Obciążanie zakończeń nerwowych Drosophila wskaźnikami wapnia

Podsumowanie

Wapń jest powszechnie występującym przekaźnikiem w układzie nerwowym, niezbędnym do wyzwalania uwalniania neuroprzekaźników oraz zmian w sile synaptycznej. W niniejszym materiale prezentujemy technikę wprowadzania wskaźników Ca²⁺ do zakończeń nerwowych Drosophila. Przedstawiamy również sposób wykonania niezbędnej aparatury i podkreślamy kwestie kluczowe dla sukcesu tej techniki.

Streszczenie

Wapń pełni wiele ról w układzie nerwowym, ale żadna nie jest bardziej imponująca niż rola wyzwalacza uwalniania neuroprzekaźników, a żadna nie jest bardziej znacząca niż rola przekaźnika niezbędnego dla plastyczności synaptycznej, która warunkuje uczenie się i pamięć. Aby dalej wyjaśnić molekularne podstawy mechanizmów synaptycznych zależnych od Ca²⁺, wymagany jest system modelowy, który jest jednocześnie plastyczny genetycznie i dostępny fizjologicznie. Taki model stanowi Drosophila melanogaster. W tym systemie dostępne są genetycznie kodowane wskaźniki fluorescencyjne, które pozwalają wykrywać zmiany Ca²⁺ w zakończeniach nerwowych. Wskaźniki te mają jednak ograniczoną czułość na Ca²⁺ i często wykazują nieliniową odpowiedź. Syntetyczne wskaźniki fluorescencyjne są lepiej dostosowane do pomiaru szybkich zmian Ca²⁺ związanych z aktywnością nerwów. Przedstawiamy tutaj technikę wprowadzania syntetycznych wskaźników Ca²⁺ sprzężonych z dekstranem do żywych zakończeń nerwowych w larwach Drosophila. Szczególny nacisk położono na te aspekty protokołu, które są najbardziej krytyczne dla powodzenia techniki, takie jak unikanie wyładowań elektrostatycznych wzdłuż izolowanych nerwów, utrzymanie żywotności preparatu podczas przedłużonych okresów ładowania oraz zapewnienie przeżycia aksonów poprzez dostarczenie Ca²⁺ w celu wspomagania uszczelniania przeciętych końców aksonów. Dostępne są niskoprocentowe wskaźniki Ca²⁺ sprzężone z dekstranem, takie jak fluo-4 i rhod, które wykazują wysoki stosunek sygnału do szumu, minimalnie zakłócając presynaptyczną dynamikę Ca²⁺. Sprzężenie z dekstranem pomaga zapobiec sekwestracji wskaźników Ca²⁺ w organellach, takich jak mitochondria. Technikę ładowania można stosować w równym stopniu do larw, embrionów i osobników dorosłych.

Protokół

1. Wybierz czystą szalkę do sekcji, która nie miała kontaktu z żadnymi utrwalaczami.
   
   
2. Przeprowadź sekcję larwy Drosophila w 3^rd stadium (faza wędrowania) w pożywce Schneider's Drosophila Medium zawierającej Ca²⁺ i L-glutaminę (należy unikać przecinania nerwów oraz uszkadzania włókien mięśniowych nr 7, 6, 13 lub 12).
   
   
3. Wybierz szklaną pipetę do napełniania z końcówką o średnicy wewnętrznej 12 mikronów.
   
   
4. Używając strzykawki i drenu (w celu wytworzenia podciśnienia w pipecie), upewnij się, że końcówka pipety nie jest zablokowana.
   
   
5. Wybierz cienki plastikowy filament do napełniania, który można wsunąć wzdłuż szklanej pipety.
   
   
6. Naciągnij ok. 1 cm 5 mM wskaźnika Ca²⁺ sprzężonego z dekstranem do plastikowego filamentu.
   
   
7. Przetnij wszystkie nerwy segmentalne.
   
   
8. Oprzyj pipetę na rampie w taki sposób, aby końcówka pipety mogła zbliżyć się do linii środkowej brzusznej sekcjonowanej larwy.
   
   
9. Wciągnij do końcówki pipety odcięty koniec nerwu z segmentu nr 4, nie ściskając przy tym nerwu (dołącz niewielką ilość pożywki Schneidera).
   
   
10. Zdejmij dren i wsuń plastikowy filament do pipety, aż koniec filamentu znajdzie się w odległości 50 mikronów od odciętego końca nerwu (unikaj dotykania nerwu).
    
    
11. Wtryśnij na zakończenie nerwu odpowiednią ilość wskaźnika Ca²⁺, aby zwiększyć objętość pożywki Schneidera o około 33% (stężenie końcowe powinno wynosić < 2mM). Ważne – czynność tę należy wykonać w ciągu 5 minut od przecięcia nerwu.
    
    
12. Przechowuj preparat w ciemności w temperaturze pokojowej podczas ładowania nerwu.
    
    
13. Po 40 minutach usuń wskaźnik Ca²⁺ za pomocą filamentu.
    
    
14. Pozostaw pipetę na miejscu i wypełnij ją całkowicie świeżą pożywką Schneidera, która posłuży do aplikowania impulsów stymulujących nerw.
    
    
15. Pozostaw wskaźnik Ca²⁺ do wyrównania w nerwie przez co najmniej 60 minut, ale nie dłużej niż 4 godziny przed rozpoczęciem obrazowania Ca²⁺.
    
    
16. Płucz preparat świeżą pożywką Schneidera co 30 minut podczas procesu wyrównywania.
    
    
17. Na 20 minut przed obrazowaniem zastąp pożywkę Schneidera roztworem Hemolymph-Like No.6 (HL6; Macleod et al. 2002; 2003).
    
    
18. Do roztworu HL6 można dodać kwas L-glutaminowy lub glutaminian w stężeniu 7mM, aby odwrażliwić postsynaptyczne receptory glutaminianu i zapobiec skurczom mięśni wywołanym stymulacją nerwu (Macleod et al. 2004; Reiff et al. 2002; 2005).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pożywka dla owadów Schneidera’s	Odczynnik	Sigma-Aldrich	S0146	musi zawierać L-glutaminę i wapń
Hydrat monosodowy kwasu L-glutaminowego	Odczynnik	Sigma-Aldrich	G1626