Przedstawiono opis metody profilowania funkcji mitochondriów w komórkach. Wygenerowany profil mitochondrialny dostarcza czterech parametrów funkcji mitochondriów, które można zmierzyć w jednym eksperymentcie: podstawowego tempa oddychania, oddychania związanego z syntezą ATP, przecieku protonów oraz wydolności rezerwowej.
Artykuł metodologiczny
Eksperyment profilu bioenergetycznego z wykorzystaniem komórek mioblastów C2C12
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zdolność do pomiaru metabolizmu komórkowego oraz zrozumienia dysfunkcji mitochondrialnych pozwoliła naukowcom na całym świecie na postępy w badaniach nad rolą funkcji mitochondriów w otyłości, cukrzycy, starzeniu się, nowotworach, funkcjonowaniu układu sercowo-naczyniowego oraz w badaniach toksykologicznych i bezpieczeństwa.
Metabolizm komórkowy to proces pobierania substratów, takich jak tlen, glukoza, kwasy tłuszczowe i glutamina, oraz następująca po nim konwersja energii poprzez szereg enzymatycznie kontrolowanych reakcji utleniania i redukcji. Te wewnątrzkomórkowe reakcje biochemiczne skutkują produkcją ATP oraz uwalnianiem ciepła i produktów ubocznych, takich jak mleczan i CO2, do środowiska pozakomórkowego.
Cenne informacje o stanie fizjologicznym komórek oraz o zmianach tego stanu można uzyskać poprzez pomiar szybkości zużycia tlenu przez komórki, która jest wskaźnikiem oddychania mitochondrialnego – tzw. szybkości zużycia tlenu (Oxygen Consumption Rate) lub OCR. Komórki generują również ATP poprzez glikolizę, czyli konwersję glukozy do mleczanu, niezależnie od obecności tlenu. W hodowlach w studzienkach mleczan jest głównym źródłem protonów. Pomiar kwasu mlekowego wytwarzanego pośrednio poprzez protony uwalniane do medium zewnątrzkomórkowego otaczającego komórki, co powoduje zakwaszenie medium, pozwala wyznaczyć szybkość zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (Extra-Cellular Acidification Rate) lub ECAR.
W tym eksperymencie mioblasty C2C12 są wysiewane z określoną gęstością do płytek hodowlanych Seahorse. Mierzone są podstawowe tempo zużycia tlenu (OCR) oraz tempo zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) w celu ustalenia wartości bazowych. Następnie komórki są poddawane perturbacjom metabolicznym poprzez sekwencyjne dodawanie trzech różnych związków, które zmieniają profil bioenergetyczny komórki.
Niniejszy test został opracowany na podstawie klasycznego eksperymentu służącego do oceny mitochondriów i stanowi podstawę do tworzenia bardziej złożonych doświadczeń mających na celu zrozumienie fizjologicznych i patofizjologicznych funkcji mitochondriów oraz przewidywanie zdolności komórek do reagowania na stres i/lub uszkodzenia.
Protokół
W tym eksperymencie mioblasty C2C12 są wysiewane z określoną gęstością w płytkach do hodowli komórkowej Seahorse. Mierzy się podstawowe tempo zużycia tlenu (OCR) oraz tempo zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) w celu ustalenia wartości bazowych.
1. Iniekcja komórek
Komórki poddawane są zaburzeniom metabolicznym poprzez sekwencyjne dodanie trzech różnych związków, które zmieniają profil bioenergetyczny komórki. Jedna grupa będzie służyć jako kontrola, do której w miejsce „związków” dodawane będzie medium prowadzące.
- Pierwszym wstrzykiwanym związkiem jest oligomycyna. Oligomycyna hamuje syntezę ATP poprzez blokowanie kanału protonowego części Fo syntazy ATP (Kompleks V). W badaniach nad mitochondriami stosuje się ją w celu zapobiegania oddychaniu w stanie 3 (fosforylującym). W przypadku komórek może być ona wykorzystana do rozróżnienia odsetka zużycia O2 przeznaczonego na syntezę ATP od odsetka zużycia O2 niezbędnego do zniwelowania naturalnego przecieku protonów przez wewnętrzną błonę mitochondrialną.
- Drugim wstrzykiwanym związkiem jest FCCP. FCCP (cyjanek karbonylowy p-trifluorometoksyfenylohydrazon) jest jonoforem będącym mobilnym nośnikiem jonów. Jest to czynnik rozprzęgający, ponieważ zaburza syntezę ATP, transportując jony wodoru przez błonę mitochondrialną z pominięciem kanału protonowego syntazy ATP (Kompleks V). To załamanie potencjału błony mitochondrialnej prowadzi do szybkiego zużycia energii i tlenu bez generowania ATP. W tym przypadku wzrośnie zarówno OCR, jak i ECAR – OCR z powodu rozprzęgnięcia, a ECAR, ponieważ komórki starają się utrzymać równowagę energetyczną, wykorzystując glikolizę do generowania ATP.
Opracowanie z użyciem FCCP może służyć do obliczenia „rezerwowej” wydolności oddechowej komórek, definiowanej jako różnica ilościowa między maksymalnym niekontrolowanym OCR a początkowym podstawowym OCR. Przypuszcza się, że utrzymanie pewnej rezerwowej wydolności oddechowej, nawet w warunkach maksymalnego bodźca fizjologicznego lub patofizjologicznego, jest głównym czynnikiem określającym żywotność i/lub przetrwanie komórek. Zdolność komórek do reagowania na stres w warunkach zwiększonego zapotrzebowania na energię jest w dużej mierze zależna od wydolności bioenergetycznej mitochondriów. Wydolność bioenergetyczna ta jest określana przez kilka czynników, w tym zdolność komórki do dostarczania substratu do mitochondriów oraz wydolność funkcjonalną enzymów zaangażowanych w transport elektronów. - Podczas trzeciego wstrzyknięcia do komórek dodaje się rotenon, inhibitor Kompleksu I. Spowoduje to zatrzymanie oddychania mitochondrialnego i umożliwi obliczenie frakcji mitochondrialnej oraz niemitochondrialnej przyczyniających się do oddychania. Zaobserwuje się spadek OCR z powodu upośledzenia funkcji mitochondrialnych, z towarzyszącym mu wzrostem ECAR, gdy komórka przechodzi w stan bardziej glikolityczny w celu utrzymania równowagi energetycznej.
Rotenon jest inhibitorem mitochondrialnym, który zapobiega transferowi elektronów z centrum Fe-S w Kompleksie I do ubichinonu (Koenzym Q). To hamowanie Kompleksu I zapobiega przekształceniu energii potencjalnej w NADH w energię użytkową w postaci ATP.
2. Odczynniki i materiały
- Roztwory oligomycyny, FCCP i rotenonu (Seahorse Mito Stress Test Kit)
- Podłoże robocze DMEM (Seahorse #100965-000)
- DMSO (Sigma D8418)
- Woda destylowana (Gibco 15230-170)
- Bufor kalibracyjny (Seahorse Bioscience)
3. Pożywka wzrostowa
- 500 mL DMEM (Gibco 11965-092)
- 10% FBS (Hyclone SH90070.03)
- 5 mL Penn/Strep (Gibco 15140-122)
- 5 mL pirogronian sodu (Sigma S8636)
- 5 mL Glutamax (Gibco 35050-061)
4. Protokół wysiewania
- Komórki wysiewa się na płytki do hodowli komórkowych XF96 w zagęszczeniu 10 000 komórek/dołek w 100 μL pożywki wzrostowej i inkubuje w temperaturze 37°C przy 10% CO2.
- Komórki przytwierdzą się do płytki do hodowli komórkowych XF96 w ciągu 1 godziny.
- Analizę komórek na płytce XF96 przeprowadza się 24 godziny po wysiewie.
5. Przygotowanie szablonu do analizy
- Za pomocą kreatora testów Assay Wizard (Załącznik I) wygeneruj szablon z następującym układem grup:
Rysunek 1. Układ siatki studzienek określający przypisania kolumn i grup
6. Przygotowanie związku
- Przygotować następujące związki w pożywce XF DMEM Assay w następujący sposób:
10 uM oligomycyny, 30.0 uM FCCP, 20.0 μM rotenonu,
Stężenia te odpowiadają 10-krotnemu rozcieńczeniu, które nastąpi po wstrzyknięciu związków do dołka. Stężenia robocze wynoszą:
1 uM oligomycyny, 3.0 uM FCCP, 2.0 μM rotenonu
7. Wymiana pożywki i przygotowanie komórek
- Umieść płytkę z komórkami na stacji XF Prep Station
- Ustaw końcową objętość pożywki na 160 μL na dołek.
- Inkubuj w inkubatorze w temperaturze 37°C bez CO2 przez 60 minut, aby umożliwić komórkom wstępną ekwilibrację z pożywką do analizy.
8. Ładowanie wkładu czujnika
- Podgrzać związki do 37°C przed załadowaniem do wkładu czujnika, a następnie wprowadzić związki do portów wtryskowych w następujący sposób:
- Kolumny 1-4: Wprowadzić odpowiednio 16, 18 i 20 μL pożywki do testu XF Assay (DMEM) do portów A, B i C.
- Kolumny 5-12:
Wprowadzić 16 μL oligomycyny do portów A
Wprowadzić 18 μL FCCP do portów B
Wprowadzić 20 μL rotenonu do portów C
9. Polecenia protokołu
| Polecenie | Czas (min) | Port |
| Kalibracja | ||
| Równoważenie | ||
| Start pętli | 3X | |
| Mieszanie | 3 | |
| Oczekiwanie | 2 | |
| Pomiar | 3 | |
| Koniec pętli | ||
| Wtrysk | A | |
| Start pętli | 2X | |
| Mieszanie | 3 | |
| Oczekiwanie | 2 | |
| Pomiar | 3 | |
| Wtrysk | B | |
| Start pętli | 2X | |
| Mieszanie | 3 | |
| Oczekiwanie | 2 | |
| Pomiar | 3 | |
| Wtrysk | C | |
| Start pętli | 2X | |
| Mieszanie | 3 | |
| Oczekiwanie | 2 | |
| Pomiar | 3 | |
| Koniec |
Tabela 1. Polecenia protokołu
Dyskusja
Ten test został opracowany na podstawie klasycznego eksperymentu służącego do badania funkcji mitochondriów i stanowi podstawę do tworzenia bardziej złożonych doświadczeń mających na celu zrozumienie różnorodnych zmian w metabolizmie komórkowym, funkcji mitochondriów oraz ogólnej bioenergetyce.
Wszystkie związki użyte w tym eksperymencie powinny zostać zoptymalizowane pod kątem stężenia zapewniającego maksymalny efekt. Oznacza to, że należy przeprowadzić oddzielne doświadczenia z miareczkowaniem, aby ustalić te wartości. Jest to szczególnie ważne w przypadku FCCP, ponieważ krzywa miareczkowania ma tendencję do bycia dość stromej, a zbyt duża ilość FCCP może w rzeczywistości osłabić odpowiedzi w OCR. Typowe zakresy (stężenia końcowe) do przetestowania to:
- 0.1 - 1.0 ug/ mL oligomycyny
- 0.1 - 5.0 uM FCCP
- 0.1 - 1.0 uM rotenonu
Należy pamiętać, że odpowiedzi na każdy z powyższych związków (zwłaszcza FCCP) będą zależeć od składu pożywki do testu (typ bazy, [glucose], [pyruvate], obecność/brak BSA itp.). Ponadto, w przypadku zmiany składu pożywki do testu XF, konieczne będzie ponowne przeprowadzenie optymalizacji. Obecność i stężenie pirogronianu są szczególnie istotne dla uzyskania maksymalnej wydolności oddechowej po dodaniu FCCP. Firma Seahorse Bioscience zaobserwowała w wielu liniach komórkowych, że pominięcie pirogronianu znosi zdolność komórek do maksymalnej odpowiedzi (powyżej poziomu bazowego) na FCCP. Zazwyczaj należy przetestować stężenia pirogronianu w zakresie 1-10 mM, aby określić optymalne stężenie pozwalające na uzyskanie maksymalnego oddychania. Należy zauważyć, że [pyruvate] ORAZ [glucose] mogą wymagać „tytracji krzyżowej” w celu uzyskania optymalnych warunków pożywki dla danego eksperymentu.
Typowe wyniki tego eksperymentu przedstawiono poniżej na wykresie zależności OCR od czasu oraz na innym wykresie zależności ECAR od czasu:
Rysunek 2. OCR w funkcji czasu
Rycina 3. ECAR w funkcji czasu
W tym przypadku zaobserwowano oczekiwane odpowiedzi w zakresie OCR i ECAR podczas traktowania komórek kolejno poszczególnymi związkami. W przypadku oligomycyny OCR spada w wyniku zablokowania syntezy ATP w kompleksie V mitochondrium. Ponieważ komórki nie są w stanie syntetyzować ATP drogą OXPHOS, przechodzą na glikolizę, aby zaspokoić zapotrzebowanie na ATP, co skutkuje obserwowanym wzrostem ECAR. Jak wykazano wcześniej, FCCP działa jako czynnik rozprzęgający. Ponieważ komórki muszą teraz zniwelować przeciek protonów przez wewnętrzną błonę mitochondrialną, OCR znacząco wzrasta, gdyż zużywane jest więcej O2 w celu wypompowania nadmiaru protonów z powrotem przez błonę mitochondrialną. Na koniec rotenon hamuje odpowiednio kompleks I i kompleks III mitochondrium, co powoduje przerwanie przepływu elektronów w łańcuchu transportu elektronów, a w konsekwencji drastyczny spadek zużycia O2.
Rysunek 4. Parametry oddychania
Poza oczekiwanymi zmianami w oddychaniu i ECAR, z tych danych można uzyskać szereg parametrów oddechowych. Zostało to podsumowane na powyższej rysunku:
Tutaj widzimy, że możemy uzyskać informacje o oddychaniu podstawowym komórek, procencie zużycia O2 przeznaczonym na produkcję ATP, a także ilości przeznaczonej na utrzymanie gradientu protonowego (wynikającego z wycieku H+). Ponadto możemy uzyskać maksymalną szybkość oddychania w warunkach oddychania rozprzężonego (czasami określanego jako rezerwowa wydolność oddechowa), a na koniec możemy określić ilość zużycia O2, która nie wynika z procesów mitochondrialnych.
Coraz więcej badań wykorzystuje ten profil mitochondrialny do oceny bioenergetyki komórkowej, identyfikacji dysfunkcji mitochondriów oraz przewidywania zdolności komórek do odpowiedzi na stres i/lub uszkodzenia. Aby uzyskać więcej informacji i szczegółów na temat tej metody eksperymentalnej oraz koncepcji rezerwowej wydolności oddechowej, należy zapoznać się z następującymi publikacjami 1-8.
Oświadczenia
Min Wu, Per Bo Jensen, George W. Rogers i David A. Ferrick są pracownikami firmy Seahorse Bioscience, która produkuje odczynniki i aparaturę przedstawione w niniejszym artykule.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Roztwory oligomycyny, FCCP, rotenonu i antymycyny A | Seahorse Bioscience | Zestaw Seahorse Mito Stress Test Kit | |
| Medium robocze DMEM | Seahorse Bioscience | 100965-000 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Woda destylowana | GIBCO, by Life Technologies | 15230-170 | |
| Bufor kalibracyjny | Seahorse Bioscience |
Bibliografia
- Choi, W. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure. J Neurochem. 109, 1179-1191 (2009).
- Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal. Biochem J. 424, 99-107 (2009).
- Liu, J., Cao, L., Chen, J., Song, S., Lee, I. H., Quijano, C., Liu, H., Keyvanfar, K., Chen, H. Bmi1 regulates mitochondrial function and the DNA damage response pathway. Nature. , 459-7245 (2009).
- Malmgren, S., Nicholls, D. G., Taneera, J., Bacos, K., Koeck, T., Tamaddon, A., Wibom, R., Groop, L., Ling, C., Mulder, H., Sharoyko, V. V. Tight coupling between glucose and mitochondrial metabolism in clonal beta-cells is required for robust insulin secretion. J Biol Chem. 284, 32395-32404 (2009).
- Dranka, B. P., Hill, B. G., Darley-Usmar, V. M. Mitochondrial reserve capacity in endothelial cells: The impact of nitric oxide and reactive oxygen species. Free Radic Biol Med. 48, 905-914 (2010).
- Perez, J., Hill, B. G., Benavides, G. A., Dranka, B. P., Darley-Usmar, V. M. Role of cellular bioenergetics in smooth muscle cell proliferation induced by platelet-derived growth factor. Biochem J. 428, 255-267 (2010).
- Morán, M., Rivera, H., Sánchez-Aragó, M., Blázquez, A., Merinero, B., Ugalde, C., Arenas, J., Cuezva, J. M., Martín, M. A. Mitochondrial bioenergetics and dynamics interplay in complex I-deficient fibroblasts. Biochim Biophys Acta. , 1802-185 (2010).
- Cárdenas, C., Miller, R. A., Smith, I., Bui, T., Molgó, J. Essential regulation of cell bioenergetics by constitutive InsP3 receptor Ca2+ transfer to mitochondria. Cell. , 142-142 (2010).
Przedruki i uprawnienia
