Izolacja komórek nabłonka dróg oddechowych myszy i ekspozycja na eksperymentalny dym tytoniowy w układzie interfejsu powietrze-ciecz

Podsumowanie

Komórki nabłonka płuc można wyizolować z dróg oddechowych myszy i hodować na granicy fazy powietrze-ciecz jako model zróżnicowanego nabłonka oddechowego. Opisano protokół izolacji, hodowli i narażania tych komórek na dym papierosowy z głównego strumienia w celu zbadania odpowiedzi molekularnych na tę toksynę środowiskową.

Streszczenie

Komórki nabłonka płuc można izolować z dróg oddechowych myszy i hodować na granicy faz powietrze-ciecz (ALI) jako model zróżnicowanego nabłonka oddechowego. Opisano protokół izolacji tych komórek i poddawania ich działaniu głównego nurtu dymu papierosowego (CS) w celu zbadania odpowiedzi komórek nabłonka na ekspozycję na CS. Protokół składa się z trzech części: izolacji komórek nabłonka dróg oddechowych z tchawicy myszy, hodowli tych komórek na granicy faz powietrze-ciecz (ALI) jako w pełni zróżnicowanych komórek nabłonkowych oraz dostarczania skalibrowanego głównego nurtu CS do hodowanych komórek. System hodowli ALI umożliwia hodowlę nabłonków oddechowych w warunkach, które bardziej przypominają ich środowisko fizjologiczne niż zwykłe systemy hodowli w cieczy. Badanie odpowiedzi molekularnych i komórkowych płuc na ekspozycję na CS jest kluczowym elementem zrozumienia wpływu zanieczyszczenia powietrza na zdrowie ludzi. Wyniki badań w tym obszarze mogą ostatecznie przyczynić się do zrozumienia etiologii przewlekłej obturacyjnej choroby płuc (COPD) oraz innych chorób związanych z paleniem tytoniu, które stanowią poważne globalne problemy zdrowotne.

Protokół

Cały protokół wymaga 2 dni na izolację komórek z tkanki zwierzęcej, 5-10 dni na proliferację komórek oraz dodatkowych 10-14 dni na różnicowanie komórek na granicy faz powietrze-ciecz. Dodatkowy dzień jest wymagany na ekspozycję komórek i pobranie próbek.

1. Izolacja komórek nabłonka tchawcopłucnego myszy (MTEC).

Uwaga: Wszystkie poniższe procedury zostały przeanalizowane i zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) w szpitalu Brigham and Women's Hospital oraz w obszarze Harvard Medical School.

Przed rozpoczęciem:

• Przygotować pożywkę Ham's F12 z dodatkiem antybiotyków. Do 250 mL podstawowej pożywki Ham's F12 (Cellgro) dodać 2,50 mL roztworu 100 X penicyliny/streptomycyny (10² U/mL-10² mg/mL) oraz 250 μL roztworu 1000 X Fungizone. Przechowywać w temperaturze 4°C przez maksymalnie 4 tygodnie.
• Przygotować 0,15% roztwór pronazy. Dodać 15 mg pronazy do 10 mL pożywki Ham's F12 z antybiotykami. Przygotować partię świeżą i przechowywać w lodzie do momentu użycia.
• Przygotować czystą powierzchnię roboczą oraz sterylne narzędzia chirurgiczne odpowiednie do operacji małych zwierząt, a także laminarna komora do hodowli tkanek do izolacji komórek. Pozostały sprzęt uznaje się za standardowy dla hodowli komórek zwierzęcych, w tym inkubatory CO₂ z nawilżaczem, chłodnię, wirówki stołowe do komórek, mikroskop odwrócony oraz jednorazowe plastikowe pipety i naczynia hodowlane.
• Przygotować roztwór kolagenu I (50 μg/mL w 0,02 N kwasie octowym). Odpipetować 1,0 mL roztworu kolagenu do każdego otworu 12-dołkowej płytki transwell (Corning). Owinąć parafilmem i pozostawić na noc na płaskiej powierzchni w temperaturze pokojowej.

1. Używając dostępnej komercyjnie szczepu myszy (np. C57Bl/6, samce w wieku 6-8 tygodni), przeprowadzić eutanazję zwierząt przy użyciu zatwierdzonej metody, takiej jak narkoza indukowana CO₂. Zazwyczaj 6 myszy dostarcza wystarczającą liczbę komórek (1,5-2,0 x 10⁵ komórek/mysz) do zasiewu na 12-dołkowej płytce transwell.
2. Spryskać tusze zwierząt 70% roztworem EtOH w celu sterylizacji pola operacyjnego.
3. Za pomocą czystych nożyczek chirurgicznych i skalpela usunąć skórę wokół obszaru tchawicy i odsłonić tchawicę. Rozciąć jamę brzuszną wzdłuż mostka i usunąć klatkę piersiową. Usuwać tkanki aż do całkowitego odsłonięcia tchawicy.
4. Umieścić tchawice w probówce stożkowej 50 mL zawierającej 30 mL pożywki Ham's F12 z antybiotykami, w lodzie.
5. W sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza przenieść tkankę tchawicy do sterylnej szalki Petriego 100 mm zawierającej 10 mL pożywki Ham's F12 z antybiotykami.
6. Ostrożnie wypreparować tkankę łączną za pomocą sterylnej pincety i nożyczek chirurgicznych.
7. Przenieść tkankę tchawicy do nowej szalki Petriego 100 mm zawierającej 10 mL pożywki Ham's F12 z antybiotykami w celu wypłukania. Przeciąć tchawice wzdłuż osi pionowej, aby odsłonić światło narządu.
8. Przenieść tchawice do probówki 50 mL zawierającej 10 mL 0,15% roztworu Pronazy i inkubować przez noc w temperaturze 4°C.
9. Drugiego dnia przygotować:
   • Przygotować roztwór DNAzy I. Do 18 mL pożywki Ham's F12 z antybiotykami dodać 2 mL roztworu stokowego albuminy surowicy bydlęcej (BSA) o stężeniu 10 mg/mL oraz 10 mg surowej DNAzy I z trzustki. Przygotować alikwoty po 1 mL i przechowywać w temperaturze -20°C (rozmrażać w lodzie przed użyciem).
   • Przygotować pożywkę Ham's F12 z antybiotykami i 20% płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Do 200 mL podstawowej pożywki Ham's F12 (Invitrogen) dodać 50 mL inaktywowanej termicznie FBS, 2,5 mL roztworu 100 X penicyliny/streptomycyny (10² U/mL-10² mg/mL) oraz 250 μL roztworu 1000 X Fungizone.
   • Przygotować podstawową pożywkę MTEC z antybiotykami. Do 475,5 mL podstawowej pożywki DMEM/F12 (Cellgro) dodać 7,5 mL 1 M roztworu HEPES, 10 mL 200 mM roztworu glutaminy, 2 mL 7,5% roztworu NaHCO₃, 5 mL roztworu 100 X penicyliny/streptomycyny oraz 500 μL roztworu 1000 X Fungizone.
   • Przygotować pożywkę MTEC/10% FBS. Do 45 mL podstawowej pożywki MTEC z antybiotykami dodać 5 mL inaktywowanej termicznie FBS.
10. Delikatnie potrząsnąć probówką (z kroku 1.8) 10-12 razy, a następnie pozostawić na 30-60 minut w temperaturze 4°C.
11. Dodać do probówki 10 mL pożywki Ham's F12 zawierającej 20% FBS i antybiotyki, a następnie potrząsnąć 12 razy.
12. Przygotować 3 probówki stożkowe 15 mL zawierające 10 mL pożywki Ham's F12 z 20% FBS i antybiotykami.
13. Wyjąć tchawice z roztworu Pronazy, odstawiając roztwór ten do lodu. Przenieść tchawice do pierwszej probówki stożkowej z pożywką Ham's F12 i odwrócić probówkę 12 razy. Powtórzyć ten proces jeszcze dwa razy.
14. Połączyć roztwór Pronazy z trzema supernatantami z kroku 1.13 w jednej probówce 50 mL. Pozostałą tkankę usunąć.
15. Wirować przy 1400 rpm (390 x g; wirówka Eppendorf 5810R z rotorem A-4-62) przez 10 min w temperaturze 4°C, a następnie usunąć supernatant.
16. Delikatnie resuspendować osad w 1 mL roztworu DNAzy (100-200 μL/tchawica) i inkubować przez 5 min w lodzie.
17. Wirować przy 1400 rpm (390 x g) przez 5 min w temperaturze 4°C i usunąć supernatant.
18. Resuspendować osad komórkowy w 8 mL pożywki MTEC z 10% FBS.
19. Wysiać zawiesinę komórkową na płytki Primaria (Falcon). Inkubować w temperaturze 37°C w atmosferze 95% powietrza i 5% CO₂ przez 5 h (Uwaga: jest to etap negatywnej selekcji fibroblastów).
20. Zebrać zawiesinę komórkową z płytek i dwa razy wypłukać płytki 4 mL pożywki MTEC z 10% FBS. Połączyć zawiesinę komórkową i płukanki w probówce stożkowej 50 mL.
21. Odlać 1 mL do cytospinu i liczenia komórek. Wirować w wirówce stołowej przez 5 min przy 5 000 rpm (Eppendorf 5415D). Odjąć 500 μL i resuspendować osad w pozostałym supernatancie. Użyć 100 μL do liczenia komórek metodą barwienia żywotności błękitem trypanowym. Odlać 4 alikwoty po 100 μL do analizy cytospinem.
22. Wirować pozostałe 15 mL zawiesiny komórkowej przy 1400 rpm (390 x g) w temperaturze 4°C przez 10 min.

2. Namnażanie i różnicowanie MTEC na granicy faz powietrze-ciecz

Przygotować roztwory zapasowe kwasu retinowego. Roztwór zapasowy A: Odważyć kwas retinowy w ciemności (Mr 300,44 g/mol), aby przygotować 5 mM roztwór zapasowy w 95% EtOH. Przechowywać w probówce owiniętej folią aluminiową w temperaturze -80°C. W razie potrzeby przygotować roztwór zapasowy B (5 μM), dodając 50 μL roztworu A, 500 μL roztworu BSA (100 mg/mL) oraz 49,5 mL zrównoważonego soli roztworu Hanksa (HBSS). Przechowywać w probówce owiniętej folią aluminiową w temperaturze -80°C przez maksymalnie 4 tygodnie.

Przygotować pożywkę do proliferacji MTEC zawierającą kwas retinowy. Do 45,7 mL podstawowej pożywki MTEC z antybiotykami dodać 2,5 mL inaktywowanego ciepłem FBS, 1 mL roztworu zapasowego B kwasu retinowego, 250 μL roztworu insuliny (2 mg/mL insuliny w 4 mM HCl), 250 μL roztworu epidermalnego czynnika wzrostu (5 μg/mL EGF w HBS zawierającym 1 mg/mL BSA), 200 μL ekstraktu z przysadki bydlęcej (15 mg/mL w HBS zawierającym 1 mg/mL BSA), 50 μL roztworu transferryny (5 mg/mL transferryny w HBS zawierającym 1 mg/mL BSA) oraz 50 μL roztworu toksyny cholerycznej (100 mg/mL w HBS zawierającym 1 mg/mL BSA). Gotową pożywkę wysterylizować poprzez filtrację i wykorzystać w ciągu 2 dni od przygotowania.

1. Usunąć roztwór kolagenu z płytek transwell, pozostawić pod dygestorium na 5 min, a następnie przemyć PBS 2 razy.
2. Po wirowaniu resuspender osad komórkowy w odpowiedniej objętości pożywki proliferacyjnej (500 μL), aby umożliwić wysianie 7,5 x 10⁴–1,0 x 10⁵ komórek na studzienkę. Pipetować 500 μL zawiesiny komórkowej na powierzchnię apikalną wkładki z membrany poliwęglanowej transwell. Dodać 1,5 mL pożywki proliferacyjnej do komory bazalnej transwellu.
3. Inkubować zanurzone kultury MTEC w temperaturze 37°C w wilgotnym inkubatorze z atmosferą 95% powietrza i 5% CO₂ przez 7-10 dni.
4. Odczekać trzy dni przed pierwszą wymianą pożywki. Wymieniać pożywkę co drugi dzień. Monitorować kultury poprzez inspekcję wizualną oraz pomiar transepitelialnej oporności elektrycznej za pomocą elektrody (EVOM Ohmvoltometer, World Precision Instruments, Sarasota, FL).
5. Gdy komórki osiągną konfluencję, a oporność nabłonka wyniesie 1000 Ω/cm², komórki są gotowe do różnicowania w warunkach ALI.
6. Przygotować podstawową pożywkę MTEC zawierającą 2% NuSerum. Dodać NuSerum do podstawowej pożywki MTEC do końcowego stężenia 2% V/V. Przed użyciem dodać kwas retinowy z roztworu zapasowego Stock B do końcowego stężenia 1 X 10^-7 M. Przygotować świeżą porcję i zużyć w ciągu 2 dni.
7. Pozostawić komórki do różnicowania przez 10-14 dni, usuwając pożywkę apikalną i zastępując pożywkę bazalną 750 μL podstawowej pożywki MTEC zawierającej 2% NuSerum i kwas retinowy. Wymieniać pożywkę bazalną i przemywać stronę apikalną pożywką MTEC zawierającą 2% NuSerum co drugi dzień.

3. Ekspozycja hodowlanych komórek nabłonkowych na dym papierosowy

1. Poddać stronę apikalną kultur w transwellach działaniu dymu papierosowego w głównym strumieniu, korzystając z systemu ekspozycji komórek na dym papierosowy (EMI Instruments, Pittsburgh, PA). Fotografię aparatury przedstawiono na Rysunku 1. Specyfikacje techniczne znajdują się w Tabeli odczynników i sprzętu. W skrócie, aparatura składa się z pompy perystaltycznej, która pali każdego papierosa w ok. 7-8 zaciągnięciach, wciągając dym w głównym strumieniu do linii z polipropylenu, która jest połączona z wentylowaną komorą ekspozycyjną. W komorze ekspozycyjnej utrzymywana jest temperatura 37°C dzięki cyrkulacji wody oraz atmosfera 5% CO₂ za pomocą linii gazowej. Komórki można eksponować na dym, używając referencyjnych papierosów z filtrem Kentucky 3R4F (The Tobacco Research Institute, University of Kentucky, Lexington, KY). Zazwyczaj komórki są eksponowane na dym z 1-2 papierosów, co daje 100-200 mg/m³ całkowitej masy cząsteczkowej (TPM). Kultury kontrolne są eksponowane na powietrze pokojowe przez odpowiadający okres ekspozycji.
2. Wartość TPM mierzy się zgodnie z protokołem producenta dostarczonym z maszyną do palenia TE-10c (Teague Enterprises). W skrócie, filtr (Pallflex) umieszcza się w stalowym uchwycie przelotowym na rurce próbkowania prowadzącej z portu poboru w komorze dymnej do pompy o stałym przepływie (jednostka próbkowania). Rurka odpływowa łączy jednostkę próbkowania z gazomierzem (Dry Gas Meter, ONM61,67, AEM). Filtr jest ważony przed i po pobieraniu próbek gazu. Całkowita masa materiału osadzonego na filtrze w mg jest normalizowana względem całkowitej objętości pobranego powietrza.
3. Komórki można następnie zebrać w dowolnym punkcie czasowym (np. 0-24 h) po ekspozycji do standardowych procedur analitycznych (np. analiza Western blot, analiza mRNA itp.) lub mikroskopii (np. mikroskopia konfokalna lub elektronowa). Pożywki hodowlane można również analizować pod kątem uwalniania cytokin lub LDH w testach cytotoksyczności.

4. Reprezentatywne wyniki

Pomyślna izolacja, proliferacja i różnicowanie nabłonka w warunkach ALI powinno skutkować powstaniem nienaruszonej warstwy jednowarstwowej o morfologii brukowanej. Opór transepithelialny zdrowych kultur powinien wynosić około 1000-2000 Ω/cm². Rycina 2 przedstawia warstwę jednowarstwową mysich komórek nabłonka oddechowego zabarwioną pod kątem markerów komórek nabłonka i rzęsek w warunkach kontrolnych oraz po ekspozycji na dym tytoniowy. Rycina 3 pokazuje reprezentatywne mikrografie elektronowe zdrowych kultur MTEC, przedstawiające ultrastrukturę i morfologię rzęsek.

Rycina 1. Przygotowanie komórek nabłonkowych przebiega w trzech fazach: etapie izolacji, etapie propagacji oraz etapie różnicowania na granicy powietrze-ciecz (schemat). Komórki nabłonkowe są izolowane z tchawicy myszy, wysiewane na wkładki transwell, gdzie proliferują w hodowli zanurzonej, a następnie przekształcane w hodowlę na granicy powietrze-ciecz, w której ulegają pełnemu różnicowaniu. Eksperymenty są zazwyczaj przeprowadzane 24^tego dnia ciągłej hodowli. Zdjęcie przedstawia modelowy układ ekspozycji hodowanych komórek na dym papierosowy w głównym strumieniu. System hodowli ALI w transwellach jest umieszczony wewnątrz dedykowanego modułowego systemu podawania dymu papierosowego, w którym kontrolowana jest temperatura, wilgotność oraz poziom CO₂.

Rycina 2. Hodowle komórek nabłonkowych utrwalono i zabarwiono na jądra (Hoechst 33258), F-aktynę (zielony; falloidyna sprzężona z Alexa-Fluor 488) oraz marker rzęsek – acetylowaną α-tubulinę (czerwony; przeciwciało wtórne sprzężone z Cy3). Dolne panele przedstawiają analogiczne obrazy komórek nabłonkowych wykonane 4 godziny po ekspozycji na dym tytoniowy (2 papierosy, 150 mg/m³). (B) Uwalnianie dehydrogenazy mleczanowej (LDH) mierzono w pożywce podstawowej 24 godziny po ekspozycji na wskazane różne dawki dymu tytoniowego.

Rycina 3. Hodowle komórek nabłonkowych izolowanych z nabłonka tchawicy myszy na granicy powietrze-ciecz różnicują się w kilka podtypów, które w badaniu za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) wykazują cechy komórek rzęskowych, podstawnych i nierzęskowych ¹. Komórki te są typowe dla rzekowielowarstwowego nabłonka oddechowego. Oznaczenia na rycinie odpowiadają: bb: ciałko podstawne, a: aksonema, m: mitochondria, n: jądro, s: podłoże (membrana poliwęglanowa), mv: mikrokosmki

Dyskusja

Protokół opisujący izolację komórek nabłonka tchawicy myszy został zaadaptowany z protokołów You et al., ¹, oraz innych ^2-3 z wprowadzonymi modyfikacjami. Jak w przypadku każdego protokołu opisującego izolację komórek, najistotniejszym aspektem jest unikanie kontaminacji patogenami bakteryjnymi lub grzybiczymi poprzez stosowanie rygorystycznych technik aseptycznych. Drugim krytycznym krokiem jest unikanie kontaminacji kultur fibroblastami, czego można uniknąć dzięki starannemu wycięciu tcha...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szynka" s F12 Medium 1X	Cellgro	MT-10-080-CM	z długopisem L-glutaminy
/ paciorkowiec	Lonza Inc.	17-602E
Pronase	Roche Group	10165921001	Streptomyces griseus
Collagen I	BD Biosciences	354236	Z ogona szczura
Kwas octowy	Sigma-Aldrich	338826-25
DNaseI	Sigma-Aldrich	DN25-100MG	Z trzustki bydlęcej
Surowica bydlęca Albumina	Fisher Scientific	BP1605-100	Frakcja V
Kwas retinowy	Kwas retinowy	R265-50MG
Hank' s Zrównoważony roztwór soli	GIBCO, firmy Life Technologies	14175	Bez Ca++ lub Mg++
DMEM-F12	Cellgro	MT-15-090-CM	Bez L-glutaminy lub HEPES
HEPES, 1M w H2O	Sigma-Aldrich	83264-100ML
L-Glutamina	Sigma-Aldrich	G7513-100ML	200 mM
Amfoterycyna B (Fungizone)	Fisher Scientific
Insulina	Sigma-Aldrich	16634-50MG	Trzustka bydlęca
Apo-transferyna (ludzka)	Sigma-Aldrich	T1147-100MG
Toksyna	Sigma-Aldrich	C8052	Vibrio Cholerae
Naskórkowy czynnik wzrostu	BD Biosciences	354001	Ekstrakt z
przysadki bydlęcej	BD Biosciences	354123
NuSerum	BD Biosciences	355100
Transwell	Corning	3401	12 mm, 0,4 mm Pore Poliwęglanowa
półmiska hodowlana Primaria 100 mm	Membrana Falcon BD	353803
Pallflex Maszyna	EMFAB	TX40H120-WW
	Usługi EMI	ATCSALI-1	patrz Przypis*
*Maszyna do palenia papierosów to specjalnie zaprojektowana i wyprodukowana 14 "x14"x20" Dwukomorowa i z płaszczem wodnym przezroczysta komora Lexan z poliwęglanu o grubości 1/2" do ekspozycji na dym papierosowy z kontrolowanym temperaturą, kontrolowanym czujnikiem poziomu wody systemem odcinającym. Zainstalowana jest jednostka do palenia/zaciągania papierosów dla zmiennej szybkości zaciągania się papierosem. Gdy urządzenie jest w użyciu, naśladuje inkubator w tym sensie, że temperatura, wilgotność i dwutlenek węgla są kontrolowane w systemie. W skład systemu wchodzą: (I) dostosowana dwukomorowa jednostka z płaszczem wodnym, która utrzymuje kontrolowane środowisko do eksperymentów z kulturami tkankowymi. (II) Cyfrowy, wytrzymały, precyzyjny system cyrkulacji temperatury wody z podwójną pompą z czujnikiem poziomu wody i kontrolą temperatury (III) Urządzenie do palenia papierosów z pompą do zaciągania się. (IV) Cykler sterowania szybkością sterowania czujnikiem cyklu pompy (IV) Precyzyjny uchwyt filtra liniowego ze stali nierdzewnej. (V) Zdejmowany wentylator do mieszania dymu papierosowego o rozmiarze 11/2 cala o jednorodności osiowej. (VI) Średniej wielkości łaźnia wodna z uchwytem montażowym do cyrkulatora wody. (VII) A 1/2' gruba taca z pleksiglasu ze wspornikami do pompki do zaciągania i uchwytem na pojemnik na popiół papierosowy. Ta maszyna, zgodnie z opisem, może być zastąpiona podobnymi dostępnymi na rynku maszynami do palenia, takimi jak te dostępne w systemach TSE (www.tse-systems.com).