Analityczny zestaw narzędzi do kompleksowej oceny biochemicznej, strukturalnej i transkrypcyjnej biofilmów jamy ustnej indukowanych przez paciorkowce z grupy mutans

Podsumowanie

Biofilmy tworzące się na powierzchniach zębów są wysoce złożone i narażone na stałe wrodzone oraz egzogenne wyzwania środowiskowe, które modulują ich architekturę, fizjologię oraz transkryptom. Opracowaliśmy zestaw narzędzi do badania składu, organizacji strukturalnej i ekspresji genów w biofilmach jamy ustnej, które można zaadaptować do innych obszarów badań nad biofilmami.

Streszczenie

Biofilmy są wysoce dynamicznymi, zorganizowanymi i ustrukturyzowanymi wspólnotami komórek mikrobów osadzonych w macierzy zewnątrzkomórkowej o zmiennej gęstości i składzie ^{1, 2}. Generalnie biofilmy powstają w wyniku początkowego przylegania mikroorganizmów do powierzchni, po czym następuje formowanie się skupisk komórek (lub mikrokolonii) oraz ich dalszy rozwój i stabilizacja w obrębie złożonej macierzy zewnątrzkomórkowej. Większość macierzy biofilmowych zawiera egzopolisacharydy (EPS), i biofilmy stomatologiczne nie są pod tym względem wyjątkiem; zwłaszcza te związane z próchnicą, która jest w większości indukowana przez paciorkowce mutans ³. EPS są syntetyzowane przez mikroorganizmy (S. mutans, kluczowy w tym procesie) za pomocą enzymów zewnątrzkomórkowych, takich jak glukozylotransferazy, wykorzystujące głównie sacharozę jako substrat ³.

Badania nad biofilmami tworzącymi się na powierzchniach zębów są szczególnie wymagające ze względu na ich stałą ekspozycję na czynniki środowiskowe związane ze złożonymi interakcjami między dietą, gospodarzem a mikroorganizmami występującymi w jamie ustnej. Lepsze zrozumienie dynamicznych zmian w organizacji strukturalnej i składzie macierzy, fizjologii oraz profilu transkryptomu/proteomu komórek biofilmu w odpowiedzi na te złożone interakcje pozwoliłoby na dalszy rozwój obecnej wiedzy o tym, w jaki sposób biofilmy jamy ustnej modulują patogenność. W związku z tym opracowaliśmy zestaw narzędzi analitycznych ułatwiających analizę biofilmu na poziomach strukturalnym, biochemicznym i molekularnym, łącząc powszechnie dostępne i nowe techniki z autorskim oprogramowaniem do analizy danych. Standardowe metody analityczne (testy kolorymetryczne, RT-qPCR i mikromacierze) oraz nowoczesne techniki fluorescencyjne (do jednoczesnego znakowania bakterii i EPS) zintegrowano ze specjalistycznym oprogramowaniem do analizy danych, aby sprostać złożonej naturze badań nad biofilmem jamy ustnej.

Zestaw narzędzi składa się z 4 odrębnych, ale powiązanych ze sobą etapów (Rysunek 1): 1) bioanalizy, 2) wprowadzania surowych danych, 3) przetwarzania danych oraz 4) analizy danych. Wykorzystaliśmy nasz model biofilmu in vitro oraz specyficzne warunki eksperymentalne, aby zademonstrować użyteczność i elastyczność zestawu narzędzi. Model biofilmu jest prosty, powtarzalny, a wiele powtórzeń pojedynczego eksperymentu można przeprowadzić jednocześnie ^{4, 5}. Ponadto umożliwia on ocenę czasową, włączenie różnych gatunków drobnoustrojów ⁵ oraz ocenę wpływu odmiennych warunków eksperymentalnych (np. terapii ⁶; porównania mutantów z nokautem z jednostką rodzicielską ⁵; dostępności węglowodanów ⁷). W niniejszej pracy opisujemy dwa specyficzne komponenty zestawu narzędzi, w tym (i) nowe oprogramowanie do eksploracji/organizacji danych z mikromacierzy (MDV) oraz analizy obrazowania fluorescencyjnego (DUOSTAT) oraz (ii) znakowanie EPS in situ. Przedstawiamy również przypadek eksperymentalny pokazujący, w jaki sposób zestaw narzędzi może wspomagać analizę biofilmów, organizację, integrację i interpretację danych.

Protokół

1. KROK 1 - BIOANALIZY

Metoda biofilmu wykorzystuje dyski z hydroksyapatytu (HA) jako substytutu zęba (Clarkson Chromatography Products, Inc., South Williamsport, PA, USA; powierzchnia = 2,7±0,2 cm²) pokryte śliną (naśladując obecność błony nabytej), umieszczone w pozycji pionowej ^{4, 5, 8}.

1. Analizy biochemiczne.
   1. Biofilmy są albo (i) homogenizowane poprzez sonikację ⁹, albo (ii) pozostawiane w formie nienaruszonej do analiz biochemicznych ⁸. Zawiesina z homogenizowanych biofilmów może być wykorzystana do oznaczenia biomasy (masa sucha), całkowitej zawartości białka, składników nieorganicznych oraz składu/zawartości polisacharydów zewnątrzkomórkowych i wewnątrzkomórkowych (szczegóły w Lemos et al., Protocols to Study the Physiology of Oral Biofilms ⁸). Nienaruszone biofilmy mogą być analizowane pod kątem odpowiedzi fizjologicznych z wykorzystaniem standardowych testów spadku pH w glikolizie, zabijania kwasem, przepuszczalności protonów oraz aktywności F-ATPase (szczegóły w Lemos et al., Protocols to Study the Physiology of Oral Biofilms ⁸).
2. Analizy transkryptomu.
   1. Standardowe protokoły mikromacierzy cDNA i RT-qPCR (np. http://pfgrc.jcvi.org/index.php/microarray/protocols.html) można stosować w połączeniu do określania odpowiedzi transkryptomu specyficznych patogenów (np. S. mutans) w biofilmach na różne wyzwania środowiskowe i terapeutyczne na różnych etapach rozwoju ^{6, 7, 10, 11}. W zestawie narzędzi uwzględniliśmy dwie metody kluczowe dla analizy transkryptomu biofilmów nazębnych: 1) jakość RNA (ze względu na heterogeniczną naturę populacji biofilmów i obecność macierzy EPS) oraz 2) eksplorację i interpretację danych (ze względu na duże zestawy danych generowane przez mikromacierze).
      • Izolacja RNA. Aby rozwiązać problem jakości RNA ekstrahowanego z biofilmów, stosujemy zoptymalizowany protokół opracowany specjalnie do izolacji i oczyszczania RNA z komórek bakteryjnych uwięzionych w macierzy bogatej w EPS ¹² (http://dx.doi.org/10.1016/j.ab.2007.03.021). Protokół ten zapewnia wskaźnik integralności RNA (RIN) wyższy niż 8,5, co jest uważane za optymalne dla analizy transkryptomu z wykorzystaniem zarówno RT-qPCR, jak i mikromacierzy (przykłady w ^{6, 11}).
3. Obrazowanie fluorescencyjne. Organizacja strukturalna biofilmów.
   1. Większość dostępnych w literaturze protokołów konfokalnego obrazowania fluorescencyjnego skupia się na znakowaniu drobnoustrojów. Analiza EPS jako głównego składnika biofilmu była w dużej mierze pomijana w badaniach biofilmów jamy ustnej z wykorzystaniem obrazowania fluorescencyjnego, z kilkoma wyjątkami ^{5, 13, 14}. Opracowaliśmy nową technikę znakowania oraz specjalistyczne oprogramowanie do powtarzalnej wizualizacji i kwantyfikacji jednocześnie EPS i komórek bakteryjnych w nienaruszonych biofilmach. Do rekonstrukcji 3D biofilmów używa się programu Amira 5 (Visage Imaging GmbH, Berlin, Niemcy), natomiast analizę ilościową przeprowadza się za pomocą COMSTAT (dostępny na stronie http://www.imageanalysis.dk) i DUOSTAT (http://www.imageanalysis.dk).
      1. Obrazowanie organizacji strukturalnej EPS-bakterii w biofilmach. Konjugat dekstranu znakowany Alexa Fluor 647 jest używany do wizualizacji macierzy EPS. Dekstran znakowany fluorescencyjnie służy jako starter dla strept kokowych glukozylotransferaz-Gtf (w szczególności GtfB i GtfC) i może być jednocześnie wbudowywany podczas syntezy macierzy egzopolisacharydowej w trakcie rozwoju biofilmu ¹¹.
         
         Znakowanie EPS:
         1. Pokryć krążki z hydroksyapatytu wysterylizowaną filtracyjnie śliną przez 1 h, zgodnie z protokołem „Biofilm Preparation” ⁸.
         2. Pipetować 2,8 mL pożywki hodowlanej do każdego dołka płytek 24-dołkowych i przenieść do ciemni.
         3. Dodać 1 μM konjugatu dekstranu z Alexa Fluor do pożywki hodowlanej, wymieszać barwnik z pożywką poprzez pipetowanie w górę i w dół (około 10 razy).
         4. Umyć krążki HA pokryte śliną (sHA) poprzez dwukrotne zanurzenie (po 1 h inkubacji) w sterylnym buforze AB i umieścić je w pożywce zawierającej konjugat dekstranu z Alexa Fluor.
         5. Przykryć płytkę folią aluminiową i inkubować w 37°C, 5% CO₂. Czas inkubacji zależy od projektu każdego eksperymentu. Dekstran znakowany fluorescencyjnie nie barwi komórek bakteryjnych w stężeniach stosowanych w tym teście ¹¹. W połączeniu można stosować inne techniki barwienia EPS, np. z użyciem Calcofluor ¹⁴.
      2. Znakowanie bakterii:
         1. Komponenty bakteryjne w biofilmach są znakowane pod koniec formowania biofilmu przy użyciu standardowego fluorescencyjnego barwnika kwasów nukleinowych (np. SYTO 9); do wykrywania jednego lub większej liczby gatunków bakteryjnych w biofilmach można oczywiście wykorzystać inne techniki fluorescencyjne (np. gatunkowo specyficzne przeciwciała znakowane fluorescencyjnie ¹⁵ lub komórki ekspresyjne gfp ¹⁶). Rycina 2 przedstawia jednoczesne znakowanie EPS (czerwony) i bakterii/mikrokolonii (zielony) na obrazie 3D 24-godzinnego biofilmu S. mutans utworzonego na powierzchni krążka sHA.
         2. Akwizycja obrazów: Każdy biofilm jest skanowany w 5 do 10 losowo wybranych pozycjach, a serie z są generowane poprzez sekcjonowanie optyczne w każdej z tych pozycji za pomocą konfokalnej mikroskopii laserowej zgodnie ze standardowymi protokołami. Używamy dwufotonowego mikroskopu Olympus FV 1000 (Olympus, Tokio, Japonia) wyposażonego w obiektywy imersyjne wodne x10 (Carl Zeiss; apertura numeryczna 0,45; odległość robocza 3-4 mm) lub x25 (Olympus LPlan N; NA 1,05; WD 2 mm). Długość fali wzbudzenia wynosi 810 nm, a filtr długości fali emisji dla SYTO 9 (bakterie) to filtr 495/540 OlyMPFC1, natomiast filtr dla Alexa Fluor 647 (EPS) to filtr HQ655/40M-2P. Zapisz i przechowuj surowe obrazy.

2. KROK 2 - WPROWADZENIE SUROWYCH DANYCH

Wprowadź surowe dane z testów biochemicznych i RT-qPCR bezpośrednio do pliku z surowymi danymi (plik RDF-MS Excel). W przypadku danych z mikromacierzy załaduj obrazy jednokanałowe zeskanowanych szkiełek do programu JCVI Spotfinder (http://pfgrc.jcvi.org/index.php/bioinformatics.html) lub podobnego oprogramowania. Utwórz siatkę plamek zgodnie ze specyfikacjami JCVI, a następnie dostosuj ją ręcznie tak, aby wszystkie plamki mieściły się w obrębie siatki. Zmierz wartości intensywności każdej plamki, zapisz je w plikach ".mev" i przechowuj w folderze "Raw Microarray data".

3. KROK 3 – PRZETWARZANIE DANYCH

Zorganizuj surowe dane (biochemiczne i RT-qPCR) w RDF do analizy statystycznej. Przenieś je do „Pliku z przetworzonymi danymi” (DPF – plik MS Excel). W przypadku analizy mikromacierzy i obrazowania fluorescencyjnego do przetwarzania danych wykorzystuje się specjalistyczne oprogramowanie (obecnie dostępne komercyjnie lub tworzone na zamówienie).

1. Dane z mikromacierzy:
   1. Przekaż surowe dane wygenerowane w kroku 2 (przechowywane w folderze „Raw Microarrays data”) do etapu normalizacji danych przy użyciu odpowiedniego oprogramowania. Znormalizuj dane za pomocą oprogramowania do analizy danych mikromacierzy MIDAS z JCVI (http://www.tm4.org/midas.html). Zastosuj regularyzację LOWESS i odchylenie standardowe z ustawieniami domyślnymi, a następnie przeprowadź analizę powtórzeń w obrębie tej samej płytki. Zapisz pliki zawierające znormalizowane dane. Na tym etapie (po przygotowaniu plików z surowymi i znormalizowanymi danymi) zdeponuj dane z mikromacierzy w publicznej bazie danych (np. bazie NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) pod adresem http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) i zapisz numer dostępu do późniejszego wykorzystania.
2. Dane z obrazowania fluorescencyjnego
   1. Kwantyfikacja struktury biofilmu.
      1. Dane ilościowe odpowiadające każdemu komponentowi strukturalnemu (EPS i bakterie) biofilmu są obliczane przez COMSTAT oraz nowo opracowany program DUOSTAT, które zostały napisane jako skrypty w MATLAB 5.1. Surowe obrazy fluorescencyjne są przesyłane do oprogramowania i analizowane w następujący sposób:
         • Użyj COMSTAT do obliczenia biomasy, grubości, rozkładu warstw i innych parametrów, które kwantyfikują i charakteryzują trójwymiarową strukturę biofilmów (patrz instrukcja na http://www.imageanalysis.dk).
         • Użyj DUOSTAT do obliczenia kolokalizacji dwóch komponentów biofilmu, takich jak EPS i bakterie (lub różnych gatunków drobnoustrojów i/lub komponentów zewnątrzkomórkowych):
           1. Ustaw ścieżkę dostępu do DUOSTAT w MATLAB 5.1 i otwórz foldery z obrazami zawierające zdjęcia obu komponentów biofilmu.
           2. Wybierz dwa kanały, które mają zostać skorelowane i przeanalizowane. Oba stosy obrazów muszą mieć identyczne rozmiary pikseli we wszystkich trzech wymiarach (x,y,z) oraz taką samą liczbę obrazów w każdym stosie.
           3. Ustaw progi dla każdego kanału zgodnie z instrukcją COMSTAT. Postępuj zgodnie z instrukcjami w interfejsie operacyjnym oprogramowania (patrz artykuł wideo; instrukcja DUOSTAT na http://www.imageanalysis.dk). Wprowadź uzyskane dane do DPF. Przykład przedstawiono na Rysunku 4.4.
      2. Trójwymiarowa rekonstrukcja biofilmów.
         1. Architektura trójwymiarowa biofilmów jest wizualizowana za pomocą programu Amira. Zaimportuj obrazy fluorescencyjne przechowywane w folderze „Raw Images Folder” do oprogramowania i użyj renderingu voltex oraz iso-surface, aby stworzyć trójwymiarowe rendery każdego z komponentów w biofilmach (patrz instrukcja Amira na http://www.amira.com/documentation/manuals-and-release-notes.html). Przykład przedstawiono na Rysunku 4.4.

4. KROK 4 - ANALIZA DANYCH

Dane ilościowe z analiz biochemicznych, RT-qPCR oraz COMSTAT-DUOSTAT w DPF są gotowe do analizy statystycznej. Po przeprowadzeniu analizy statystycznej można sporządzić wykresy i/lub tabele (patrz sekcja „Wyniki reprezentatywne”).

1. Organizacja danych z mikromacierzy przy użyciu oprogramowania Microarray Data Visualizer (MDV).

Ze względu na złożoność i generowanie dużych zbiorów danych podczas stosowania mikromacierzy oraz wielu warunków eksperymentalnych, zaprojektowaliśmy oprogramowanie do organizowania i wydobywania danych o nazwie Microarray Data Visualizer (MDV) ⁷ (dostępne pod adresem http://www.oralgen.lanl.gov/).

Po przeprowadzeniu analizy statystycznej przy użyciu programu BRB-ArrayTools (http://linus.nci.nih.gov/BRB-ArrayTools.html) z wartością graniczną P wynoszącą 0,001 dla predykcji klasy oraz dla porównania klas, wygenerowane dane można przekazać do MDV w następujący sposób:

1. Za pomocą programu Excel przekonwertuj dane BRB na pliki tekstowe z rozdzielaczem tabulatora obsługiwane przez MDV. Usuń wszystkie litery towarzyszące numerowi tagu locus genu; na przykład w przypadku SMU.1423c usuń literę „c”.
2. Otwórz program MDV. Przejdź do menu File i wybierz „Select Annotation Source”. Wybierz opcję „Flat File”. W wyświetlonym oknie dialogowym użyj przycisków Browse, aby wybrać pliki zawierające adnotacje dotyczące nazw genów, numerów Gene Ontology (GO), szlaków oraz danych klasyfikacji funkcjonalnej.
3. Przejdź do menu File i zaimportuj każdy z plików z punktu 1. Każdy z plików reprezentuje warunki eksperymentalne do analizy. Jeśli do analizy istnieje wiele warunków, na przykład dwie odrębne metody traktowania (treatment 1 i 2) oraz kontrola (vehicle), przejdź do punktu 4.
4. W takim przypadku możliwe porównania to: (A) treatment 1 względem kontroli (dla genów wykazujących różnicową ekspresję pod wpływem treatment 1); (B) treatment 2 względem kontroli; oraz (C) treatment 1 względem treatment 2. W zależności od przyjętej hipotezy badawczej można wybrać różne zestawy genów.
5. Wybierz tylko geny wykazujące różnicową ekspresję w porównaniu A (geny unikalnie zmienione tylko pod wpływem treatment 1). W tym celu użyj funkcji Subtract z menu Set Functions. Odejmij geny z porównania B od A i zapisz wynik. Następnie odejmij zestaw C od otrzymanych danych. Te same czynności można wykonać, aby uzyskać tylko geny w B (geny unikalnie zmienione tylko pod wpływem treatment 2).
6. Aby wybrać tylko geny wykryte zarówno w A, jak i w B, użyj funkcji Union z menu Set Functions, aby połączyć wyniki dla porównań A i B, a następnie zapisz wynik. Następnie odejmij zestaw C od otrzymanych danych.
7. Czynności te można zwizualizować za pomocą diagramu Venna dostępnego w programie MDV, który jest bardziej intuicyjny i ułatwia organizację danych w oparciu o hipotezę. Wynik danych z diagramu Venna zostanie wyświetlony na ekranie (zob. widok ekranu na Ryc. 3 oraz artykuł wideo).
   
8. Aby zapisać dane do plików tekstowych z rozdzielaczem tabulatora, przejdź do menu File i wybierz Export.
9. Wyeksportuj pliki tekstowe z rozdzielaczem tabulatora. Otwórz je za pomocą programu Excel i uporządkuj dane wyjściowe z MDV w tabelach i/lub przekonwertuj je na formę graficzną (zob. Ryc. 4.2, 4.3 oraz artykuł wideo).

5. REPREZENTATYWNE WYNIKI

W niniejszym materiale przedstawiamy przykład tego, jak zestaw narzędzi analitycznych integruje różne testy w badaniu biofilmu z wieloma zmiennymi i warunkami eksperymentalnymi.

Przypadek eksperymentalny:

Dynamika transkryptomu Streptococcus mutans w odpowiedzi na skrobię i sacharozę podczas rozwoju biofilmu ⁷.

Wstęp:

Interakcje skrobi i sacharozy zawartej w diecie z amylazą ślinową gospodarza oraz glukozylotransferazami paciorkowców mogą nasilać tworzenie i zjadliwość S. mutans w obrębie biofilmów poprzez zwiększenie syntezy egzopolisacharydów, metabolizmu cukrów i kwasotwórczości ¹¹. Ta złożona interakcja gospodarz-patogen-dieta może modulować powstawanie patogennych biofilmów związanych z próchnicą zębów. Przeprowadziliśmy kompleksową analizę biochemiczną i transkryptomiczną (w tym profilowanie całego genomu), aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób S. mutans reaguje na skrobię i sacharozę na różnych etapach rozwoju biofilmu w obecności amylazy ⁷.

Zestaw narzędzi analitycznych został wykorzystany w celu wsparcia integracji testów biochemicznych i molekularnych biofilmów utworzonych w różnych warunkach eksperymentalnych i punktach czasowych. Całkowite wyniki uzyskane przy użyciu zestawu narzędzi analitycznych przedstawiono sekwencyjnie na Rysunku 4 (4.1 do 4.4). Należy zauważyć, że głównym celem w tym przypadku jest zademonstrowanie użyteczności zestawu narzędzi, a nie interpretacja i dyskusja danych.

1. Połączenie testów biochemicznych i RT-qPCR w celu wyboru warunków eksperymentalnych do dalszej analizy mikromacierzy. Początkowo przetestowano 6 różnych stężeń sacharozy oraz 5 różnych kombinacji skrobi i sacharozy, aby wybrać optymalne stężenia węglowodanów dla rozwoju biofilmów S. mutans z wykorzystaniem naszego modelu in vitro. Możliwość jednoczesnego badania wyników z bioanaliz pomogła w wyborze trzech konkretnych stężeń (wyróżnionych na Ryc. 4.1) w oparciu o (zwiększoną) ilość nierozpuszczalnych egzopolisacharydów oraz (zwiększoną) ekspresję genu gtfB (odpowiedzialnego za syntezę nierozpuszczalnego glukanu) w biofilmach.
2. Analiza mikromacierzy. Wybrane (trzy) stężenia węglowodanów dietetycznych wykorzystano do tworzenia biofilmów, które usuwano w określonych punktach czasowych odzwierciedlających różne etapy procesu rozwoju biofilmów. Biofilmy (podzielone na 3 grupy eksperymentalne i 4 punkty czasowe) poddano analizie transkryptomu, łącząc profilowanie całego genomu (mikromacierze cDNA) z narzędziami BRB-Array Tools i MDV.
   
   RNA wyekstrahowano i oczyszczono zgodnie z protokołem specyficznym dla biofilmów ¹², a następnie poddano analizie mikromacierzy w ramach 4-etapowego procesu Analytical Tool-Box. Ryc. 4.2 ilustruje, jak MDV pomogło w wyborze genów zainteresowania zgodnie z naszą hipotezą roboczą, według której kombinacja sacharozy i skrobi wywołuje specyficzną odpowiedź transkrypcyjną związaną ze zwiększoną wirulencją (potencjałem kariogennym) S. mutans w obrębie biofilmów. Surowe dane wygenerowane przez BRB-ArrayTools (Ryc. 4.2a) zostały przetworzone przez MDV przy użyciu diagramu Venna (Ryc. 4.2b). W niniejszym badaniu grupą genów powiązanych z naszą hipotezą są te, które wykazują różnicową ekspresję w porównaniu A (0,5% sacharozy + 1% skrobi vs 1% sacharozy) i B (0,5% sacharozy + 1% skrobi vs 0,5% sacharozy), ale nie w porównaniu C (0,5% sacharozy vs 1% sacharozy) (Ryc. 4.2a i 4.2b). Jak pokazano na Ryc. 4.2c, MDV znacznie zredukowało całkowitą liczbę genów do analizy, a jednocześnie odfiltrowało geny niewiązane bezpośrednio z wpływem kombinacji sacharozy i skrobi. Wyniki z MDV przekształcono również w prezentację graficzną pokazującą dane uporządkowane według klasy funkcjonalnej każdego z genów różnicowo eksponowanych (podwyższonych i obniżonych) w biofilmach na skrobi i sacharozie (vs biofilmy hodowane na sacharozie) w każdym z 4 punktów czasowych (Ryc. 4.3). Oprogramowanie MDV jest przyjazne dla użytkownika i ułatwiło wydobycie oraz organizację dużych i złożonych zestawów danych z naszych eksperymentów z mikromacierzami.
3. Obrazowanie biofilmów. Równocześnie przeanalizowano organizację strukturalną biofilmów za pomocą zestawu COMSTAT-DUOSTAT-Amira zawartego w tool-boxie (przykład rekonstrukcji 3D i analizy ilościowej biofilmu hodowanego na skrobi i sacharozie znajduje się na Ryc. 4.4; patrz również artykuł wideo). Morfologię, rozkład i powiązania strukturalne EPS oraz mikrokolonii można zwizualizować za pomocą renderowania powierzchni 3D w programie Amira. Można generować powiększenia wybranych obszarów, co ilustruje specyficzne relacje strukturalne bakterie-EPS w mikroskali (Ryc. 4.4). Ponadto ten sam zestaw obrazów konfokalnych może być przetwarzany przez COMSTAT-DUOSTAT w celu jednoczesnego pomiaru biomasy/mikrokolonii, rozkładu przestrzennego oraz kolokalizacji komórek bakteryjnych i EPS. Na przykład pionowy rozkład EPS i bakterii od powierzchni dysku do fazy ciekłej obliczono dla każdego przekroju optycznego trójwymiarowych konfokalnych obrazów biofilmu za pomocą COMSTAT-DUOSTAT (wykres na Ryc. 4.4.; patrz artykuł wideo). Dane wykazują wyższe proporcje EPS (czerwona linia) niż bakterii (zielona linia) w całej głębokości biofilmów. Ponadto większość komórek bakteryjnych jest powiązana z EPS (niebieska linia), szczególnie w środkowych i zewnętrznych warstwach biofilmu. Obserwacja ta wskazuje, że biofilmy hodowane na skrobi i sacharozie są szczególnie bogate w egzopolimery, które oplatają (znajdują się w bliskim kontakcie z) większość komórek bakteryjnych; taka organizacja strukturalna zwiększa stabilność i spójność biofilmów ¹³. Trójwymiarowe renderowania i pomiary ilościowe obrazów konfokalnych dostarczają dodatkowych informacji o strukturze biofilmu, które uzupełniają dane biochemiczne i dotyczące ekspresji genów (zwiększona synteza nierozpuszczalnego glukanu typu GtfB przez S. mutans w biofilmach hodowanych na skrobi i sacharozie) (dodatkowe przykłady w ^{5, 6, 11, 13}).
   
   Analytical Tool-Box pomógł nam w pozyskaniu, organizacji i integracji danych z różnych bioanaliz, co zapewniło kompleksową analizę tego, jak S. mutans może reagować na złożone zmiany środowiskowe będące wynikiem interakcji dieta-gospodarz w jamie ustnej (szczegóły w Klein et al., 2009 ¹¹; Klein et al., 2010 ⁷).

Rycina 1. Schemat blokowy zestawu narzędzi analitycznych do analizy biofilmu.

Rysunek 2. Konfokalne obrazowanie fluorescencyjne EPS i bakterii w biofilmach. Jednoczesna wizualizacja EPS (czerwony) oraz bakterii/mikrokolonii (zielony) w trójwymiarowym renderingu biofilmu Streptococcus mutans utworzonego na powierzchni dysku sHA.

Rysunek 3. Przeszukiwanie i organizacja danych z mikromacierzy przy użyciu oprogramowania Microarray Data Visualizer (MDV). Wykorzystanie funkcji diagramu Venna do wyboru genów budzących zainteresowanie, a następnie dodanie nazw genów oraz adnotacji klas funkcjonalnych.

Rysunek 4.1. Ocena tworzenia biofilmu przez S. mutans z wykorzystaniem analiz biochemicznych (A) oraz RT-qPCR (B). Dane dotyczące INS (nierozpuszczalnych egzopolisacharydów) dobrze korelują z wzorcem ekspresji gtfB oraz z biomasą biofilmu. Sacharoza w stężeniu 1% była stężeniem zapewniającym maksymalne tworzenie INS, ekspresję gtfB oraz akumulację biofilmu na powierzchni sHA, podczas gdy 0,5% sacharozy było minimalnym stężeniem wymaganym do optymalnego rozwoju biofilmu w naszym modelu in vitro. Komórki S. mutans hodowane w obecności 0,5% sacharozy + 1% skrobi wykazały najwyższą biomasę i zawierały więcej INS niż inne biofilmy, co korelowało ze zwiększoną ekspresją gtfB (B2). Te stężenia węglowodanów wybrano do dalszej analizy transkryptomu.

Rycina 4.2. Analiza danych z mikromacierzy z wykorzystaniem narzędzi BRB-Array Tools w połączeniu z oprogramowaniem MDV. a) Przedstawienie liczby genów zidentyfikowanych jako różnicowo wyrażone w każdym porównaniu (A, B lub C) i punkcie czasowym ocenianym za pomocą BRB-Array Tools. b) Program Microarray Data Visualizer (MDV) z wykorzystaniem diagramu Venna do wyboru interesujących genów. c) Geny wybrane na podstawie analizy MDV.

Rysunek 4.3. S. mutans geny różnicowo wyrażane w biofilmach skrobia+sukroza (w porównaniu do biofilmów sukrozowych) w różnych punktach czasowych, uporządkowane według klasy funkcjonalnej. Adnotacje genów oparto na informacjach dostarczonych przez Los Alamos National Laboratory (www.oralgen.lanl.gov) lub na literaturze opublikowanej dostępnej w tej samej witrynie internetowej.

Rycina 4.4. Renderowanie trójwymiarowe i analiza COMSTAT-DUOSTAT biofilmu na skrobi i sacharozie.

Dyskusja

W niniejszej prezentacji zademonstrowaliśmy dwa krytyczne komponenty zestawu narzędzi analitycznych (obrazowanie EPS/bakterii oraz wydobywanie/przetwarzanie danych z mikromacierzy), a także wszechstronność i użyteczność różnych analiz zintegrowanych w systemie. Wyraźnie widać, że zestaw ten ułatwił kompleksową (porównawczą) i jednoczesną analizę różnych aspektów biochemii, architektury oraz ekspresji genów biofilmów w odpowiedzi na różne warunki eksperymentalne z wykorzystaniem modelu in vitro.⁷ Biorą...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Syto 9	Invitrogen	S34854
Syto 60	Invitrogen	S11342
Dekstran sprzężony z alexa 647	Invitrogen	D22914
Dwufotonowy skaningowy mikroskop laserowy Olympus FV1000	Olympus Corporation