsteczek

1. Znakowanie przeciwciał z wykorzystaniem chemii biotyny NHS
2. Oznaczenie stopnia biotinylacji
3. Koniugacja kulek z streptawidyną z przeciwciałem biotinylowanym
   1. Resuspender kulki w oryginalnej fiolce poprzez mieszanie na wirówce (vortexowaniu) przez 1-2 minuty
   2. Odmiarzyć pożądaną objętość kulek do probówki do mikrocentryfugi
   3. Przemyć kulki 3 razy buforem PBST:
      1. Umieścić probówkę z kulkami na magnesie na 2 minuty
      2. Usunąć nadsącz poprzez aspirację, trzymając probówkę na magnesie. Należy uważać, aby nie zakłócić osadu kulek
      3. Zdjąć probówkę z magnesu i dodać 1 mL PBST
      4. Mieszać na wirówce przez 20 sekund w celu resuspensji kulek
      5. Wirować przez 5 sekund, aby usunąć kulki z nakrętki
      6. Powtórzyć etapy 2.3.1-2.3.5 jeszcze dwukrotnie
   4. Po trzecim przemyciu umieścić probówkę na magnesie i odessać PBST
   5. Dodać przeciwciało biotinylowane do kulek i resuspender
   6. W razie potrzeby uzupełnić objętość przeciwciała biotinylowanego do 300 μL za pomocą PBS. Jeśli objętość przeciwciała jest już większa niż 300 μL, nie dodawać PBS
   7. Inkubować zawiesinę kulek z przeciwciałami przez 30 minut w RT na mieszalce wibracyjnej lub rotatorze do probówek
   8. Przemyć 3 razy PBST zgodnie z procedurą opisaną w punkcie 3
   9. Zablokować kulki za pomocą biotinylowanego BSA
      1. Po trzecim przemyciu dodać 10 μg/mg biotinylowanego BSA, w razie potrzeby dostosować objętość do 300 μL za pomocą PBS i inkubować z mieszaniem przez 30 minut
   10. Przemyć 3 razy PBST zgodnie z procedurą opisaną w punkcie 3
   11. Resuspender kulki w 100 μL PBS/0,05% BSA. Do długoterminowego przechowywania można dodać azydek sodu
4. Zgodnie ze standardowymi protokołami NHS dla fluoresceiny, przeprowadzić fluoresceinowanie przeciwciała detekcyjnego
5. Oznaczyć stopień fluoresceinowania

2. HCP – Rozwój

1. Przygotowanie roztworów roboczych:
   1. Przeciwciało znakowane fluoresceiną (Fl-Ab): Większość testów CHO-HCP wykorzystuje Fl-Ab w końcowym stężeniu 400 ng/mL. Fl-Ab dodaje się w ilości stanowiącej ¼ końcowej objętości testu, zatem stężenie roztworu roboczego wynosi 1,6 μg/mL. Roztwór ten należy przygotować poprzez rozcieńczenie zapasu FlAb za pomocą BioScale Bead/FlAb Diluent.
   2. Kuleczki: Większość testów CHO-HCP wykorzystuje kuleczki w końcowym stężeniu 2x10⁵ beads/mL. Odczynnik z kuleczkami stanowi ¼ końcowej objętości testu; zatem stężenie roztworu roboczego wynosi 8x10⁵ beads/mL. Roztwór ten należy przygotować poprzez rozcieńczenie zapasu kuleczek za pomocą BioScale Bead/FlAb Diluent. Przed pobraniem aliquotu należy dokładnie wymieszać zapas kuleczek w wirówce typu vortex, aby upewnić się, że wszystkie kuleczki znajdują się w zawiesinie.
   3. Bufor roboczy: Skład buforu roboczego może wymagać optymalizacji pod kątem przeciwciał użytych do opracowania testu, jednak kilka testów CHO-HCP opracowano z użyciem buforu 10 mM HEPES, 1% Tween, pH 7,5. Firma BioScale opracowała dodatek do buforu roboczego (dostarczany w zestawie do opracowania), który dodaje się do buforu do stężenia 1% przed użyciem.
2. Rozcieńczyć kalibratory i próbki za pomocą BioScale Sample Diluent.

3. Konfiguracja systemu ViBE

1. Włącz stację roboczą ViBE
2. Podłącz zasilanie systemu i odpływ odpadów
3. Przepłucz system (priming)
4. Włóż kartridż ViBE
5. Poprowadź rurki
6. Przygotuj szablon analizy, wypełniając arkusz zatytułowany „Sample Setup”. System BioScale umożliwia stworzenie osobnego szablonu analizy dla każdego badania na stacji roboczej ViBE. Pozwala to użytkownikowi na edytowanie i zapisywanie szczegółowych uwag w arkuszu „Notes” szablonu dla różnych analiz, co zapewnia prowadzenie pełnej dokumentacji eksperymentu.
7. Wstępna konfiguracja szablonu analizy: Rozpocznij od wypełnienia tabeli (lewy górny róg) zakresu stężeń standardów w analizie w arkuszu „Sample Setup”.
8. Następnie wprowadź dodatkowe informacje w tabeli po prawej stronie standardów (konfiguracje Simple Column Read Setup, One Reagent Add oraz Two Reagent Add), aby poinstruować stację roboczą ViBE, jak długo próbki muszą być inkubowane, jaka objętość odczynnika ma zostać przeniesiona, jak długi musi być czas akumulacji próbki oraz czy konieczne jest kondycjonowanie czujnika i dekontaminacja sond oraz kartridża itp.
9. Wypełnij układ płytki (plate layout).
10. Napełnij płytki próbkami/odczynnikami. System ViBE poda wymagane objętości dla płytki z odczynnikami. Objętość próbki może być zmienna, ale dobrym punktem wyjścia jest połowa całkowitej objętości analizy wynoszącej 120 μL.
11. Nałóż pokrywy na płytki. Załaduj płytki na pokład stacji roboczej.
12. Uruchom kreator startowy analizy, przejdź przez kroki kreatora i rozpocznij analizę.

4. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1: Kanapkowy immunotest AMMP

Na stacji roboczej ViBE test AMMP służy do pomiaru stężenia antygenu. Sygnał jest mierzony, gdy przeciwciało typu kuleczka-antygen-hapten wiąże się z sensorem poprzez oddziaływanie hapten/antyhapten. Regeneracja przywraca sensor do stanu początkowego poprzez usunięcie kompleksów immunologicznych.

Rysunek 2: Krzywa kalibracyjna testu AMMP dla CHO-HCP

Rysunek 2 powyżej przedstawia przykład krzywej kalibracyjnej testu CHO HCP AMMP. Analizę można przeprowadzić w próbkach z całego procesu oczyszczania, w tym z reaktora, z wysoką precyzją i powtarzalnością.

Rysunek 3: Krzywa kalibracyjna testu AMMP dla białka A

Rysunek 3 przedstawia krzywą kalibracyjną dla testu Residual Protein A AMMP, wykonanego przy użyciu zestawu VIBE Residual Protein A Assay Kit. Ten sam zestaw może być wykorzystany do szybszego testu z 30-minutowym okresem inkubacji lub w celu uzyskania bardziej czułych wyników i szerszego zakresu dynamicznego przy dłuższym okresie inkubacji, bez utraty precyzji lub dokładności, które w obu przypadkach są zazwyczaj lepsze niż w przypadku równoważnych testów ELISA wykonywanych przez użytkowników

Rysunek 4: Analiza AMMP miana produktu

Stacja robocza ViBE może być również wykorzystywana do oznaczania miana produktu, którego wyniki przedstawiono na rysunku 4. W przeciwieństwie do innych testów AMMP, procedura ta nie wymaga wstępnego przygotowania próbek poza zwykłym rozcieńczeniem ani stosowania kulek, a dokładność oznaczania ilościowego została zweryfikowana w próbkach „bez wirowania” zawierających ponad 10 milionów komórek w szerokim zakresie żywotności.

Rycina 5: Krzywa standardowa testu AMMP dla analizy biomarkera GST-Gadd34

Na rysunku 5 przedstawiono krzywą wzorcową sygnału uzyskanego za pomocą urządzenia ViBE BioAnalyzer (Panel A) lub technologii AlphaScreen z wykorzystaniem rekombinowanego białka GST-Gadd34. Wyniki na platformie ViBE były około logarytmicznie bardziej czułe przy zastosowaniu tych samych przeciwciał. AMMP wykorzystuje pomiar mniejszej liczby większych cząsteczek, a mimo to korzysta z przechwytywania w fazie ciekłej i tworzenia kompleksów detekcyjnych.

Rycina 6: Krzywa wzorcowa testu AMMP dla GST-Gadd34 w próbce guza

Na rysunku 6 przebadano indukcję Gadd34 w ksenograftach CWR22 w obecności lub w braku boronowego inhibitora proteasomu, analizując wyniki za pomocą ViBE BioAnalyzer (Panel A) lub AlphaScreen (Panel B). Platforma ViBE była w stanie dostarczyć czułe i powtarzalne wyniki w ksenograftach nowotworowych in vivo, podczas gdy sygnał AlphaScreen ulegał wygaszeniu wraz ze wzrostem liczby μg białka.

Niniejszy przykład demonstruje możliwości technologii AMMP w przypadku próbek o wysokim stopniu złożoności. Dzięki czułemu chipowi detekcyjnemu oraz wysokiej wydajności magnesu umieszczonego w pobliżu chipów, niewielka liczba magnetycznych mikrocząsteczek może efektywnie i powtarzalnie wyłapywać rzadkie cele z otoczenia złożonego z lizowanych komórek (w tym odczynników do lizy) oraz zanieczyszczeń krwi.

Dyskusja

Powyższe przykłady demonstrują wysoką czułość wyników ilościowych metody AMMP w złożonych próbkach. Taka wydajność, zapewniona dzięki łatwości i kontroli nad wprowadzaniem odczynników do systemu, umożliwia szeroki wachlarz zastosowań. Mogą one być specyficzne dla konkretnego celu, jak w przypadku Gadd34 w guzie, lub ogólne dla całego spektrum celów, jak przy wykrywaniu i ilościowym oznaczaniu białek komórek gospodarza w próbkach pobieranych z różnych etapów procesu oczyszczania. Platforma ViBE o niskich kosztach eksploatacji w połączeniu z niezwykle elastyczną metodą AMMP stanowi potężne narzędzie do przeprowadzania kluczowych analiz.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw do znakowania NHS-Chromogenic-biotin lub NHS-Chromogenic Biotin Labeling kit
W przypadku zakupu NHS-Chromogenic-biotin jako odczynnika wymagane będą następujące dodatkowe materiały
Mieszalny z wodą rozpuszczalnik organiczny, taki jak dimetylosulfotlenek (DMSO) lub dimetylformamid (DMF)
Fosforan bufor solny (PBS) lub inny bufor wolny od amin (pH 7 – 9)
Kolumny do odsalania lub jednostki do dializy w celu wymiany buforu
Spektrofotometr umożliwiający pomiar przy 354 i 280 nm – do pomiaru stężeń białka i biotyny
Przeciwciało biotynilowane (2-5 biotyn/Ab)
Magnetyczne kulki streptawidynowe	BioScale		(10 mg/mL) ~108 kulek/mg
Magnes do probówek mikrocentryfużkowych	New England Biolabs	kat. nr S1510S
Biotynilowana BSA do blokowania
Fosforan bufor solny (PBS)
PBS 0.1% Tween 20
Vortex
Uchwyt mikrocentryfużkowy do Vortexu lub rotator do probówek
Przeciwciało lub białko do znakowania
Zestaw do znakowania NHS-Fluorescein lub NHS-Fluorescein Labeling kit
W przypadku zakupu NHS-Fluorescein jako odczynnika wymagane będą następujące dodatkowe materiały
Mieszalny z wodą rozpuszczalnik organiczny, taki jak dimetylosulfotlenek (DMSO) lub dimetylformamid (DMF)
50 mM boran, pH 8.5 lub inny bufor wolny od amin (pH 7 – 9)
Kolumny do odsalania lub jednostki do dializy w celu wymiany buforu
Pomiar stężeń białka i fluoresceiny wymaga spektrofotometru umożliwiającego pomiar przy 493 i 280 nm.
Rozcieńczalnik	BioScale		do rozcieńczania kulek i FlAb
Rozcieńczalnik próbek	BioScale		do rozcieńczania próbek i kalibratorów
Dodatek do buforu roboczego	BioScale