Artykuł metodologiczny

Eksperyment profilu bioenergetycznego z wykorzystaniem komórek mioblastów C2C12

DOI:

10.3791/2511

⸱

6 grudnia 2010

 ,  ,  ,  ,  , 
1Buck Institute for Age Research, Novato, CA, 2Department of Pathology, Center for Free Radical Biology, University of Alabama at Birmingham - UAB, 3Seahorse Bioscience, North Billerica, MA

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono opis metody profilowania funkcji mitochondriów w komórkach. Wygenerowany profil mitochondrialny dostarcza czterech parametrów funkcji mitochondriów, które można zmierzyć w jednym eksperymentcie: podstawowego tempa oddychania, oddychania związanego z syntezą ATP, przecieku protonów oraz wydolności rezerwowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdolność do pomiaru metabolizmu komórkowego oraz zrozumienia dysfunkcji mitochondrialnych pozwoliła naukowcom na całym świecie na postępy w badaniach nad rolą funkcji mitochondriów w otyłości, cukrzycy, starzeniu się, nowotworach, funkcjonowaniu układu sercowo-naczyniowego oraz w badaniach toksykologicznych i bezpieczeństwa.

Metabolizm komórkowy to proces pobierania substratów, takich jak tlen, glukoza, kwasy tłuszczowe i glutamina, oraz następująca po nim konwersja energii poprzez szereg enzymatycznie kontrolowanych reakcji utleniania i redukcji. Te wewnątrzkomórkowe reakcje biochemiczne skutkują produkcją ATP oraz uwalnianiem ciepła i produktów ubocznych, takich jak mleczan i CO2, do środowiska pozakomórkowego.

Cenne informacje o stanie fizjologicznym komórek oraz o zmianach tego stanu można uzyskać poprzez pomiar szybkości zużycia tlenu przez komórki, która jest wskaźnikiem oddychania mitochondrialnego – tzw. szybkości zużycia tlenu (Oxygen Consumption Rate) lub OCR. Komórki generują również ATP poprzez glikolizę, czyli konwersję glukozy do mleczanu, niezależnie od obecności tlenu. W hodowlach w studzienkach mleczan jest głównym źródłem protonów. Pomiar kwasu mlekowego wytwarzanego pośrednio poprzez protony uwalniane do medium zewnątrzkomórkowego otaczającego komórki, co powoduje zakwaszenie medium, pozwala wyznaczyć szybkość zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (Extra-Cellular Acidification Rate) lub ECAR.

W tym eksperymencie mioblasty C2C12 są wysiewane z określoną gęstością do płytek hodowlanych Seahorse. Mierzone są podstawowe tempo zużycia tlenu (OCR) oraz tempo zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) w celu ustalenia wartości bazowych. Następnie komórki są poddawane perturbacjom metabolicznym poprzez sekwencyjne dodawanie trzech różnych związków, które zmieniają profil bioenergetyczny komórki.

Niniejszy test został opracowany na podstawie klasycznego eksperymentu służącego do oceny mitochondriów i stanowi podstawę do tworzenia bardziej złożonych doświadczeń mających na celu zrozumienie fizjologicznych i patofizjologicznych funkcji mitochondriów oraz przewidywanie zdolności komórek do reagowania na stres i/lub uszkodzenia.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym doświadczeniu mioblasty C2C12 są wysiewane z określoną gęstością w płytkach do hodowli komórkowej Seahorse. Pomiary podstawowego zużycia tlenu (OCR) oraz szybkości zakwaszenia środowiska zewnętrznego (ECAR) są przeprowadzane w celu ustalenia wartości bazowych.

1. Iniekcja komórek

Komórki są poddawane zaburzeniom metabolicznym poprzez trzy następujące po sobie dodania różnych związków, które zmieniają profil bioenergetyczny komórki. Jedna grupa będzie służyć jako kontrola, do której w miejsce „związków” dodawane będzie medium robocze.

  1. Pierwszym wstrzykiwanym związkiem jest oligomycyna. Oligomycyna hamuje syntezę ATP poprzez blokowanie kanału protonowego w części Fo syntazy ATP (Kompleks V). W badaniach nad mitochondriami stosuje się ją w celu zapobiegania oddychaniu w stanie 3 (fosforylującym). W przypadku komórek może być wykorzystana do rozróżnienia procentowego udziału zużycia O2 przeznaczonego na syntezę ATP oraz procentowego udziału zużycia O2 niezbędnego do zniwelowania naturalnego przecieku protonów przez wewnętrzną błonę mitochondrialną.
  2. Drugim wstrzykiwanym związkiem jest FCCP. FCCP (karbonylowy cyjanek p-trifluorometoksyfenylohydrazon) jest jonoforem będącym mobilnym nośnikiem jonów. Jest to czynnik rozprzęgający, ponieważ zakłóca syntezę ATP, transportując jony wodoru przez błonę mitochondrialną z pominięciem kanału protonowego syntazy ATP (Kompleks V). Ten spadek potencjału błony mitochondrialnej prowadzi do szybkiego zużycia energii i tlenu bez generowania ATP. W tym przypadku wzrośnie zarówno OCR, jak i ECAR – OCR z powodu rozprzęgnięcia, a ECAR, ponieważ komórki próbują utrzymać równowagę energetyczną, wykorzystując glikolizę do generowania ATP.
    Opracowanie z użyciem FCCP pozwala obliczyć „rezerwową” wydolność oddechową komórek, definiowaną jako różnica ilościowa między maksymalnym niekontrolowanym OCR a początkowym podstawowym OCR. Przypuszcza się, że utrzymanie pewnej rezerwowej wydolności oddechowej, nawet w warunkach maksymalnej stymulacji fizjologicznej lub patofizjologicznej, jest głównym czynnikiem określającym witalność i/lub przeżywalność komórek. Zdolność komórek do reagowania na stres w warunkach zwiększonego zapotrzebowania energetycznego jest w dużej mierze zależna od wydolności bioenergetycznej mitochondriów. Wydolność bioenergetyczna ta jest określana przez kilka czynników, w tym zdolność komórki do dostarczania substratów do mitochondriów oraz wydolność funkcjonalną enzymów zaangażowanych w transport elektronów.
  3. W trzecim wstrzyknięciu do komórek dodawany jest rotenon, inhibitor Kompleksu I. Pozwoli to na zatrzymanie oddychania mitochondrialnego i umożliwi obliczenie zarówno frakcji mitochondrialnej, jak i pozamitochondrialnej przyczyniającej się do oddychania. Zaobserwuje się spadek OCR z powodu upośledzenia funkcji mitochondrialnych, z jednoczesnym wzrostem ECAR, gdy komórka przechodzi w stan bardziej glikolityczny w celu utrzymania równowagi energetycznej.
    Rotenon jest inhibitorem mitochondrialnym, który zapobiega transferowi elektronów z centrum Fe-S w Kompleksie I do ubichinonu (Koenzym Q). Hamowanie Kompleksu I uniemożliwia przekształcenie energii potencjalnej NADH w energię użytkową w formie ATP.

2. Odczynniki i materiały

  1. Roztwory oligomycyny, FCCP i rotenonu (Zestaw Seahorse Mito Stress Test)
  2. Pożywka robocza DMEM (Seahorse #100965-000)
  3. DMSO (Sigma D8418)
  4. Woda destylowana (Gibco 15230-170)
  5. Bufor kalibracyjny (Seahorse Bioscience)

3. Pożywka do hodowli

  1. 500 mL DMEM (Gibco 11965-092)
  2. 10% FBS (Hyclone SH90070.03)
  3. 5 mL Penn/Strep (Gibco 15140-122)
  4. 5 mL pirogronianu sodu (Sigma S8636)
  5. 5 mL Glutamax (Gibco 35050-061)

4. Protokół wysiewania

  1. Komórki wysiewa się do płytek hodowlanych XF96 w zagęszczeniu 10 000 komórek/dołek w 100 μL pożywki wzrostowej i inkubuje w temperaturze 37°C przy 10% CO2.
  2. Komórki przytwierdzą się do płytki hodowlanej XF96 w ciągu 1 godziny.
  3. Analizę komórek w płytkach XF96 przeprowadza się 24 godziny po wysiewie.

5. Przygotowanie szablonu testu

  1. Używając Kretologa Analiz (Assay Wizard) (Dodatek I), wygeneruj szablon z następującym układem grup:
    Schemat płytki do analizy Seahorse; analiza metabolizmu komórkowego; konfiguracja eksperymentu biochemicznego.
    Rysunek 1. Układ siatki dołków określający przypisania kolumn i grup

6. Przygotowanie związku

  1. Przygotuj następujące związki w pożywce XF DMEM Assay w następujący sposób:
    10 uM oligomycyny, 30.0 uM FCCP, 20.0 μM rotenonu,
    Stężenia te odpowiadają 10-krotnemu rozcieńczeniu, które nastąpi po wstrzyknięciu związków do dołka. Stężenia robocze wynoszą:
    1 uM oligomycyny, 3.0 uM FCCP, 2.0 μM rotenonu

7. Wymiana pożywki i przygotowanie komórek

  1. Umieść płytkę z komórkami na stacji XF Prep Station
  2. Ustaw końcową objętość medium na 160 μL na dołek.
  3. Inkubuj w inkubatorze w temperaturze 37°C bez CO2 przez 60 minut, aby umożliwić komórkom wstępną równowagę z medium do analizy.

8. Załadowanie wkładu czujnika

  1. Podgrzej związki do 37°C przed załadowaniem do kartridża czujnika, a następnie wprowadź związki do portów wtryskowych w następujący sposób:
    1. Kolumny 1-4: Wprowadź odpowiednio 16, 18 i 20 μL pożywki do testu XF Assay (DMEM) do portów A, B i C.
    2. Kolumny 5-12:
      Wprowadź 16 μL oligomycyny do portów A
      Wprowadź 18 μL FCCP do portów B
      Wprowadź 20 μL rotenonu do portów C

9. Polecenia protokołu

PolecenieCzas (min)Port
Kalibracja  
Equlibracja  
Start pętli3X 
Mieszanie3 
Oczekiwanie2 
Pomiar3 
Koniec pętli  
Iniekcja A
Start pętli2X 
Mieszanie3 
Oczekiwanie2 
Pomiar3 
Iniekcja B
Start pętli2X 
Mieszanie3 
Oczekiwanie2 
Pomiar3 
Iniekcja C
Start pętli2X 
Mieszanie3 
Oczekiwanie2 
Pomiar3 
Koniec  

Tabela 1. Polecenia protokołu

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza ta pochodzi z klasycznego eksperymentu służącego do badania funkcji mitochondriów i stanowi podstawę do tworzenia bardziej złożonych doświadczeń mających na celu zrozumienie różnych zmian w metabolizmie komórkowym, funkcji mitochondriów oraz ogólnej bioenergetyce.

Wszystkie związki użyte w tym doświadczeniu powinny zostać zoptymalizowane pod kątem stężenia zapewniającego maksymalny efekt. Oznacza to, że należy przeprowadzić oddzielne eksperymenty miareczkowania, aby ustalić te wartości. Jest to szczególnie istotne w przypadku FCCP, ponieważ krzywa miareczkowania ma tendencję do bycia dość stromej, a nadmiar FCCP może w rzeczywistości osłabić odpowiedzi w OCR. Typowe zakresy (stężenia końcowe) do przetestowania to:

  • 0.1 - 1.0 ug/ mL oligomycyny
  • 0.1 - 5.0 uM FCCP
  • 0.1 - 1.0 uM rotenonu

Należy pamiętać, że odpowiedzi na każdy z powyższych związków (zwłaszcza FCCP) będą zależeć od składu pożywki do analizy (rodzaj bazy, [glucose], [pyruvate], obecność lub brak BSA itp.). Ponadto, w przypadku zmiany składu pożywki do analizy XF, konieczne będzie ponowne przeprowadzenie optymalizacji. Obecność i stężenie pirogronianu są szczególnie istotne dla uzyskania maksymalnej wydolności oddechowej indukowanej przez FCCP. Firma Seahorse Bioscience zaobserwowała w wielu liniach komórkowych, że pominięcie pirogronianu znosi zdolność komórek do maksymalnej odpowiedzi (powyżej poziomu podstawowego) na FCCP. Zazwyczaj należy przetestować stężenia pirogronianu w zakresie 1-10 mM, aby ustalić optymalną wartość zapewniającą maksymalny poziom oddychania. Należy zwrócić uwagę, że [pyruvate] ORAZ [glucose] mogą wymagać „tytracji krzyżowej” w celu uzyskania optymalnych warunków pożywki dla danego eksperymentu.

Typowe wyniki tego eksperymentu przedstawiono poniżej na wykresie obrazującym OCR w funkcji czasu oraz na drugim wykresie obrazującym ECAR w funkcji czasu:

Wykres OCR w funkcji czasu; wpływ oligomycyny, FCCP i rotenonu na tempo metabolicznego oddychania komórkowego.
Rycina 2. OCR w funkcji czasu

Wykres ECAR przedstawiający odpowiedź metaboliczną na oligomycynę, FCCP i rotenon w czasie w badaniu komórkowym.
Rycina 3. ECAR w funkcji czasu

Zaobserwowaliśmy tutaj oczekiwane odpowiedzi OCR i ECAR w miarę traktowania komórek kolejnymi związkami. W przypadku oligomycyny OCR spada w wyniku zablokowania syntezy ATP w kompleksie V mitochondriów. Ponieważ komórki nie są w stanie syntetyzować ATP poprzez OXPHOS, powracają do glikolizy, aby zaspokoić zapotrzebowanie na ATP, co skutkuje obserwowanym wzrostem ECAR. Jak wykazano wcześniej, FCCP działa jako środek rozprzęgający. Ponieważ komórki muszą teraz zniwelować wyciek protonów przez wewnętrzną błonę mitochondrialną, OCR znacznie wzrasta, gdyż zużywane jest więcej O2 w celu przepompowania nadmiaru protonów z powrotem przez błonę mitochondrialną. Na koniec rotenon hamuje odpowiednio mitochondrialny kompleks I i kompleks III, co powoduje zatrzymanie przepływu elektronów w łańcuchu transportu elektronów, a w konsekwencji drastycznie redukuje zużycie O2.

Wykres OCR w funkcji czasu; tempo metabolizmu, obrót ATP, wydolność oddechowa w badaniu mitochondrialnym.
Rycina 4. Parametry oddychania

Poza oczekiwanymi zmianami w oddychaniu i ECAR, z tych danych można uzyskać szereg parametrów oddechowych. Zostało to podsumowane na powyższej rycinie:

Tutaj widzimy, że możemy uzyskać informacje o podstawowym oddychaniu komórek, procencie zużycia O2 przeznaczonego na produkcję ATP, a także o ilości przeznaczonej na utrzymanie gradientu protonowego (wynikającego z wycieku H+). Ponadto możemy uzyskać maksymalną szybkość oddychania w warunkach oddychania rozsprzęgłego (czasami określanego jako rezerwowa wydajność oddechowa), a na koniec możemy określić ilość zużycia O2 niezwiązaną z procesami mitochondrialnymi.

Coraz więcej badań wykorzystuje ten profil mitochondrialny do oceny bioenergetyki komórkowej, identyfikacji dysfunkcji mitochondriów oraz przewidywania zdolności komórek do reagowania na stres i/lub uszkodzenia. Aby uzyskać więcej informacji i szczegółów na temat tej metody eksperymentalnej oraz koncepcji rezerwowej pojemności oddechowej, należy zapoznać się z następującymi publikacjami 1-8.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Min Wu, Per Bo Jensen, George W. Rogers i David A. Ferrick są pracownikami firmy Seahorse Bioscience, która produkuje odczynniki i aparaturę przedstawione w niniejszym artykule.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Roztwory oligomycyny, FCCP, rotenonu i antymycyny ASeahorse BioscienceZestaw Seahorse Mito Stress Test Kit
Medium robocze DMEMSeahorse Bioscience100965-000
DMSOSigma-AldrichD8418
Woda destylowanaGIBCO, by Life Technologies15230-170
Bufor kalibracyjnySeahorse Bioscience

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Choi, W. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure. J Neurochem. 109, 1179-1191 (2009).
  2. Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal. Biochem J. 424, 99-107 (2009).
  3. Liu, J., Cao, L., Chen, J., Song, S., Lee, I. H., Quijano, C., Liu, H., Keyvanfar, K., Chen, H. Bmi1 regulates mitochondrial function and the DNA damage response pathway. Nature. , 459-7245 (2009).
  4. Malmgren, S., Nicholls, D. G., Taneera, J., Bacos, K., Koeck, T., Tamaddon, A., Wibom, R., Groop, L., Ling, C., Mulder, H., Sharoyko, V. V. Tight coupling between glucose and mitochondrial metabolism in clonal beta-cells is required for robust insulin secretion. J Biol Chem. 284, 32395-32404 (2009).
  5. Dranka, B. P., Hill, B. G., Darley-Usmar, V. M. Mitochondrial reserve capacity in endothelial cells: The impact of nitric oxide and reactive oxygen species. Free Radic Biol Med. 48, 905-914 (2010).
  6. Perez, J., Hill, B. G., Benavides, G. A., Dranka, B. P., Darley-Usmar, V. M. Role of cellular bioenergetics in smooth muscle cell proliferation induced by platelet-derived growth factor. Biochem J. 428, 255-267 (2010).
  7. Morán, M., Rivera, H., Sánchez-Aragó, M., Blázquez, A., Merinero, B., Ugalde, C., Arenas, J., Cuezva, J. M., Martín, M. A. Mitochondrial bioenergetics and dynamics interplay in complex I-deficient fibroblasts. Biochim Biophys Acta. , 1802-185 (2010).
  8. Cárdenas, C., Miller, R. A., Smith, I., Bui, T., Molgó, J. Essential regulation of cell bioenergetics by constitutive InsP3 receptor Ca2+ transfer to mitochondria. Cell. , 142-142 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Funkcja mitochondri wszybko zu ycia tlenuszybko zakwaszenia zewn trzkom rkowegoanalizator Seahorse XF 96oddychanie podstawoweobr t ATPprzeciek protonowyrezerwowa zdolno oddechowatest stresu mitochondrialnego

Powiązane artykuły