Zestaw narzędzi analitycznych do kompleksowej oceny biochemicznej, strukturalnej i transkryptomu biofilmów jamy ustnej, w których pośredniczą paciorkowce Mutans

Podsumowanie

Biofilmy powstające na powierzchni zębów są bardzo złożone i narażone na ciągłe wrodzone i egzogenne wyzwania środowiskowe, które modulują ich architekturę, fizjologię i transkryptom. Opracowaliśmy zestaw narzędzi do badania składu, organizacji strukturalnej i ekspresji genów biofilmów jamy ustnej, które można dostosować do innych obszarów badań nad biofilmem.

Streszczenie

Biofilmy to wysoce dynamiczne, zorganizowane i ustrukturyzowane społeczności komórek mikrobiologicznych uwikłanych w zewnątrzkomórkową matrycę o zmiennej gęstości i składzie ^{1, 2}. Ogólnie rzecz biorąc, biofilmy rozwijają się w wyniku początkowego przyczepienia drobnoustrojów na powierzchni, po którym następuje tworzenie klastrów komórkowych (lub mikrokolonii) oraz dalszy rozwój i stabilizacja mikrokolonii, które zachodzą w złożonej macierzy zewnątrzkomórkowej. Większość matryc biofilmu zawiera egzopolisacharydy (EPS), a biofilmy dentystyczne nie są wyjątkiem; Zwłaszcza te związane z chorobą próchnicową, w której najczęściej pośredniczą paciorkowce Mutans ³. EPS są syntetyzowane przez mikroorganizmy (S. mutans, kluczowy współtwórca) za pomocą enzymów zewnątrzkomórkowych, takich jak glukozylotransferazy, wykorzystujących sacharozę głównie jako substrat ³.

Badania nad biofilmami powstającymi na powierzchni zębów są szczególnie trudne ze względu na ich ciągłe narażenie na wyzwania środowiskowe związane ze złożonymi interakcjami dieta-gospodarz-mikroorganizmy zachodzące w jamie ustnej. Lepsze zrozumienie dynamicznych zmian w organizacji strukturalnej i składzie macierzy, fizjologii i profilu transkryptomu/proteomu komórek biofilmu w odpowiedzi na te złożone interakcje przyczyniłoby się do dalszego pogłębienia obecnej wiedzy na temat tego, w jaki sposób biofilmy jamy ustnej modulują patogenność. W związku z tym opracowaliśmy zestaw narzędzi analitycznych, aby ułatwić analizę biofilmu na poziomie strukturalnym, biochemicznym i molekularnym, łącząc powszechnie dostępne i nowatorskie techniki z niestandardowym oprogramowaniem do analizy danych. Standardowe techniki analityczne (testy kolorymetryczne, RT-qPCR i mikromacierze) oraz nowatorskie techniki fluorescencji (do jednoczesnego znakowania bakterii i EPS) zostały zintegrowane ze specjalnym oprogramowaniem do analizy danych, aby zająć się złożonym charakterem badań nad biofilmem w jamie ustnej.

Skrzynka z narzędziami składa się z 4 odrębnych, ale połączonych ze sobą kroków (Rysunek 1): 1) Testy biologiczne, 2) wprowadzanie danych surowych, 3) przetwarzanie danych i 4) analiza danych. Wykorzystaliśmy nasz model biofilmu in vitro i specyficzne warunki eksperymentalne, aby zademonstrować przydatność i elastyczność zestawu narzędzi. Model biofilmu jest prosty, powtarzalny i można jednocześnie wykonać wiele powtórzeń jednego eksperymentu ^{4, 5}. Ponadto umożliwia ocenę czasową, włączenie ^{różnych gatunków} drobnoustrojów5 oraz ocenę skutków odrębnych warunków eksperymentalnych (np. leczenie ⁶; porównanie mutantów nokautujących ze szczepem rodzicielskim ⁵; dostępność węglowodanów ⁷). W tym miejscu opisujemy dwa konkretne elementy zestawu narzędzi, w tym (i) nowe oprogramowanie do eksploracji/organizacji danych mikromacierzy (MDV) i analizy obrazowania fluorescencyjnego (DUOSTAT) oraz (ii) znakowanie EPS in situ. Przedstawiamy również eksperymentalny przypadek pokazujący, w jaki sposób zestaw narzędzi może pomóc w analizie, organizacji, integracji i interpretacji danych biofilmowych.

Protokół

1. KROK 1 - TESTY BIOLOGICZNE

Metoda biofilmu wykorzystuje krążki hydroksyapatytu (HA) jako substytut zęba (Clarkson Chromatography Products, Inc., South Williamsport, PA, USA; powierzchnia = 2,7±0,2 cm²) pokryte śliną (naśladującą obecność nabytej błonki), umieszczone w pozycji pionowej ^{4, 5, 8}.

1. Testy biochemiczne.
   1. Biofilmy są albo (i) homogenizowane przez sonikację9, albo (ii) utrzymywane w stanie nienaruszonym do testów biochemicznych ⁸. Homogenizowana zawiesina biofilmów może być stosowana do oznaczania składu/zawartości biomasy (suchej masy), białka całkowitego, nieorganicznego oraz zewnątrzkomórkowego i wewnątrzkomórkowego i wewnątrzkomórkowego polisacharydu (patrz szczegóły w Lemos i wsp., Protokoły badania fizjologii biofilmów jamy ustnej ⁸). Nienaruszone biofilmy mogą być analizowane pod kątem ich reakcji fizjologicznych przy użyciu standardowych testów glikolitycznego spadku pH, zabijania kwasów, przepuszczalności protonów i aktywności F-ATPazy (patrz szczegóły w Lemos i wsp., Protokoły badania fizjologii biofilmów jamy ustnej ⁸).
2. Analizy transkryptomowe.
   1. Standardowe protokoły mikromacierzy cDNA i RT-qPCR (np. http://pfgrc.jcvi.org/index.php/microarray/protocols.html) mogą być stosowane w połączeniu do określania odpowiedzi transkryptomu określonych patogenów (np. S. mutans) w biofilmach na różne wyzwania środowiskowe i terapeutyczne na różnych etapach rozwoju ^{6, 7, 10, 11}. W zestawie narzędzi uwzględniliśmy dwie metody, które mają kluczowe znaczenie dla analizy transkryptomu biofilmów dentystycznych: 1) jakość RNA (ze względu na niejednorodny charakter populacji biofilmu i obecność matrycy EPS) oraz 2) eksplorację i interpretację danych (ze względu na duży zestaw danych generowanych przez mikromacierz).
      • Izolacja RNA. Aby rozwiązać problem jakości RNA ekstrahowanego z biofilmów, stosujemy zoptymalizowany protokół opracowany specjalnie do izolacji i oczyszczania RNA z komórek bakteryjnych uwikłanych w matrycę ¹² (http://dx.doi.org/10.1016/j.ab.2007.03.021) bogatą w EPS. Protokół ten zapewnia liczbę integralności RNA (RIN) wyższą niż 8,5, która jest uważana za optymalną do analizy transkryptomu przy użyciu zarówno RT-qPCR, jak i mikromacierzy (przykłady patrz ^{6, 11}).
3. Obrazowanie fluorescencyjne. Strukturalna organizacja biofilmów.
   1. Większość dostępnych w literaturze protokołów obrazowania fluorescencji konfokalnej koncentruje się na znakowaniu mikrobiologicznym. Analiza EPS jako głównego składnika biofilmu została w dużej mierze zaniedbana w badaniach biofilmu jamy ustnej obejmujących obrazowanie fluorescencyjne, z nielicznymi wyjątkami ^{5, 13, 14}. Opracowaliśmy nowatorską technikę etykietowania i specjalne oprogramowanie do powtarzalnej wizualizacji i kwantyfikacji EPS i komórek bakteryjnych jednocześnie w nienaruszonych biofilmach. Amira 5 (Visage Imaging GmbH, Berlin, Niemcy) służy do rekonstrukcji 3D biofilmów, natomiast COMSTAT (dostępny pod numerem http://www.imageanalysis.dk) i DUOSTAT (http://www.imageanalysis.dk) zapewniają analizę ilościową.
      1. Obrazowanie organizacji strukturalnej bakterii EPS w biofilmach. Koniugat dekstranu znakowany Alexa Fluor 647 służy do wizualizacji matrycy EPS. Znakowany fluorescencyjnie dekstran służy jako starter dla paciorkowcowych glukozylotransferaz-Gtf (szczególnie GtfB i GtfC) i może być jednocześnie włączony podczas syntezy matrycy egzopolisacharydowej w trakcie rozwoju biofilmu ¹¹,
         
         Oznakowanie EPS:
         1. Krążki hydroksyapatytu należy pokryć śliną sterylizowaną przez filtr przez 1 godzinę, postępując zgodnie z protokołem "Przygotowanie biofilmu" ⁸.
         2. Odpipetować pipetą 2,8 ml pożywki hodowlanej do każdej studzienki z 24 dołkami i przenieść do ciemnego pomieszczenia.
         3. Dodać 1 μM sprzężonego z dekstranem Alexa Fluor do pożywki hodowlanej, wymieszać barwnik z pożywką hodowlaną, pipetując w górę iw dół (około 10 razy).
         4. Dwukrotnie przemyć krążki HA (sHA) pokryte śliną (po 1 godzinie inkubacji) w sterylnym buforze AB i umieścić je w pożywce zawierającej dekstran sprzężony z Alexa Fluor.
         5. Przykryj płytkę folią aluminiową i inkubuj w temperaturze 37°C, 5% CO₂ . Czas trwania inkubacji zależy od każdego projektu doświadczalnego. Znakowany fluorescencyjnie dekstran nie barwi komórek bakteryjnych w stężeniach stosowanych w tym teście ¹¹. Inne techniki barwienia EPS, takie jak Calcofluor ¹⁴, mogą być stosowane w połączeniu.
      2. Etykietowanie bakterii:
         1. Składniki bakteryjne w biofilmach są znakowane na końcu tworzenia biofilmu za pomocą standardowego barwienia fluorescencyjnym kwasem nukleinowym (np. SYTO 9); inne techniki fluorescencji (np. specyficzne dla gatunku przeciwciała znakowane fluorescencyjnie ¹⁵ lub komórki wykazujące ekspresję gfp ¹⁶) mogą być oczywiście stosowane do wykrywania jednego lub więcej gatunków bakterii w biofilmach. Rysunek 2 przedstawia jednoczesne znakowanie EPS (kolor czerwony) i bakterii/mikrokolonii (kolor zielony) na obrazie 3D biofilmu S. mutans sprzed 24 godzin utworzonego na powierzchni dysku sHA.
         2. Akwizycja obrazów: Każdy biofilm jest skanowany w 5 do 10 losowo wybranych pozycjach, a serie z są generowane przez sekcję optyczną w każdej z tych pozycji za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej przy użyciu standardowych protokołów. Korzystamy z mikroskopu dwufotonowego Olympus FV 1000 (Olympus, Tokio, Japonia) wyposażonego w x10 (Carl Zeiss; apertura numeryczna 0,45; odległość robocza 3-4 mm) lub x25 (Olympus LPlan N; NA 1.05; WD 2 mm) obiektywy do zanurzenia w wodzie. Długość fali wzbudzenia wynosi 810 nm, a filtr długości fali emisji dla SYTO 9 (bakterie) to filtr 495/540 OlyMPFC1, natomiast filtr dla Alexa Fluor 647 (EPS) to filtr HQ655/40M-2P. Zapisuj i przechowuj obrazy RAW.

2. KROK 2 - WPROWADZANIE SUROWYCH DANYCH

Wprowadź surowe dane z testów biochemicznych i RT-qPCR bezpośrednio do pliku z surowymi danymi (plik Excel RDF-MS). W przypadku danych z mikromacierzy załaduj jednokanałowe obrazy zeskanowanych slajdów do JCVI Spotfinder (http://pfgrc.jcvi.org/index.php/bioinformatics.html) lub podobnego oprogramowania. Utwórz siatkę punktową zgodnie ze specyfikacją JCVI, a następnie ręcznie dostosuj, aby dopasować wszystkie miejsca w siatce. Zmierz wartości intensywności każdego miejsca i zapisz je w plikach ".mev" i zapisz w "Raw Microarray data".

3. KROK 3 - PRZETWARZANIE DANYCH

Uporządkuj surowe dane (biochemiczne i RT-qPCR) w RDF do analizy statystycznej. Przenieś je do "Pliku Przetworzonych Danych" (DPF - plik MS Excel). Do analizy mikromacierzy i obrazowania fluorescencyjnego do przetwarzania danych wykorzystywane jest specjalne oprogramowanie (obecnie dostępne i wykonane na zamówienie).

1. Dane z mikromacierzy:
   1. Prześlij nieprzetworzone dane wygenerowane w kroku 2 (przechowywane w "Nieprzetworzonych danych mikrotablic") do etapu normalizacji danych przy użyciu specjalnego oprogramowania. Normalizuj dane za pomocą oprogramowania do analizy danych z mikromacierzy JCVI MIDAS (http://www.tm4.org/midas.html). Użyj LOWESS i regularyzacji odchylenia standardowego z ustawieniami domyślnymi, a następnie analizy replikacji na slajdzie. Przechowuj pliki zawierające znormalizowane dane. Na tym etapie (gotowe pliki z danymi surowymi i znormalizowane pliki danych) należy zdeponować dane mikromacierzy w publicznie dostępnej bazie danych (np. bazie danych NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) pod adresem http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) i zapisać numer dostępu do wykorzystania w przyszłości.
2. Dane obrazowania fluorescencyjnego
   1. Kwantyfikacja struktury biofilmu.
      1. Dane ilościowe odpowiadające każdemu składnikowi strukturalnemu (EPS i bakterie) biofilmów są obliczane przez COMSTAT i nowo opracowany DUOSTAT, które zostały zapisane jako skrypt w MATLAB 5.1. Surowe obrazy fluorescencyjne są przesyłane do oprogramowania i analizowane w następujący sposób:
         • Użyj COMSTAT do obliczenia biomasy, grubości, rozkładu warstw i innych parametrów, które określają ilościowo i charakteryzują trójwymiarową strukturę biofilmów (patrz instrukcja na http://www.imageanalysis.dk).
         • Za pomocą DUOSTAT można obliczyć kolokalizację dwóch składników biofilmu, takich jak EPS i bakterie (lub różne gatunki drobnoustrojów i/lub składniki zewnątrzkomórkowe):
           1. Skonfiguruj ścieżkę DUOSTAT w MATLAB 5.1 i otwórz foldery obrazów, które zawierają obrazy dwóch składników biofilmu.
           2. Wybierz dwa kanały, które będą korelowane i analizowane. Dwa stosy obrazów muszą mieć identyczne rozmiary pikseli we wszystkich trzech wymiarach (x, y, z) i taką samą liczbę obrazów w każdym stosie.
           3. Ustaw progi dla każdego kanału zgodnie z instrukcją COMSTAT. Postępuj zgodnie z instrukcjami w interfejsie obsługi oprogramowania (patrz artykuł wideo; Instrukcja obsługi DUOSTAT na http://www.imageanalysis.dk). Wprowadź uzyskane dane do filtra DPF. Zobacz przykład na rysunku 4.4.
      2. Trójwymiarowa rekonstrukcja biofilmów.
         1. Trójwymiarowa architektura biofilmów jest wizualizowana za pomocą Amiry. Zaimportuj obrazy fluorescencyjne przechowywane w "Folderze Obrazów Raw" do oprogramowania i użyj renderingu voltex i iso-surface, aby stworzyć renderingi 3D każdego ze składników biofilmów (patrz instrukcja Amira na http://www.amira.com/documentation/manuals-and-release-notes.html). Zobacz przykład na rysunku 4.4.

4. KROK 4 - ANALIZA DANYCH

Dane ilościowe z testów biochemicznych, RT-qPCR i COMSTAT-DUOSTAT w DPF są gotowe do analizy statystycznej. Po przeprowadzeniu analizy statystycznej można skonstruować wykresy i/lub tabele (patrz sekcja "Reprezentatywne wyniki").

1. Organizacja danych mikromacierzy za pomocą oprogramowania Microarray Data Visualizer (MDV).

Ze względu na złożoność i generowanie dużych zbiorów danych przy użyciu mikrotablic i wielu warunków eksperymentalnych, zaprojektowaliśmy oprogramowanie do eksploracji i organizacji danych o nazwie Microarray Data Visualizer (MDV) ⁷ (dostępne w http://www.oralgen.lanl.gov/).

Po przeprowadzeniu analizy statystycznej za pomocą BRB-ArrayTools (http://linus.nci.nih.gov/BRB-ArrayTools.html) z wartością odcięcia P wynoszącą 0,001 dla przewidywania klas i do porównania klas, wygenerowane dane mogą zostać przesłane do MDV, jak następuje:

1. Korzystając z programu Excel, przekonwertuj dane BRB na pliki tekstowe rozdzielane tabulatorami MDV. Usuń wszystkie litery, które są dostarczane z numerem znacznika Gene Locus; na przykład: SMU.1423c, skreślić literę "c".
2. Otwórz MDV. Przejdź do Plik i wybierz "Wybierz źródło adnotacji". Wybierz "Plik płaski". Po wyświetleniu okna dialogowego użyj przycisków Przeglądaj, aby wybrać pliki, które zawierają adnotację dotyczącą nazwy genu, numeru ontologii genu (GO), ścieżki i danych klasyfikacji funkcjonalnej.
3. Przejdź do Plik i zaimportuj każdy z plików z elementu 1. Każdy z plików reprezentuje warunki eksperymentalne do analizy. Jeżeli istnieje wiele warunków do analizy, na przykład dwa odrębne zabiegi (traktowanie 1 i 2) i kontrola (nośnik), należy przejść do pozycji 4.
4. W tym przypadku możliwe porównania są następujące: (A) leczenie 1 vs. kontrola (dla genów o zróżnicowanej ekspresji w wyniku leczenia 1); (B) leczenie 2 a kontrola; oraz (C) leczenie 1 vs. leczenie 2. W zależności od hipotezy roboczej można wybrać różne zestawy genów.
5. Wybrać tylko geny o zróżnicowanej ekspresji w porównaniu A (unikalne geny, na które wpływa tylko leczenie 1). W takim przypadku należy użyć funkcji Odejmowanie z menu Ustaw funkcje. Odejmij geny z porównania B od A i zapisz wynik. Następnie odejmij C od danych wynikowych. Te same działania można wykonać, aby uzyskać tylko geny w B (unikalne geny, na które wpływa tylko leczenie 2).
6. Aby wybrać tylko te geny, które wykryto zarówno w A, jak i B, użyj funkcji Suma z menu Ustaw funkcje, aby połączyć wynik dla porównań A i B, a następnie zapisać wynik. Następnie odejmij C od danych wynikowych.
7. Działania te można wizualizować za pomocą diagramu Venna, opisanego w MDV, który jest bardziej intuicyjny i ułatwia organizację danych opartą na hipotezach. Dane wyjściowe diagramu Venna zostaną wyświetlone na ekranie (patrz widok ekranu na rysunku 3 i artykuł wideo).
   
8. Aby zapisać dane w plikach tekstowych rozdzielanych tabulatorami, przejdź do pozycji Plik i wybierz pozycję Eksportuj.
9. Eksportuj pliki tekstowe rozdzielane tabulatorami. Otwórz je za pomocą programu Excel i uporządkuj dane wyjściowe z MDV w tabelach i/lub ukryte na wyświetlaczu graficznym (patrz rysunki 4.2, 4.3 i artykuł wideo).

5. REPREZENTATYWNE WYNIKI

Tutaj podajemy przykład, jak zestaw narzędzi analitycznych integruje różne testy badania biofilmu z wieloma zmiennymi i warunkami eksperymentalnymi.

Przypadek eksperymentalny:

Dynamika transkryptomu Streptococcus mutans w odpowiedzi na skrobię i sacharozę podczas rozwoju biofilmu ⁷.

Tło:

Interakcje skrobi i sacharozy w diecie z amylazą ślinową gospodarza i paciorkowcami glukozylotransferazy mogą zwiększyć tworzenie i zjadliwość S. mutans w biofilmach poprzez zwiększenie syntezy egzopolisacharydów, metabolizmu cukrów i kwasogeniczności ¹¹. Ta złożona interakcja gospodarz-patogen-dieta może modulować tworzenie patogennych biofilmów związanych z chorobą próchnicy. Przeprowadziliśmy kompleksową analizę biochemiczną i transkryptomiczną (w tym profilowanie całego genomu), aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób S. mutans reaguje na skrobię i sacharozę na różnych etapach rozwoju biofilmu w obecności amylazy ⁷.

Zestaw narzędzi analitycznych został użyty, aby pomóc nam w integracji testów biochemicznych i molekularnych biofilmów powstałych w różnych warunkach eksperymentalnych i punktach czasowych. Na rysunku 4 (4.1–4.4) przedstawiono sekwencyjnie ogólne dane wyjściowe za pomocą zestawu narzędzi analitycznych. Warto zauważyć, że główny nacisk kładziony jest tutaj na pokazanie użyteczności zestawu narzędzi, a nie na interpretację danych i dyskusję.

1. Połączenie testów biochemicznych i RT-qPCR w celu wyboru warunków eksperymentalnych do dalszej analizy mikromacierzy. Początkowo przetestowaliśmy 6 różnych kombinacji sacharozy i 5 różnych kombinacji skrobi i sacharozy, aby wybrać optymalne stężenia węglowodanów do rozwoju biofilmu przez S. mutans przy użyciu naszego modelu in vitro. Możliwość jednoczesnego badania danych wyjściowych z testów biologicznych pomogła nam w wyborze trzech konkretnych stężeń (zaznaczonych na rysunku 4.1) w oparciu o (podwyższoną) ilość nierozpuszczalnych egzopolisacharydów i (zwiększoną) ekspresję gtfB (odpowiedzialnego za syntezę nierozpuszczalnego glukanu) w biofilmach.
2. Analiza mikromacierzy. Wybrane (trzy) stężenia węglowodanów w diecie wykorzystano do wytworzenia biofilmów, które zostały usunięte w określonych punktach czasowych odzwierciedlających różne etapy procesu rozwoju biofilmu. Biofilmy (podzielone na 3 grupy eksperymentalne i 4 punkty czasowe) poddano analizie transkryptomu poprzez połączenie profilowania całego genomu (mikromacierzy cDNA) za pomocą narzędzi BRB-Array Tools i MDV.
   
   RNA wyekstrahowano i oczyszczono przy użyciu protokołu specyficznego dla biofilmu ¹², a następnie poddano analizie mikromacierzy w 4-etapowym procesie Analytical Tool-Box. Rycina 4.2 ilustruje, w jaki sposób MDV pomógł w wyborze genów będących przedmiotem zainteresowania zgodnie z naszą roboczą hipotezą, że połączenie sacharozy i skrobi wyzwala specyficzną odpowiedź transkrypcyjną związaną ze zwiększoną zjadliwością (potencjałem próchnicotwórczym) S. mutans w biofilmach. Surowe dane wygenerowane przez BRB-ArrayTools (rysunek 4.2a) zostały przetworzone przez MDV przy użyciu diagramu Venna (rysunek 4.2b). W tym badaniu grupą genów związanych z naszą hipotezą są geny wyrażone różnicowo w porównaniu A (0,5% sacharozy + 1% skrobi vs. 1% sacharozy) i B (0,5% sacharozy + 1% skrobi vs. 0,5% sacharozy), ale nie geny w porównaniu C (0,5% sacharozy vs. 1% sacharozy) (ryc. 4.2a i 4.2b). Jak pokazano na rysunku 4.2c, MDV znacznie zmniejszył całkowitą liczbę genów do analizy i jednocześnie odfiltrował geny niebezpośrednio związane z wpływem sacharozy i skrobi w połączeniu. Dane wyjściowe MDV zostały również przekształcone w wyświetlacz graficzny przedstawiający dane uporządkowane według klasy funkcjonalnej każdego z genów o zróżnicowanej ekspresji (regulowanej w górę i w dół) w biofilmach skrobia + sacharoza (w porównaniu z biofilmami uprawianymi sacharozą) w każdym z 4 punktów czasowych (Figura 4.3). Oprogramowanie MDV jest przyjazne dla użytkownika i ułatwiło wydobycie/organizację dużych i złożonych zestawów danych z naszych eksperymentów z mikromacierzami.
3. Obrazowanie biofilmu. Równocześnie analizowano organizację strukturalną biofilmów przy użyciu COMSTAT-DUOSTAT-Amira dołączonego do zestawu narzędzi (patrz przykład rekonstrukcji 3D i analizy ilościowej biofilmu wyhodowanego skrobia + sacharoza na rysunku 4.4; zobacz również artykuł wideo). Morfologię, rozmieszczenie i relacje strukturalne EPS i mikrokolonii można zobrazować za pomocą renderowania powierzchni 3D przez Amirę. Można generować zbliżenia na wybrany obszar, które ilustrują specyficzne zależności strukturalne bakteria-styropian w mikroskali (rysunek 4.4). Co więcej, ten sam zestaw obrazów konfokalnych może być przetwarzany przez COMSTAT-DUOSTAT do jednoczesnych pomiarów biomasy/mikrokolonii, rozmieszczenia przestrzennego i kolokalizacji komórek bakteryjnych i EPS. Na przykład, pionowy rozkład EPS i bakterii od powierzchni dysku do fazy płynnej obliczono na podstawie każdego przekroju optycznego trójwymiarowych obrazów biofilmu konfokalnego za pomocą COMSTAT-DUOSTAT (wykres na rysunku 4.4; patrz artykuł wideo). Dane wskazują na wyższy odsetek EPS (czerwona linia) niż bakterii (zielona linia) na całej głębokości biofilmów. Ponadto większość komórek bakteryjnych jest związana z EPS (niebieska linia), zwłaszcza w środkowej i zewnętrznej warstwie biofilmu. Obserwacja ta wskazuje, że biofilmy wyhodowane w skrobi i sacharozie są szczególnie bogate w egzopolimery, które zazębiają się (w bliskim kontakcie) z większością komórek bakteryjnych; Taka organizacja strukturalna zwiększa stabilność i spoistość biofilmów ¹³. Trójwymiarowe renderingi i pomiary ilościowe obrazów konfokalnych dostarczają dodatkowych informacji o strukturze biofilmu, które uzupełniają dane biochemiczne i dane dotyczące ekspresji genów (zwiększona synteza nierozpuszczalnego glukanu typu GtfB przez S. mutans w biofilmach uprawianych skrobią + sacharoza) (dodatkowe przykłady patrz ^{5, 6, 11, 13}).
   
   Zestaw narzędzi analitycznych pomógł nam uzyskać, uporządkować i zintegrować dane z różnych testów biologicznych, które zapewniły kompleksową analizę tego, w jaki sposób S. mutans może reagować na złożone zmiany środowiskowe w wyniku interakcji dieta-gospodarz znalezionych w jamie ustnej (patrz szczegóły w Klein i in., 2009 ¹¹; Klein i in., 2010 ⁷).

Rysunek 1. Schemat blokowy zestawu narzędzi analitycznych do analizy biofilmu.

Rysunek 2. Konfokalne obrazowanie fluorescencyjne EPS i bakterii w biofilmach. Jednoczesna wizualizacja EPS (kolor czerwony) i bakterii/mikrokolonii (kolor zielony) w trójwymiarowym renderowaniu biofilmu Streptococcus mutans utworzonego na powierzchni dysku sHA.

Rysunek 3. Eksploracja i organizacja danych mikromacierzy przy użyciu oprogramowania Microarray Data Visualizer (MDV). Wykorzystanie funkcji diagramu Venna do wybrania interesujących genów, a następnie dodanie nazwy genu i adnotacji klasy funkcjonalnej.

Rysunek 4.1. Ocena tworzenia biofilmu przez S. mutans za pomocą testów biochemicznych (A) i RT-qPCR (B). Dane INS (nierozpuszczalne egzopolisacharydy) dobrze korelują ze wzorcem ekspresji gtfB oraz z biomasą biofilmów. Sacharoza na poziomie 1% była stężeniem dla maksymalnego tworzenia INS, ekspresji gtfB i akumulacji biofilmu na powierzchni sHA, podczas gdy 0,5% sacharozy było minimalnym stężeniem wymaganym do optymalnego rozwoju biofilmu przy użyciu naszego modelu in vitro. Komórki S. mutans hodowane w obecności 0,5% sacharozy + 1% skrobi dawały najwyższą biomasę i prezentowały więcej INS niż inne biofilmy, co korelowało ze zwiększoną ekspresją gtfB (B2). Te stężenia węglowodanów zostały wybrane do dalszej analizy transkryptomu.

Rysunek 4.2. Analiza danych z mikromacierzy za pomocą narzędzi BRB-Array Tools w połączeniu z oprogramowaniem MDV. a) Reprezentują liczbę genów wykrytych jako różnie wyrażone w każdym porównaniu (A, B lub C) oraz punkt czasowy oceniany za pomocą narzędzi BRB-Array. b) Microarray Data Visualizer (MDV) wykorzystujący diagram Venna do wyboru interesujących genów. c) Geny wyselekcjonowane na podstawie analizy MDV.

Rysunek 4.3. Geny S. mutans ulegają zróżnicowanej ekspresji w biofilmach skrobi+sacharozy (w porównaniu z biofilmami sacharozy) w różnych punktach czasowych zorganizowanych według klasy funkcjonalnej. Adnotacje genów są oparte na informacjach dostarczonych przez Los Alamos National Laboratory (www.oralgen.lanl.gov) lub przez opublikowaną literaturę dostępną na tej samej stronie internetowej.

Rysunek 4.4. Trójwymiarowe renderowanie i analiza COMSTAT-DUOSTAT biofilmu skrobia+sacharoza.

Dyskusja

W tej prezentacji zademonstrowaliśmy dwa kluczowe elementy zestawu narzędzi analitycznych (obrazowanie EPS/bakterii oraz eksplorację/przetwarzanie danych z mikromacierzy), wszechstronność i użyteczność różnych testów zintegrowanych w systemie. Nie ulega wątpliwości, że zestaw narzędzi ułatwił kompleksową (porównawczą) i jednoczesną analizę różnych aspektów biochemii, architektury i ekspresji genów biofilmów w odpowiedzi na różne warunki eksperymentalne z wykorzystaniem modelu in vitro . ⁷ Biorąc pod ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Syto 9	Invitrogen	S34854
Syto 60	Invitrogen	S11342
Dextran sprzężony alexa 647	Invitrogen	D22914
Dwufotonowy laserowy mikroskop skaningowy Olympus FV1000	Olympus Corporation