Komórki nabłonka płuc można wyizolować z dróg oddechowych myszy i hodować na granicy fazy powietrze-ciecz jako model zróżnicowanego nabłonka oddechowego. Opisano protokół izolacji, hodowli i narażania tych komórek na dym papierosowy z głównego strumienia w celu zbadania odpowiedzi molekularnych na tę toksynę środowiskową.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja komórek nabłonka dróg oddechowych myszy i ekspozycja na eksperymentalny dym tytoniowy w układzie interfejsu powietrze-ciecz
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Komórki nabłonka płuc można izolować z dróg oddechowych myszy i hodować na granicy faz powietrze-ciecz (ALI) jako model zróżnicowanego nabłonka oddechowego. Opisano protokół izolacji tych komórek i poddawania ich działaniu głównego nurtu dymu papierosowego (CS) w celu zbadania odpowiedzi komórek nabłonka na ekspozycję na CS. Protokół składa się z trzech części: izolacji komórek nabłonka dróg oddechowych z tchawicy myszy, hodowli tych komórek na granicy faz powietrze-ciecz (ALI) jako w pełni zróżnicowanych komórek nabłonkowych oraz dostarczania skalibrowanego głównego nurtu CS do hodowanych komórek. System hodowli ALI umożliwia hodowlę nabłonków oddechowych w warunkach, które bardziej przypominają ich środowisko fizjologiczne niż zwykłe systemy hodowli w cieczy. Badanie odpowiedzi molekularnych i komórkowych płuc na ekspozycję na CS jest kluczowym elementem zrozumienia wpływu zanieczyszczenia powietrza na zdrowie ludzi. Wyniki badań w tym obszarze mogą ostatecznie przyczynić się do zrozumienia etiologii przewlekłej obturacyjnej choroby płuc (COPD) oraz innych chorób związanych z paleniem tytoniu, które stanowią poważne globalne problemy zdrowotne.
Protokół
Cały protokół wymaga 2 dni na izolację komórek z tkanki zwierzęcej, 5-10 dni na proliferację komórek oraz dodatkowych 10-14 dni na różnicowanie komórek na granicy faz powietrze-ciecz. Dodatkowy dzień jest wymagany na ekspozycję komórek i pobranie próbek.
1. Izolacja komórek nabłonka tchawcopłucnego myszy (MTEC).
Uwaga: Wszystkie opisane poniżej procedury zostały przeanalizowane i zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committee) w Brigham and Women's Hospital/ Harvard Medical School Area.
Przed rozpoczęciem:
- Przygotować pożywkę Ham's F12 z antybiotykami. Do 250 mL podstawowej pożywki Ham's F12 (Cellgro) dodać 2,50 mL 100-krotnego roztworu penicyliny/streptomycyny (102 U/mL-102 mg/mL) oraz 250 μL 1000-krotnego roztworu Fungizone. Przechowywać w temperaturze 4°C do 4 tygodni.
- Przygotować 0,15% roztwór pronazy. Dodać 15 mg pronazy do 10 mL pożywki Ham's F12 z antybiotykami. Roztwór należy przygotować bezpośrednio przed użyciem i przechowywać w lodzie.
- Przygotować czystą powierzchnię roboczą oraz sterylne instrumenty chirurgiczne odpowiednie do operacji na małych zwierzętach, a także laminarny dygestorium do hodowli tkanek do izolacji komórek. Pozostały sprzęt jest standardowy dla hodowli komórek zwierzęcych, w tym inkubatory CO2 z nawilżaniem, chłodnia, laboratoryjne wirówki do komórek, mikroskop odwrócony oraz jednorazowe plastikowe pipety i naczynia hodowlane.
- Przygotować roztwór kolagenu I (50 μg/mL w 0,02 N kwasie octowym). Odpipetować 1,0 mL roztworu kolagenu do każdego dołka 12-dołkowej płytki transwell (Corning). Owinąć parafilmem i pozostawić na noc na płaskiej powierzchni w temperaturze pokojowej.
- Przy użyciu komercyjnie dostępnej linii myszy (np. C57Bl/6, samce w wieku 6-8 tygodni), uśmierć zwierzęta za pomocą zatwierdzonej metody eutanazji, takiej jak narkoza indukowana CO2. Zazwyczaj 6 myszy dostarczy wystarczającą liczbę komórek (1,5-2,0 x 105 komórek/mysz), aby zasiać 12-dołkową płytkę transwell.
- Spryskaj truchła zwierząt 70% roztworem EtOH w celu sterylizacji pola operacyjnego.
- Za pomocą czystych nożyczek chirurgicznych i skalpela usuń skórę z okolic tchawicy i odsłoń tchawicę. Otwórz jamę brzuszną, przetnij wzdłuż mostka i usuń klatkę piersiową. Usuwaj tkanki, aż zostanie odsłonięty koniec tchawicy.
- Umieść tchawice w 50 mL probówce stożkowej zawierającej 30 mL pożywki Ham's F12 z antybiotykami, w lodzie.
- W sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza przenieś tkankę tchawicy do sterylnej szalki Petriego 100 mm zawierającej 10 mL pożywki Ham's F12 z antybiotykami.
- Ostrożnie oddziel tkankę łączną za pomocą sterylnej pincety i nożyczek chirurgicznych.
- Przenieś tkankę tchawicy do nowej szalki Petriego 100 mm zawierającej 10 mL pożywki Ham's F12 z antybiotykami w celu wypłukania. Przetnij tchawice wzdłuż osi pionowej, aby odsłonić światło.
- Przenieś tchawice do probówki 50 mL zawierającej 10 mL 0,15% roztworu Pronazy i inkubuj przez noc w temperaturze 4°C.
- Drugiego dnia przygotuj następujące odczynniki:
- Przygotuj roztwór DNAzy I. Do 18 mL pożywki Ham's F12 z antybiotykami dodaj 2 mL roztworu stokowego albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w stężeniu 10 mg/mL oraz 10 mg surowej pancreaticznej DNAzy I. Rozlej na aliquoty po 1 mL i przechowuj w temperaturze -20°C (rozmrażać na lodzie przed użyciem).
- Przygotuj pożywkę Ham's F12 z antybiotykami i 20% płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Do 200 mL podstawowej pożywki Ham's F12 (Invitrogen) dodaj 50 mL inaktywowanej termicznie FBS, 2,5 mL 100-krotnego roztworu penicyliny/streptomycyny (102 U/mL-102 mg/mL) oraz 250 μL 1000-krotnego roztworu Fungizone.
- Przygotuj podstawową pożywkę MTEC z antybiotykami. Do 475,5 mL podstawowej pożywki DMEM/F12 (Cellgro) dodaj 7,5 mL 1 M roztworu HEPES, 10 mL 200 mM roztworu glutaminy, 2 mL 7,5% roztworu NaHCO3, 5 mL 100-krotnego roztworu penicyliny/streptomycyny oraz 500 μL 1000-krotnego roztworu Fungizone.
- Przygotuj pożywkę MTEC z 10% FBS. Do 45 mL podstawowej pożywki MTEC z antybiotykami dodaj 5 mL inaktywowanej termicznie FBS.
- Ostrożnie przemieszaj probówkę (z kroku 1.8) ruchem kołyszącym 10-12 razy, a następnie pozostaw na 30-60 minut w temperaturze 4°C.
- Dodaj do probówki 10 mL pożywki Ham's F12 zawierającej 20% FBS i antybiotyki, a następnie przemieszaj 12 razy ruchem kołyszącym.
- Przygotuj 3 probówki stożkowe 15 mL zawierające 10 mL pożywki Ham's F12 z 20% FBS i antybiotykami.
- Wyjmij tchawice z roztworu Pronazy, odstawiając ten roztwór na lód. Przenieś tchawice do pierwszej probówki stożkowej z pożywką Ham's F12 i odwróć probówkę 12 razy. Powtórz ten proces jeszcze dwa razy.
- Połącz roztwór Pronazy z trzema nadosadami z kroku 1.13 w jednej probówce 50 mL. Pozostałe tkanki odrzuć.
- Wiruj przy 1400 rpm (390 x g; wirówka Eppendorf 5810R wyposażona w rotor A-4-62) przez 10 min w temperaturze 4°C, a następnie odlej nadosad.
- Ostrożnie resuspenduj osad w 1 mL roztworu DNAzy (100-200 μL/tchawica) i inkubuj przez 5 min na lodzie.
- Wiruj przy 1400 rpm (390 x g) przez 5 min w temperaturze 4°C i odlej nadosad.
- Resuspenduj osad komórkowy w 8 mL pożywki MTEC zawierającej 10% FBS.
- Wysiej zawiesinę komórkową na płytki Primaria (Falcon). Inkubuj w temperaturze 37°C w atmosferze 95% powietrza i 5% CO2 przez 5 h (uwaga: jest to etap negatywnej selekcji fibroblastów).
- Zbierz zawiesinę komórkową z płytek i wypłucz płytki dwukrotnie 4 mL pożywki MTEC z 10% FBS. Połącz zawiesinę komórkową i wypłuczki w jednej probówce stożkowej 50 mL.
- Odlej 1 mL do cytospinowania i liczenia komórek. Wiruj w wirówce stołowej przez 5 min przy 5000 rpm (Eppendorf 5415D). Usuń 500 μL i resuspenduj osad w pozostałym nadosadzie. Użyj 100 μL do liczenia komórek metodą barwienia żywotności błękitem trypanu. Odstaw 4 aliquoty po 100 μL do analizy cytospinowej.
- Wiruj pozostałe 15 mL zawiesiny komórkowej przy 1400 rpm (390 x g) w temperaturze 4°C przez 10 min.
2. Namnażanie i różnicowanie MTEC na granicy faz powietrze-ciecz
Przygotować roztwory zapasowe kwasu retinowego. Roztwór zapasowy A: Odważyć kwas retinowy w ciemności (Mr 300.44 g/mol), aby przygotować 5 mM roztwór zapasowy w 95% EtOH. Przechowywać w probówce owiniętej folią aluminiową w temperaturze -80°C. W razie potrzeby przygotować roztwór zapasowy B (5 μM), dodając 50 μL roztworu zapasowego A, 500 μL roztworu BSA (100 mg/ mL) oraz 49.5 mL zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS). Przechowywać w probówce owiniętej folią aluminiową w temperaturze -80°C do 4 tygodni.
Przygotować pożywkę do proliferacji MTEC zawierającą kwas retinowy. Do 45,7 mL podstawowej pożywki MTEC z antybiotykami dodać 2,5 mL inaktywowanego ciepłem FBS, 1 mL roztworu zapasowego B kwasu retinowego, 250 μL roztworu insuliny (2 mg/mL insuliny w 4 mM HCl), 250 μL roztworu epidermalnego czynnika wzrostu (5 μg/mL EGF w HBS zawierającym 1 mg/mL BSA), 200 μL ekstraktu z przysadki bydlęcej (15 mg/mL w HBS zawierającym 1 mg/mL BSA), 50 μL roztworu transferryny (5 mg/mL transferryny w HBS zawierającym 1 mg/mL BSA) oraz 50 μL roztworu toksyny cholerycznej (100 mg/mL w HBS zawierającym 1 mg/mL BSA). Gotową pożywkę wysterylizować poprzez filtrowanie i zużyć w ciągu 2 dni od przygotowania.
- Usunąć roztwór kolagenu z płytek transwell, pozostawić pod wyciągiem na 5 min, a następnie przemyć PBS 2 razy.
- Po wirowaniu zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej objętości pożywki proliferacyjnej (500 μL), aby umożliwić wysianie 7,5 x 104-1,0 x105 komórek na dołek. Nanieść pipetą 500 μL zawiesiny komórkowej na powierzchnię apikalną wkładki z membrany poliwęglanowej transwell. Do komory bazalnej transwellu dodać 1,5 mL pożywki proliferacyjnej.
- Inkubować zanurzone kultury MTEC w temperaturze 37°C w wilgotnym inkubatorze zawierającym 95% powietrza i 5% CO2 przez 7-10 dni.
- Odczekać trzy dni przed pierwszą wymianą pożywki. Wymieniać pożywkę co drugi dzień. Monitorować kultury poprzez inspekcję wizualną oraz pomiar transepitelialnej oporności elektrycznej za pomocą elektrody (EVOM Ohmvoltometer, World Precision Instruments, Sarasota, FL).
- Gdy komórki osiągną konfluencję, a oporność nabłonka wyniesie 1000 Ω/cm2, komórki są gotowe do dyferencjacji w warunkach ALI.
- Przygotować pożywkę bazalną MTEC zawierającą 2% NuSerum. Dodać NuSerum do podstawowej pożywki MTEC do stężenia końcowego 2% V/V. Przed użyciem dodać kwas retinowy (Stock B) do stężenia końcowego 1 X 10-7 M. Przygotować świeżą pożywkę i zużyć w ciągu 2 dni.
- Pozostawić komórki do dyferencjacji na 10-14 dni, usuwając pożywkę apikalną i zastępując pożywkę bazalną 750 μL pożywki bazalnej MTEC zawierającej 2% NuSerum i kwas retinowy. Wymieniać pożywkę bazalną i przemywać stronę apikalną pożywką MTEC z 2% NuSerum co drugi dzień.
3. Aplikacja dymu papierosowego do hodowlanych komórek nabłonkowych
- Naraż stronę apikalną kultur w transwellach na główny strumień dymu papierosowego, korzystając z systemu ekspozycji komórek na dym papierosowy (EMI Instruments, Pittsburgh, PA). Zdjęcie aparatury znajduje się na Rysunku 1. Specyfikacje techniczne podano w Tabeli odczynników i sprzętu. W skrócie, aparatura składa się z pompy perystaltycznej, która pali każdego papierosa w ~7-8 zaciągnięciach, wciągając główny strumień dymu do linii z polipropylenu połączonej z wentylowaną komorą ekspozycyjną. W komorze ekspozycyjnej utrzymywana jest temperatura 37°C dzięki cyrkulacji wody oraz atmosfera 5% CO2 za pomocą linii gazowej. Komórki mogą być narażone na dym z badawczych papierosów referencyjnych Kentucky 3R4F z filtrem (The Tobacco Research Institute, University of Kentucky, Lexington, KY). Zazwyczaj komórki są narażone na dym z 1-2 papierosów, co daje 100-200 mg/m3 całkowitej masy cząstek stałych (TPM). Kultury kontrolne są narażone na powietrze pokojowe przez analogiczny czas ekspozycji.
- Wartość TPM jest mierzona zgodnie z protokołem producenta dostarczonym z maszyną do palenia TE-10c (Teague Enterprises). W skrócie, filtr (Pallflex) jest umieszczany w stalowym uchwycie szeregowym na rurce próbnej prowadzącej z portu próbkowania w komorze palenia do pompy o stałym przepływie (jednostka próbkowania). Rurka wylotowa łączy jednostkę próbkowania z miernikiem gazu (Dry Gas Meter, ONM61,67, AEM). Filtr jest ważony przed i po pobraniu próbek gazu. Całkowita masa materiału osadzonego na filtrze w mg jest normalizowana do całkowitej objętości pobranego powietrza.
- Komórki można następnie zebrać w dowolnym punkcie czasowym (np. 0-24 h) po ekspozycji w celu przeprowadzenia standardowych procedur analitycznych (np. analiza Western blot, analiza mRNA itp.) lub mikroskopii (np. mikroskopia konfokalna lub elektronowa). Pożywki hodowlane mogą być również analizowane pod kątem uwalniania cytokin lub LDH w testach cytotoksyczności.
4. Reprezentatywne wyniki
Pomyślna izolacja, proliferacja i różnicowanie nabłonka w warunkach ALI powinny doprowadzić do powstania nienaruszonej warstwy jednowarstwowej o morfologii brukowanej. Opór transepitelialny zdrowych kultur powinien wynosić około 1000-2000 Ω/cm2. Rysunek 2 przedstawia warstwę jednowarstwową mysich komórek nabłonka dróg oddechowych zabarwioną pod kątem markerów komórek nabłonkowych i rzęsek w warunkach kontrolnych oraz po ekspozycji na dym papierosowy. Rysunek 3 przedstawia reprezentatywne mikrografie elektronowe zdrowych kultur MTEC, obrazujące ultrastrukturę i morfologię rzęsek.
Rysunek 1. Przygotowanie komórek nabłonkowych przebiega w trzech fazach: etapie izolacji, etapie propagacji oraz etapie różnicowania na granicy faz powietrze-ciecz (schemat). Komórki nabłonkowe są izolowane z tchawicy myszy, wysiewane na transwelle, gdzie proliferują w hodowli zanurzonej, a następnie przekształcane w hodowlę na granicy faz powietrze-ciecz, w której ulegają pełnemu różnicowaniu. Eksperymenty są zazwyczaj przeprowadzane w 24tym dniu ciągłej hodowli. Zdjęcie przedstawia modelowy układ do ekspozycji hodowlanych komórek na główny strumień dymu papierosowego. System hodowli ALI w transwellach jest umieszczony wewnątrz specjalnie zaprojektowanego modułowego systemu dostarczania dymu papierosowego, w którym kontrolowana jest temperatura, wilgotność oraz poziom CO2.
Rycina 2. Hodowle komórek nabłonkowych utrwalono i zabarwiono na jądra (Hoechst 33258), F-aktynę (kolor zielony; faloidyna sprzężona z Alexa-Fluor 488) oraz marker rzęsek – acetylowaną α-tubulinę (kolor czerwony; przeciwciało wtórne sprzężone z Cy3). Dolne panele przedstawiają analogiczne obrazy komórek nabłonkowych wykonane 4 godziny po ekspozycji na dym papierosowy (2 papierosy, 150 mg/m3). (B) Uwalnianie dehydrogenazy mleczanowej (LDH) mierzono w medium podstawowym 24 godziny po ekspozycji na wskazane różne dawki dymu papierosowego.
Rycina 3. Hodowle komórek nabłonkowych wyizolowanych z nabłonka tchawicy myszy na granicy powietrze-ciecz różnicują się w kilka podtypów, które w badaniu za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) wykazują cechy komórek rzęskowych, podstawnych i nierzęskowych 1. Komórki te są typowe dla rzekomo wielowarstwowego nabłonka oddechowego. Oznaczenia na rycinie odpowiadają: bb: ciałko podstawne, a: aksonema, m: mitochondria, n: jądro komórkowe, s: podłoże (membrana poliwęglanowa), mv: mikrokosmki
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Protokół opisujący izolację komórek nabłonka tchawicy myszy został zaadaptowany z protokołów You et al., 1, oraz innych 2-3 z wprowadzonymi modyfikacjami. Jak w przypadku każdego protokołu opisującego izolację komórek, najistotniejszym aspektem jest unikanie kontaminacji patogenami bakteryjnymi lub grzybiczymi poprzez stosowanie rygorystycznych technik aseptycznych. Drugim krytycznym krokiem jest unikanie kontaminacji kultur fibroblastami, czego można uniknąć dzięki starannemu wycięciu tcha...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Emeka Ifedigbo za pomoc techniczną oraz dr. Shivraj Tyagi za cenną wiedzę ekspercką. Dziękujemy również Harvard NeuroDiscovery Center za pomoc w zakresie mikroskopii. Praca ta była częściowo finansowana z grantu przeddoktorskiego American Heart Association 09PRE2250120 przyznanego Hilaire Lam oraz grantów NIH, R01-HL60234, R01-HL55330, R01-HL079904, przyznanych A. M. K. Choi.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Ham’pożywka F12 1X | Cellgro | MT-10-080-CM | z L-glutaminą |
| Pen/strep | Lonza Inc. | 17-602E | |
| Pronaza | Grupa Roche | 10165921001 | Streptomyces griseus |
| Kolagen I | BD Biosciences | 354236 | Z ogona szczura |
| Kwas octowy | Sigma-Aldrich | 338826-25 | |
| DNaza I | Sigma-Aldrich | DN25-100MG | Z trzustki bydlęcej |
| Albuminy surowicy bydlęcej | Fisher Scientific | BP1605-100 | Frakcja V |
| kwas retinowy | Kwas retinowy | R265-50MG | |
| Hank’Zrównoważony roztwór soli (BSS) | GIBCO, firmy Life Technologies | 14175 | Bez Ca++ lub Mg++ |
| DMEM-F12 | Cellgro | MT-15-090-CM | Bez L-glutaminy lub HEPES-u |
| HEPES, 1M w H2O2O | Sigma-Aldrich | 83264-100ML | |
| L-glutamina | Sigma-Aldrich | G7513-100ML | 200 mM |
| Amfoterycyna B (Fungizone) | Fisher Scientific | 1672346 | |
| Insulina | Sigma-Aldrich | 16634-50MG | Trzustka bydlęca |
| Apo-transferyna (ludzka) | Sigma-Aldrich | T1147-100MG | |
| Toksyna choleryczna | Sigma-Aldrich | C8052 | Vibrio cholerae |
| Epidermalny czynnik wzrostu | BD Biosciences | 354001 | Mysz |
| Ekstrakt z przysadki wołowej | BD Biosciences | 354123 | |
| NuSerum | BD Biosciences | 355100 | |
| Transwell | Corning | 3401 | 12 mm, pory 0,4 mmPoliwęglan |
| Szalka hodowlana Primaria 100 mm | Falcon BD | 353803 | |
| membrana Pallflex | Pall Corporation | EMFAB TX40H120-WW | |
| Maszyna do palenia | Usługi EMI | ATCSALI-1 | patrz Przypis* |
Bibliografia
- You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, L1315-L1320 (2002).
- Davidson, D. J. Murine epithelial cells: isolation and culture. J. Cyst. Fibros. 2, Suppl 3. 59-62 (2004).
- Davidson, D. J., Kilanowski, F. M., Randell, S. H., Sheppard, D. N., Dorin, J. R. A primary culture model of differentiated murine tracheal epithelium. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 279, L766-L778 (2000).
- Rabe, K. F. et al.; Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease. Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive pulmonary disease: GOLD executive summary. Am. J Respir. Crit. Care Med. 176, 532-555 (2007).
- Macnee, W. Pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease. Clin. Chest Med. 28, 479-513 (2007).
- Tuder, R. M., Yoshida, T., Arap, W., Pasqualini, R., Petrache, I. State of the art. Cellular and molecular mechanisms of alveolar destruction in emphysema: an evolutionary perspective. Proc. Am. Thorac. Soc. 3, 503-510 (2006).
- Yao, H., Rahman, I. Current concepts on the role of inflammation in COPD and lung cancer. Curr. Opin. Pharmacol. 9, 375-383 (2009).
- van der Toorn, M. Cigarette smoke irreversibly modifies glutathione in airway epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 293, L1156-L1162 (2007).
- Slebos, D. J. Mitochondrial localization and function of heme oxygenase-1 in cigarette smoke-induced cell death. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 36, 409-417 (2007).
- Kim, H. P. Autophagic proteins regulate cigarette smoke induced apoptosis: protective role of heme oxygenase-1. Autophagy. 4, 887-895 (2008).
- Chen, Z. H. Egr-1 regulates autophagy in cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease. PLoS ONE. 3, e3316-e3316 (2008).
- Okuwa, K. In vitro micronucleus assay for cigarette smoke using a whole smoke exposure system: A comparison of smoking regimens. Exp Toxicol Pathol. , Forthcoming (2009).
- St-Laurent, J., Proulx, L. I., Boulet, L. P., Bissonnette, E. Comparison of two in vitro models of cigarette smoke exposure. Inhal. Toxicol. 21, 1148-1153 (2009).
- Watson, A. M., Benton, A. S., Rose, M. C., Freishtat, R. J. Cigarette smoke alters tissue inhibitor of metalloproteinase 1 and matrix metalloproteinase 9 levels in the basolateral secretions of human asthmatic bronchial epithelium in vitro. J Investig. Med. 58, 725-729 (2010).
- Rennard, S. I. Cigarette smoke in research. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 31, 479-480 (2004).
- Shapiro, S. D. Smoke gets in your cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 31, 481-482 (2004).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
