Wczesny rozwój muszki owocówki, Drosophila melanogaster, charakteryzuje się szeregiem zmian kształtu komórek, które są bardzo odpowiednie dla metod obrazowania. Niniejszy artykuł opisze podstawowe narzędzia i metody niezbędne do konfokalnego obrazowania zarodków Drosophila na żywo, koncentrując się na procesie zmiany kształtu komórek zwanym cellularizacją.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie zmian kształtu komórek w żywych zarodkach Drosophila
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Rozwijający się embrion Drosophila melanogaster przechodzi szereg zmian kształtu komórek, które są bardzo podatne na obrazowanie konfokalne żywych tkanek. Zmiany kształtu komórek u muchy są analogiczne do tych występujących u organizmów wyższych i napędzają morfogenezę tkanek. W związku z tym, w wielu przypadkach ich badanie ma bezpośrednie znaczenie dla zrozumienia chorób ludzkich (Tabela 1)1-5. W skali subkomórkowej zmiany kształtu komórek są wynikiem procesów obejmujących od ekspresji genów po transdukcję sygnałów, polaryzację komórek, przebudowę cytoszkieletu i transport błonowy. Tym samym embrion Drosophila dostarcza nie tylko kontekstu do oceny zmian kształtu komórek w odniesieniu do morfogenezy tkanek, ale oferuje również w pełni fizjologiczne środowisko do badania procesów subkomórkowych, które nadają kształt komórkom.
Opisany tutaj protokół został opracowany w celu obrazowania specyficznej zmiany kształtu komórek nazywanej cellularyzacją. Cellularyzacja jest procesem gwałtownego wzrostu błony plazmatycznej, który ostatecznie przekształca embrion syncytialny w komórkową blastodermę. Oznacza to, że w interfazie 14. cyklu mitotycznego błona plazmatyczna jednocześnie uwypukla się do wewnątrz wokół każdego z około 6000 jąder zakotwiczonych w korze, tworząc warstwę pierwotnych komórek nabłonkowych. W przeciwieństwie do wcześniejszych sugestii, cellularyzacja nie jest napędzana kurczliwością Miozyny-26, lecz wynika głównie z egzocytozy błony z zapasów wewnętrznych7. W związku z tym cellularyzacja stanowi doskonały system do badania transportu błonowego podczas zmian kształtu komórek wymagających invaginacji lub ekspansji błony plazmatycznej, takich jak cytokineza czy morfogeneza cewek poprzecznych (T-tubules) w mięśniach.
Należy zauważyć, że protokół ten można łatwo zastosować do obrazowania innych zmian kształtu komórek w embrionie muchy, co wymaga jedynie niewielkich adaptacji, takich jak zmiana stadium zbierania embrionów lub użycie „kleju do embrionów” w celu zamocowania embrionu w określonej orientacji (Tabela 1)8-19. W każdym przypadku schemat postępowania jest zasadniczo taki sam (Rysunek 1). Do przygotowania stabilnych linii much wyrażających białko zainteresowania, połączone z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) lub jego wariantami, stosuje się standardowe metody klonowania i transgenezy Drosophila; muchy te stanowią odnawialne źródło embrionów. Alternatywnie, białka fluorescencyjne/sondy wprowadza się bezpośrednio do embrionów much za pomocą prostych technik mikroiniekcji9-10. Następnie, w zależności od zdarzenia rozwojowego i zmiany kształtu komórek poddawanych obrazowaniu, embriony są zbierane i etapowane na podstawie morfologii pod mikroskopem stereoskopowym, a na koniec pozycjonowane i montowane do obrazowania time-lapse na mikroskopie konfokalnym.
Protokół
1. Złożenie naczyń do zbierania zarodków
- Za pomocą żyletki odciąć dno zlewki Tri-corn o pojemności 10 mL, dbając o to, aby krawędź była jak najgładka. Kubki są łatwiejsze w obsłudze, jeśli przytnie się również trzy narożniki górnej krawędzi, choć nie jest to absolutnie konieczne.
- Wyciąć kwadrat z siatki drucianej (6 cm x 6 cm). Na uprzednio rozgrzanej płycie grzewczej, wewnątrz dygestorium, położyć kwadrat siatki na kawałku wytrzymałej folii aluminiowej. Mocno docisnąć odciętą dolną krawędź kubka do gorącej siatki. Odczekać kilka sekund, a następnie podnieść kubek z przymocowaną siatką. Jeśli folia również przyklei się do siatki, należy ją po prostu odkleić.
- Pozostawić kubek do schłodzenia na noc. Odciąć nadmiar siatki nożyczkami i wyszlifować wszystkie ostre krawędzie papierem ściernym o drobnej ziarnistości.
2. Przygotowanie płytek z agarem z soku jabłkowego
- W kolbie o pojemności 6L wymieszaj 10 g BD Bacto Agar i 3L wody destylowanej. Sterylizuj agar w autoklawie przez 30 minut przy ustawieniu powolnego upustu pary (slow exhaust).
- W kolbie o pojemności 2L z mieszadełkiem magnetycznym połącz 10 g sacharozy, 1L soku jabłkowego i 6 g kwasu p-hydroksybenzoowego. Podgrzewaj roztwór do wrzenia, mieszając na płycie grzewczej. Nie gotuj przez więcej niż 2 minuty. Pozostaw mieszaninę soku jabłkowego do ostygnięcia, a następnie dodaj ją do agaru, używając mieszadełka magnetycznego. Wymieszaj całkowicie.
- Pozostaw połączony roztwór do ostygnięcia w kąpieli wodnej o temperaturze 60°C przed przelaniem do szalek Petriego o wymiarach 60x15 mm. Alternatywnie do dozowania agaru można użyć pompy perystaltycznej. Pozostaw płytki do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez co najmniej 4 godziny. Ułóż je w pojemnikach Rubbermaid z warstwą mokrych ręczników papierowych i przechowuj w temperaturze 4°C.
Uwagi:
- Jesienią lub zimą może być konieczne dodanie do agaru dodatkowych 10 mL wody.
- Marka szalek Petriego ma znaczenie! Tylko szalki BD Falcon pasują do zlewków Tri-corn. Szczegółowe informacje dotyczące zamawiania znajdują się w poniższej tabeli Materiałów.
3. Dodanie much GFP do kubków do zbierania embrionów
- Zwiększ populację linii GFP zgodnie z zapotrzebowaniem na kolekcję, przygotowując butelki z muchami około dwóch tygodni przed obrazowaniem. Jedna butelka much zazwyczaj w zupełności wystarcza do wypełnienia jednego kubka do zbierania embrionów z minimum 50 samicami i 30 samcami. Aby zapewnić optymalne składanie jaj, muchy powinny być nowo wyklucone (tzn. mniej niż 5 dni po wyjściu z poczwarki).
- Przygotuj pastę drożdżową, wypełniając mały kubek mniej więcej równymi częściami suchych drożdży aktywnych Red Star i wody destylowanej, a następnie mieszaj do czasu rozpuszczenia drożdży. Pasta powinna mieć konsystencję zbliżoną do mokrego masła orzechowego. W celu zmiany konsystencji można dodać więcej drożdży lub wody. Pastę drożdżową można stosować przez kilka dni; należy ją przechowywać w temperaturze 4°C pod przykryciem.
- Po przygotowaniu pasty drożdżowej wyjmij szalki z sokiem jabłkowym z przechowywania w temperaturze 4°C. Nanieś pastę drożdżową na szalki z sokiem jabłkowym i pozwól im ogrzać się do 2-25°C, co pobudzi muchy do składania jaj.
- Złóż okrągły papier filtracyjny na pół, a następnie ponownie na pół. Przytnij go do średnicy 8-9 cm i wykonaj zakładki w formie harmonijki w ćwiartce koła. Rozłóż koło, odwróć je i włóż do kubka do zbierania, aż dotknie siatki. Upewnij się, że papier jest stabilnie zamocowany w kubku, aby nie spadł i nie zmiażdżył much. Papier filtracyjny jest opcjonalny, ale stwarza korzystne warunki do kopulacji i utrzymuje wilgotność w kubku.
- Oznacz kubek nazwą linii i datą. Przenieś muchy z butelki do kubka do zbierania, delikatnie potrząsając odwróconą butelką nad kubkiem, a następnie niezwłocznie przykryj kubek przygotowaną szalką z sokiem jabłkowym. Przymocuj szalkę do kubka za pomocą gumki recepturki. Ustaw kubki stroną z siatką do góry w miejscu z bezpośrednim oświetleniem. Upewnij się, że na kubek nie padają żadne cienie, ponieważ muchy nie będą chętnie składać jaj w ciemności.
- Wymieniaj szalki z sokiem jabłkowym w razie potrzeby. Dwugodzinne kolekcje w temperaturze pokojowej sprawdzają się dobrze przy obrazowaniu celularyzacji.
4. Przygotowanie komory montażowej
- Aby przygotować komorę montażową dla embrionów, odetnij kawałek dwustronnej taśmy o długości 2-3 cm i umieść go na szkiełku przedmiotowym, wyrównując długą oś taśmy i szkiełka. Odetnij drugi kawałek dwustronnej taśmy o długości 2-3 cm i nałóż go na pierwszy, upewniając się, że ich krawędzie są wyrównane.
- Za pomocą żyletki wykonaj dwa nacięcia w odstępie około 3 mm w centrum taśmy, prostopadle do długiej osi szkiełka. Usuń taśmę pomiędzy nacięciami, aby utworzyć kanał. Do kanału nanieś pipetą kroplę oleju Halocarbon 27. W tym kanale zostaną umieszczone embriony.
Uwagi:
- Tylko dwustronna taśma Scotch o szerokości ½ cala ma odpowiednią grubość, aby pomieścić zarodki.
- Olej Halocarbon 27 jest przepuszczalny dla tlenu, co umożliwia wymianę gazową, zapobiegając jednocześnie odwodnieniu zarodków. Ze względu na swój współczynnik załamania światła, olej Halocarbon 27 jest również idealny do stabilizacji i obrazowania zarodków.
5. Usuwanie otoczek z embrionów
- Aby zebrać i zdechorionować embriony, wlej na płytkę z agarem z soku jabłkowego odpowiednią ilość 50% wybielacza, tak aby całkowicie przykryć całą powierzchnię. Korzystając z mikroskopu stereoskopowego, takiego jak Zeiss Discovery V8 ze światłem przechodzącym, obserwuj moment uwalniania się embrionów z chorionów. Gdy tylko chorion poluzuje się i oddzieli od kilku embrionów (30-60 sekund), przelej wybielacz wraz z embrionami do sitka komórkowego.
- Natychmiast i energicznie przemyj embriony w sitku wodą destylowaną z butelki z atomizerem. Osusz sitko, przykładając je do ręczników papierowych. Jeśli po osuszeniu na ręczniku pojawi się różowy nalot, kontynuuj płukanie embrionów wodą.
- Za pomocą wilgotnego pędzla przenieś 10-50 embrionów na czystą płytkę z agarem z soku jabłkowego (bez pasty drożdżowej). Odsącz wodę poszarpanym brzegiem ręcznika papierowego i natychmiast pokryj embriony niewielką ilością oleju Halocarbon 27 Oil.
Uwagi:
- Nie należy używać wybielacza Clorox. Zamiast tego należy użyć marki takiej jak Austin's A-1 Commercial Bleach, który zawiera <6% podchlorynu sodu.
- Zbyt długie wybielanie lub niewystarczające płukanie spowoduje powstanie miękkich zarodków z nieregularną cellularizacją.
6. Określenie stadium i montaż embrionów
- Używając mikroskopu stereoskopowego z oświetleniem prześwieconym, należy przygotować embriony na płytce zgodnie z wytycznymi morfologicznymi Bownes20. Za pomocą pęsety przenieść 5 embrionów w 1. lub 12. cyklu mitotycznym, co odpowiada stadiom 4 według Bownes, do kanału komory montażowej. Ułożyć embriony w linii, tak aby strony grzbietowa i brzuszna były widoczne, a strona boczna skierowana w dół. W samym oleju embriony łatwo ustawić w tej orientacji. Nie należy układać embrionów zbyt blisko siebie, ponieważ po nałożeniu szkiełka nakrywkowego z dołu zostaną one pozbawione tlenu. (Należy zostawić odstęp wynoszący około połowy długości embrionu między nimi).
- Położyć jedną krawędź szkiełka nakrywkowego o wymiarach 25x25 mm na dwustronnej taśmie klejącej po jednej stronie kanału. Opuścić szkiełko nakrywkowe, aby przykryć kanał. Jeśli pod spodem uwięzione zostanie powietrze, należy nanieść niewielką ilość oleju Halocarbon 27 na krawędź szkiełka nakrywkowego. Działanie kapilarne wciągnie olej do kanału i wypchnie powietrze.
Uwagi:
- Kolejnym doskonałym źródłem do określania stadiów rozwoju embrionów jest następująca pozycja: Campos-Ortega, J. A. and Hartenstein, V. (1985). The Embryonic development of Drosophila melanogaster. Springer-Verlag, Berlin. Choć książka ta nie jest już wydawana, używane egzemplarze są regularnie dostępne na stronie Amazon.com.
- Olej Halocarbon 27 należy stosować oszczędnie. Ułatwi to montaż preparatu. Zapobiegnie to również przypadkowemu wycieknięciu oleju na obiektyw mikroskopu podczas kolejnych etapów obrazowania.
7. Obrazowanie zarodków
- Dalszy przebieg postępowania będzie zależał od rodzaju zmian kształtu komórek, które są obrazowane, oraz od stawianego pytania badawczego. W przypadku jakichkolwiek zmian kształtu, należy umieścić komorę montażową na mikroskopie prostym lub odwróconym, zlokalizować zarodki w świetle przechodzącym, a następnie przełączyć na obrazowanie konfokalne, aby skupić się na interesującym obszarze. Należy stosować najlepsze praktyki mikroskopii konfokalnej, takie jak te omówione w Nikon's MicroscopyU (http://www.microscopyu.com/articles/confocal). Należy być szczególnie rygorystycznym w ograniczaniu mocy lasera podczas naświetlania żywych zarodków, aby zapobiec fotobleakingowi i fototoksyczności.
- W przypadku celularyzacji obrazowanie przeprowadzamy na konfokalnym mikroskopie skaningowym Zeiss 710, używając obiektywu C-Apochromat 40x/1.2W Corr. Mikroskop ten znajduje się w pomieszczeniu z kontrolowaną temperaturą w zakresie 18-20°C. Choć kontrola temperatury nie jest absolutnie niezbędna, jest ona korzystna dla mikroskopu i sprawia, że obrazowanie jest bardziej spójne. Regularnie wykonujemy obrazy w pojedynczej płaszczyźnie, w pobliżu środka zarodka, aby śledzić inwaginacje błony plazmatycznej w przekroju poprzecznym (Rycina 2). Do prostego śledzenia dynamiki inwaginacji wystarczające są odstępy 30-60 sekund w obrazowaniu poklatkowym, a zarodki powinny wytrzymać obrazowanie przez >90 minut bez wyraźnych oznak niedotlenienia.
- Po pozyskaniu obrazów można je analizować przy użyciu dowolnego zestawu programów do analizy obrazu, w tym darmowego oprogramowania z National Institutes of Health o nazwie ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij). Dane można następnie przedstawić w formie filmów (Film 1), sekwencji (Rycina 2) lub kymografów21.
Uwaga:
- Obiektyw C-Apochromat 40x/1.2W Corr z imersją wodną jest odpowiedni do obrazowania w pobliżu przekroju środkowego zarodka dzięki dużej aperturze, która ogranicza aberracje podczas obrazowania głębokich tkanek w próbkach wodnych, zapewniając wysoką rozdzielczość i silny sygnał fluorescencyjny. Ponadto obiektyw ten posiada bardzo duży dystans roboczy (20 μm). Niemniej jednak inne obiektywy z imersją wodną lub glicerynową również będą sprawiały się dobrze, zwłaszcza jeśli interesująca zmiana kształtu komórek może być obrazowana w pobliżu powierzchni zarodka.
8. Metoda alternatywna: Montaż embrionów za pomocą „kleju do embrionów” (embryo-glue)
- Aby obrazować zmiany kształtu komórek inne niż podczas cellularization, może być konieczne zamocowanie embrionów w konkretnej orientacji, której niełatwo jest utrzymać w samym oleju. W takim przypadku należy zastosować inną metodę montażu niż opisana wcześniej. Należy rozpocząć od przygotowania „kleju do embrionów” poprzez połączenie 20 cm taśmy dwustronnej z 250 μL heptanu w fiolce scyntylacyjnej. Fiolkę scyntylacyjną należy umieścić na nutatorze lub platformie rotacyjnej i mieszać przez noc.
- Zanurz żółty końcówkę pipety w kleju do embrionów, a następnie przeciągnij ją wzdłuż szkiełka przedmiotowego, pozostawiając smugę kleju. Podczas odparowywania heptanu należy ułożyć przygotowane embriony w wymaganej orientacji na bloku agaru. (Należy pamiętać, że powierzchnia embrionu, która ma być obrazowana, powinna być zwrócona w stronę agaru. Na przykład, aby obrazować zmiany kształtu komórek podczas tworzenia bruzdy brzusznej, należy zamocować embriony stroną brzuszną do agaru).
- Odwróć szkiełko z klejem i delikatnie dociśnij smugę kleju do embrionów na bloku agaru. Następnie ponownie odwróć szkiełko. Embriony zostaną przytwierdzone w odpowiedniej orientacji. Nałóż dwie warstwy taśmy dwustronnej po obu stronach embrionów, przykryj je olejem Halocarbon 27 i nałóż szkiełko nakrywkowe. Przystąp do obrazowania zgodnie z powyższym opisem.
9. Reprezentatywne wyniki:
Jeśli zarodki są zdrowe, a obrazowanie jest optymalne, proces celularyzacji powinien trwać 50-60 minut, a wgłębienia błony plazmatycznej powinny wniknąć na głębokość niemal 40 µm. Jednakże, jeśli zarodki zostały nadmiernie wybielone, są niedotlenione lub uszkodzone przez fototoksyczność, proces invagination spowolni lub całkowicie ustanie, szczególnie w obszarze obrazowanym. Takie pogorszenie stanu zdrowia zarodków często skutkuje zaburzeniami rozwoju i brakiem wyklucia się larw. Dlatego, aby rzetelnie ocenić stan zdrowia zarodków po obrazowaniu, należy przechowywać preparaty w komorze nawilżonej i obserwować proces wyklucia następnego dnia.
Rysunek 1. Schemat procedury od pobrania zarodków do obrazowania. Przebieg protokołu można podzielić na cztery główne etapy. W pierwszym etapie przygotowuje się wszystkie poszczególne materiały i komponenty, a następnie składa się kubek do zbierania zarodków, płytkę z agarem z sokiem jabłkowym oraz muchy GFP, aby stworzyć środowisko do składania jaj. W drugim etapie zbiera się jaja i zarodki złożone na płytkach z agarem z sokiem jabłkowym. W trzecim etapie zarodki są usuwane z płytki, poddawane ocenie stadium rozwoju i przenoszone do komory montażowej. W czwartym etapie zamontowane zarodki są obrazowane przy użyciu mikroskopu konfokalnego.
Rysunek 2. Reprezentatywne dane z obrazowania poklatkowego procesu cellularizacji. Zarodki są montowane w taki sposób, aby strony grzbietowa (D) i brzuszna (V) były wyraźnie widoczne, a obrazowanie odbywa się w okolicy ich środkowej części, co pozwala na śledzenie owadgacji błony plazmatycznej w przekroju poprzecznym. Przedstawiony tutaj zarodek wykazuje ekspresję sondy GFP-Myosin-2.6, który koncentruje się na końcach wgięć błony plazmatycznej. Zatem śledzenie w czasie postępu tego frontu pozwala wyznaczyć tempo wgięcia błony plazmatycznej. Punkt czasowy 0:0 odpowiada rozpoczynaniu procesu cellularizacji. Wkrótce po punkcie czasowym 56:0 na brzusznej stronie zarodka rozpoczyna się gastrulacja. Odcinek skali wynosi 40 mikronów.
Film 1. Reprezentatywny film z obrazowania poklatkowego cellularizacji. Ten film odpowiada Rysunkowi 2. Aby zarejestrować cały proces cellularizacji, obrazowanie rozpoczęto w poprzednim cyklu mitotycznym 13, obejmując regresję bruzdy pseudopodziału, i kontynuowano aż do momentu zaobserwowania ruchów gastrulacji po stronie brzusznej embrionu. Obrazy pobierano w odstępach jednominutowych. Po akwizycji zwiększono intensywność obrazu, aby ułatwić dostrzeżenie ruchów gastrulacji.
Kliknij tutaj, aby obejrzeć film
| Zdarzenie rozwojowe i czas jego wystąpienia* | Zmiany kształtu komórek związane z | Związek z chorobą lub zdrowiem człowieka | Najnowsze referencje z obrazowaniem w czasie rzeczywistym |
| Tworzenie pseudo-bruzdy podziałowej (4; 90 minut pf) | Cytochineza | Poliploidalizacja a progresja nowotworu1 | Mavrakis i in., 20098 Cao i wsp., 20109 |
| Celularyzacja (5; 130 minut pf) | Cytokineza | Poliploidalizacja a progresja nowotworu1 | Cao i wsp., 200810 Sokac & Wieschaus, 20811 |
| Tworzenie bruzdy brzusznej; Inwagynacja mezodermy (6; 180 minut pf) | Konstrykcja apikalna; Przejście epitelialno-mezenchymalne | Przerzuty nowotworowe2 | Lis & Peifer, 20712 Martin i in., 20913 |
| Wydłużanie pasma zarodkowego (7; 195 minut pf) | Konwergentne wydłużenie | Wady cewy nerwowej3 | Bertet i wsp., 200414 Blankenship i wsp., 200615 |
| Tracheogeneza (1; 320 minut pf) | Tworzenie i rozgałęzianie rurek nabłonkowych | Angiogeneza4 | Caussinus i wsp., 20816 Gervais & Casanova, 201017 |
| Zamykanie grzbietowe (14; 620 minut pf) | Konstrykcja apikalna | Gojenie ran5 | Gorfinkiel i in., 20918 Solon i wsp., 200919 |
Tabela 1. Przykłady zmian kształtu komórek obrazowanych w żywych embrionach muchy
*Numer stadium według Bownesa oraz czas po zapłodnieniu (pf), w którym rozpoczyna się każde zdarzenie, podano zgodnie z publikacją Campos-Ortega, 1985.
| Linia muszek | Etykiety | Oryginalna referencja |
| Spider-GFP (95-1) | Błona komórkowa | Morin i wsp., 20122 |
| Resille-GFP (17-2) | Błona plazmatyczna | Morin i wsp., 20122 |
| GAP43-Venus | Błona plazmatyczna | Mavrakis i wsp., 20098 |
| Dynia spaghetti-GFP (Sqh-GFP) | miozyna-2 | Royou i in., 2026 |
| E-kadheryna-GFP (Ecad-GFP) | Połączenia międzykomórkowe | Oda i wsp., 20123 |
| GFP-mezyna | aktyna F | Kiehart i in., 2024 |
| Utrofina-Venus (Utro-Venus) | aktyna F | Sokac i wsp., wyniki nieopublikowane |
Tabela 2. Przydatne linie do obrazowania zmian kształtu komórek w embrionach muchy
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisany w niniejszym dokumencie protokół umożliwi obrazowanie konfokalne na żywo szeregu zmian kształtu komórek w rozwijającym się zarodku muchy. Linie GFP do obrazowania mogą zostać przygotowane przez poszczególne laboratoria (Tabela 2), lecz wiele takich linii jest również ogólnodostępnych w centrach takich jak Bloomington Drosophila Stock Center na Uniwersytecie w Indianie (http://flystocks.bio.indiana.edu) oraz FlyTrap Stock Center na Uniwersytecie Yale (
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano konfliktów interesów.
Podziękowania
Wyrażamy wdzięczność Ericowi Wieschausowi, który zapewnił podstawy, na których opracowano niniejszy protokół. Nasza praca jest wspierana przez Verna & Marrs McLean Department of Biochemistry and Molecular Biology Start-up Award, Baylor College of Medicine.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Lamelki | Fisher Scientific | 12-550-343 | |
| Kryszki 25x25 | Fisher Scientific | 1 2-524C | |
| Butelki z atomizerem (H2O) | Fisher Scientific | 02-897-11 | |
| Probówki Falcon 50 ml | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Gruszki do małych pipet, 1 mL | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
| Fiolki do scyntylacji z zakrętkami | VWR international | 66021-533 | |
| Zlewki Tri-Corn, 100 mL | Electron Microscopy Sciences | 60970 | |
| Szalki Petriego BD Falcon 60x15mm | Fisher Scientific | 08757 100B | |
| Sito do komórek BD Falcon | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Żółte końcówki do pipet | Rainin | L200 | |
| Siatka ze stali nierdzewnej, 304, 12x24 | Small Parts, Inc. | CX-0150-F-01 | |
| Szklane pipety Pasteura 5¾ cala | Fisher Scientific | 13-678-20B | |
| Papier filtracyjny P4 | Fisher Scientific | 09-803-6F | |
| Gumki recepturki | Office Max | A620645 | |
| Dwustronna taśma Scotch, ½ cala | Office Max | A8137DM-2 | |
| Pędzle malarskie Robert Simmons Expression E85 okrągłe nr 2 | Jerry’s Artarama | 56460 | |
| Pęseta Dumont nr 5 wysokiej precyzji Inox | Electron Microscopy Sciences | 72701-DZ | |
| Żyletki | VWR international | 55411-050 | |
| Olej Halocarbon 27 | Sigma-Aldrich | H 8773 | |
| Heptan | Fisher Scientific | H360-1 | |
| Agar BD Bacto | VWR international | 90000-760 | |
| Sacharoza | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Kwas p-hydroksybenzoesowy | Sigma-Aldrich | H5501 | |
| Aktywne drożdże suszone Red Star | LeSaffre | 15700 | |
| Ręczniki papierowe, składane w C | Kleenex | ||
| Wzmocniona folia aluminiowa | Reynolds Wrap | ||
| Wybielacz | Austin’s A-1 Commercial | ||
| 100% sok jabłkowy | Ocean Spray lub Tree Top |
Bibliografia
- Sagona, A. P., Stenmark, H. Cytokinesis and cancer. FEBS Lett. 584, 2652-2661 (2010).
- Baum, B., Settleman, J., Quinlan, M. P. Transitions between epithelial and mesenchymal states in development and disease. Semin Cell Dev Biol. 19, 294-308 (2008).
- Kibar, Z., Capra, V., Gros, P. Toward understanding the genetic basis of neural tube defects. Clin Genet. 71, 295-310 (2007).
- Jazwinska, A., Ribeiro, C., Affolter, M. Epithelial tube morphogenesis during Drosophila tracheal development requires Piopio, a luminal ZP protein. Nat Cell Biol. 5, 895-901 (2003).
- Martin, P., Parkhurst, S. M. Parallels between tissue repair and embryo morphogenesis. Development. 131, 3021-3034 (2004).
- Royou, A., Field, C., Sisson, J. C., Sullivan, W., Karess, R. Reassessing the role and dynamics of nonmuscle myosin II during furrow formation in early Drosophila embryos. Mol Biol Cell. 15, 838-850 (2004).
- Lecuit, T., Wieschaus, E. Polarized insertion of new membrane from a cytoplasmic reservoir during cleavage of the Drosophila embryo. J Cell Biol. 150, 849-860 (2000).
- Mavrakis, M., Rikhy, R., Lippincott-Schwartz, J. Plasma membrane polarity and compartmentalization are established before cellularization in the fly embryo. Dev Cell. 16, 93-104 (2009).
- Cao, J., Crest, J., Fasulo, B., Sullivan, W. Cortical Actin Dynamics Facilitate Early-Stage Centrosome Separation. Curr Biol. , (2010).
- Cao, J., Albertson, R., Riggs, B., Field, C. M., Sullivan, W. N. uf a Rab11 effector, maintains cytokinetic furrow integrity by promoting local actin polymerization. J Cell Biol. 182, 301-313 (2008).
- Sokac, A. M., Wieschaus, E. Local actin-dependent endocytosis is zygotically controlled to initiate Drosophila cellularization. Dev Cell. 14, 775-786 (2008).
- Fox, D. T., Peifer, M. Abelson kinase (Abl) and RhoGEF2 regulate actin organization during cell constriction in Drosophila. Development. 134, 567-578 (2007).
- Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Pulsed contractions of an actin-myosin network drive apical constriction. Nature. 457, 495-499 (2009).
- Bertet, C., Sulak, L., Lecuit, T. Myosin-dependent junction remodelling controls planar cell intercalation and axis elongation. Nature. 429, 667-671 (2004).
- Blankenship, J. T., Backovic, S. T., Sanny, J. S., Weitz, O., Zallen, J. A. Multicellular rosette formation links planar cell polarity to tissue morphogenesis. Dev Cell. 11, 459-470 (2006).
- Caussinus, E., Colombelli, J., Affolter, M. Tip-cell migration controls stalk-cell intercalation during Drosophila tracheal tube elongation. Curr Biol. 18, 1727-1734 (2008).
- Gervais, L., Casanova, J. In vivo coupling of cell elongation and lumen formation in a single cell. Curr Biol. 20, 359-366 (2010).
- Gorfinkiel, N., Blanchard, G. B., Adams, R. J., Arias, M. artinez, A, Mechanical control of global cell behaviour during dorsal closure in Drosophila. Development. 136, 1889-1898 (2009).
- Solon, J., Kaya-Copur, A., Colombelli, J., Brunner, D. Pulsed forces timed by a ratchet-like mechanism drive directed tissue movement during dorsal closure. Cell. 137, 1331-1342 (2009).
- Bownes, M. A photographic study of development in the living embryo of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 33, 789-801 (1975).
- Sokac, A. M., Wieschaus, E. Zygotically controlled F-actin establishes cortical compartments to stabilize furrows during Drosophila cellularization. J Cell Sci. 121, 1815-1824 (2008).
- Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 15050-15055 (2001).
- Oda, H., Tsukita, S. Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells. J Cell Sci. 114, 493-501 (2001).
- Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila. J Cell Biol. 149, 471-490 (2000).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
