Artykuł metodologiczny

Profilowanie polarnych glicerolipidów Arabidopsis thaliana za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) sprzężonej z chromatografią gazowo-cieczową (GLC)

37.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2518

⸱

18 marca 2011

 , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Michigan State University

W tym artykule

Podsumowanie

Skład ekstraktów lipidów polarnych oraz skład kwasów tłuszczowych poszczególnych gliceryolipidów są określane w prostym i niezawodnym eksperymencie profilowania lipidów. W tym celu gliceryolipidy są izolowane za pomocą chromatografii cienkowarstwowej, a następnie poddawane transmetylacji ich grup acylowych. Estry metylowe kwasów tłuszczowych są oznaczane ilościowo za pomocą chromatografii gazowo-cieczowej.

Streszczenie

Błony biologiczne oddzielają komórki od środowiska. Od pojedynczej komórki po wielokomórkowe rośliny i zwierzęta, glicerolipidy, takie jak fosfatydylocholina czy fosfatydyloetanoloamina, tworzą błony dwuwarstwowe, które pełnią funkcję zarówno granic, jak i interfejsów wymiany chemicznej między komórkami a ich otoczeniem. W przeciwieństwie do zwierząt, komórki roślinne posiadają specjalną organellę do fotosyntezy – chloroplast. Złożony system błon chloroplastu zawiera unikalne glicerolipidy, a mianowicie glikolipidy pozbawione fosforu: monogalaktosylodiacyloglicerol (MGDG), digalaktosylodiacyloglicerol (DGDG) oraz sulfokwinowosylodiacyloglicerol (SQDG)4. Role tych lipidów wykraczają poza funkcje czysto strukturalne. Glikolipidy te oraz inne glicerolipidy zostały zidentyfikowane w strukturach krystalicznych fotosystemu I i II, co wskazuje na udział glicerolipidów w procesie fotosyntezy8,11. Podczas niedoboru fosforanów, DGDG jest transportowany do błon pozaplastydialnych w celu zrekompensowania utraty fosfolipidów9,12.

Większość naszej wiedzy na temat biosyntezy i funkcji tych lipidów została uzyskana dzięki połączeniu badań genetycznych i biochemicznych z użyciem Arabidopsis thaliana14. Podczas tych badań niezbędna dla przesiewania i analizy mutantów lipidowych była prosta procedura analizy lipidów polarnych, która zostanie tutaj szczegółowo omówiona. Wyciąg lipidowy z liści jest najpierw rozdzielany za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (TLC), a glicerolipidy są barwione odwracalnie oparami jodu. Poszczególne lipidy są zeskrobane z płytek TLC i przekształcane w metyloestry kwasów tłuszczowych (FAMEs), które następnie analizuje się za pomocą chromatografii gazowo-cieczowej z detekcją płomieniowo-jonizacyjną (FID-GLC) (Rycina 1). Metoda ta okazała się niezawodnym narzędziem do przesiewania mutantów. Na przykład mutanty tgd1,2,3,4, zaburzone w transporcie lipidów z retikulum endoplazmatycznego do plastydów, zostały odkryte na podstawie akumulacji nieprawidłowego galaktoglicerolipidu: trigalaktosyldiacyloglicerolu (TGDG) oraz spadku względnej ilości grup acylowych 18:3 (węgle : wiązania podwójne) w lipidach błonowych 3,13,18,20. Metoda ta znajduje zastosowanie również w oznaczaniu aktywności enzymatycznej białek wykorzystujących lipidy jako substrat6.

Protokół

1. Ekstrakcja lipidów

  1. Ekstrakcję lipidów rozpocznij od zebrania 30 mg liści 4-tygodniowej Arabidopsis z roślin hodowanych na podłożu utwardzonym agarem lub w glebie, a następnie przenieś je do 1,5 mL polipropylenowych probówek reakcyjnych. Świeże liście można zamrozić błyskawicznie w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  2. Do każdej próbki dodaj 300 μL rozpuszczalnika do ekstrakcji składającego się z metanolu, chloroformu i kwasu mrówkowego (20:10:1, v/v/v). Wstrząsaj energicznie (używając wstrząsarki lakierniczej lub podobnej) przez 5 minut.
  3. Dodaj 150 μL 0,2 M kwasu fosforowego (H3PO4), 1 M chlorku potasu (KCl) i krótko wymieszaj w vortexie.
  4. Wiruj przy 13 000xg w temperaturze pokojowej przez 1 minutę. Lipidy rozpuszczone w dolnej fazie chloroformowej zostaną naniesione na płyty TLC.

2. Chromatografia cienkowarstwowa (TLC)15

  1. Aby przygotować płytki TLC, zanurz na 30 s płytkę TLC powleczoną żelem krzemionkowym o wymiarach 20 cm x 20 cm z paskiem do nakładania próbek w 0,15 M roztworze siarczanu amonu ((NH4)2SO4). Po 30 sekundach zanurzania susz płytkę przez co najmniej 2 dni w zamkniętym pojemniku. Podczas aktywacji sublimacja amoniaku pozostawia kwas siarkowy, który protonuje fosfatydyloglicerol, co jest niezbędne do jego oddzielenia od innych glicerylipidów.
  2. W dniu eksperymentu aktywuj płytki TLC, wypalając je w piekarniku w temperaturze 120 °C przez 2,5 godziny.
  3. Po ochłodzeniu aktywowanych płytek do temperatury pokojowej, narysuj ołówkiem prostą linię (1,5 cm od krawędzi płytki) w poprzek płytki w punkcie startowym chromatogramu.
  4. W dygestorium powoli nanieś 3 x 20 μL ekstraktu lipidowego z dolnej fazy chloroformowej, używając pipety 20 μL z żółtymi plastikowymi końcówkami 200 μL, pod słabym strumieniem N2. W tym celu do regulatora butli z N2 podłączono rurkę Tygon. Plamka powinna mieć średnicę mniejszą niż 1 cm. Każda płytka może pomieścić do 10 próbek (w przypadku planowania późniejszej analizy GLC).
  5. Podczas całkowitego wysychania plamek lipidowych w dygestorium, przygotuj rozwijający układ rozpuszczalników składający się z acetonu, toluenu i wody (91 mL: 30 mL: 7,5 mL). Wysoka względna wilgotność powietrza w otoczeniu może wpłynąć na rozdzielenie. W takim przypadku należy zmniejszyć ilość wody do proporcji (91 mL: 30 mL: 7,0 mL), aby uzyskać pożądane rozdzielenie.
  6. Wlej 80 mL rozpuszczalnika rozwijającego do szczelnej komory rozwijania TLC (D: W: S = 27,0: 26,5: 7,0 cm/cm/cm) i umieść płytkę w komorze końcem z próbkami skierowanym w dół. Zamknij komorę za pomocą zacisku. Rozpuszczalnik będzie przemieszczał się w górę płytki, a lipidy zostaną rozdzielone. Czas rozwijania wynosi około 50 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Gdy czoło rozpuszczalnika osiągnie odległość 1 cm od górnej krawędzi płytki, ostrożnie wyjmij płytkę z komory i całkowicie wysusz w dygestorium przez około 10 minut.
  8. Lipidy rozdzielone metodą TLC można barwić odwracalnie krótko jodem w celu analizy ilościowej lub nieodwracalnie kwasem siarkowym bądź α-naftolem.
    1. Wypalanie kwasem siarkowym: spryskaj płytkę 50% kwasem siarkowym w wodzie za pomocą szklanej butelki z atomizerem w dygestorium i wypalaj w temperaturze 120 °C przez 15 minut (Rycina 2A).
    2. Barwienie α-naftolem dla glikolipidów: spryskaj płytkę 2,4% (m/v) α-naftolem w 10% (v/v) kwasie siarkowym i 80% (v/v) etanolu i wypalaj w temperaturze 120 °C przez 3-5 minut, aż prążki glikolipidów zabarwią się na różowo lub fioletowo (Rycina 2B). Nadmierne traktowanie doprowadzi do zwęglenia wszystkich lipidów ze względu na obecność kwasu siarkowego w odczynniku.
    3. Barwienie jodem: w dygestorium umieść płytkę w zamkniętej komorze TLC z kryształkami jodu (w tacy na dnie, co prowadzi do nasycenia atmosfery oparami jodu, aż lipidy staną się widoczne). Nie wystawiaj płytki na działanie jodu zbyt długo, ponieważ może on kowalencyjnie modyfikować wielonienasycone kwasy tłuszczowe (Rycina 2C). Alternatywnie, aby uniknąć utleniania lipidów, należy barwić jedynie standardowe ścieżki przeplatane ścieżkami z próbkami, używając pipety Pasteura zatkanej watą szklaną z kryształkami jodu, przez którą przepływa N2 nad poszczególnymi ścieżkami standardów.

3. Reakcja otrzymywania metyloestrów tłuszczowych kwasów tłuszczowych (FAME)16

  1. Za pomocą żyletki usuń krzemionkę z obszarów wokół zidentyfikowanych plamek lipidowych na płytce TLC. Zeskrob krzemionkę zawierającą lipidy i za pomocą lejka przelej proszek do szklanej probówki z nakrętką wyłożoną teflonem (PTFE).
  2. Do każdej próbki dodać za pomocą pipety szklanej 1 ml 1 N kwasu solnego (HCl) w bezwodnym metanolu.
  3. Dodaj 100 μL 50 μg ml-1 kwas pentadekanowy (15:0) przy użyciu 200 μL do każdej próbki pipetować jako standard wewnętrzny za pomocą 200 μL pipetą z 200 μL żółty plastikowy końcówka. Jako próbę kontrolną należy zachować probówkę zawierającą wyłącznie kwas pentadecenowy w metanolowym roztworze HCl. Probówki szklane należy szczelnie zamknąć nakrętkami z wyściółką teflonową.
  4. Inkubować probówki szklane w 80 °C kąpiel wodna przez 25 minut. Probówki muszą być szczelnie zamknięte, aby zapobiec odparowywaniu rozpuszczalnika.
  5. Po ochłodzeniu probówek dodać 1 ml 0,9% chlorku sodu, a następnie 1 ml heksanu i intensywnie wymieszać na wirówce vortex. Próbki wirować z przyspieszeniem 1000xg przez 3 minuty.
  6. W dygestorium należy usunąć heksan/górną warstwę próbki za pomocą pipety Pasteura i przenieść ją do nowej szklanej probówki o wymiarach 13x100 mm.
  7. Odparować heksan w powolnym strumieniu N22 bez całkowitego wysuszania.
  8. Rozpuścić otrzymane metyloestry kwasów tłuszczowych w 60 μL heksan. Przenieść próbki do fiolek do autopróbniku i szczelnie zamknąć. Próbki można przechowywać w 4 °C dla krótkoterminowego i -20 °C przez kilka dni.

4. Chromatografia gazowo-cieczowa (GLC)10

  1. Przed rozpoczęciem GLC należy upewnić się, że butle z helem, wodorem i powietrzem są napełnione.
  2. Do zbiornika z rozpuszczalnikiem należy dodać odpowiednią ilość heksanu, a pojemnik na odpady musi być pusty. Do rozdziału metyloestrów kwasów tłuszczowych do urządzenia należy podłączyć kolumnę DB-23.
  3. Umieść fiolki w autosamplerze. Uruchom oprogramowanie Chemstation do GLC na komputerze systemowym.
  4. Ustaw temperaturę wlotu na 250 °C, przepływ helu na 48.6 mL min-1 i ciśnienie na 21.93 psi. Stosunek podziału (split ratio) wynosi 30.0: 1.
  5. Temperaturę termostatu ustaw początkowo na 140 °C na 2 min, a następnie podnieś do 160 °C z szybkością 25 °C min-1. Następnie ustaw wzrost temperatury od 160 °C do 250 °C z szybkością 8 °C min-1 i utrzymuj 250 °C przez 4 min, po czym obniż temperaturę do 140 °C z szybkością 38 °C min-1. Jeden pomiar trwa około 21 minut.
  6. Temperatura detektora zapłonowego (FID) wynosi 270 °C przy przepływie wodoru 30.0 mL min-1, przepływie powietrza 400 mL min-1 i przepływie helu 30.0 mL min-1.
  7. Wprowadź liczbę fiolek i nazwy próbek do tabeli sekwencji pomiarowej. Ustaw wstrzykiwacz 10 μL tak, aby wstrzyknął 2 μL próbki z każdej fiolki.
  8. Po przygotowaniu instrumentu uruchom sekwencję pomiarową.

5. Reprezentatywne wyniki:

Przykłady nieodwracalnego barwienia lipidów rozdzielonych metodą TLC z 4-tygodniowych siewek Arabidopsis przedstawiono na Rysunku 2. Lipidy zabarwione kwasem siarkowym (Rysunek 2A) ulegają zwęgleniu i pojawiają się jako brązowe plamy. Do barwienia glikolipidów, takich jak MGDG, DGDG, SQDG itp., zaleca się stosowanie α-naftolu. Glikolipidy zabarwione α-naftolem przyjmują kolor różowo-fioletowy, podczas gdy pozostałe lipidy polarne barwią się na żółto (Rysunek 2B). Barwienie jodem jest odwracalne i nadaje lipidom żółtawy kolor, który znika po krótkim czasie w miarę odparowywania jodu (Rysunek 2C). W skrócie, lipidy zabarwione jodem można poddać analizie GLC, choć aby ograniczyć rozkład lipidów, preferowane jest stosowanie lipidów niezabarwionych.

W przypadku pomyślnego przeprowadzenia procedury, po analizie GLC zaobserwowany zostanie charakterystyczny sygnał reprezentujący poszczególne estry metylowe kwasów tłuszczowych (Rysunek 3). Estry metylowe kwasów tłuszczowych o krótszym łańcuchu węglowym i mniejszej liczbie wiązań podwójnych wykazują krótszy czas retencji przy użyciu kolumny DB-23. Profilowanie estrów metylowych kwasów tłuszczowych jest czułym narzędziem do identyfikacji mutantów o zmienionym składzie lipidowym. Na Rysunku 4 widać, że molowy stosunek kwasów tłuszczowych MGDG18:3 jest zmniejszony u mutanta tgd4-1 w porównaniu do typu dzikiego18. Stosunek molowy każdego lipidu oblicza się, dzieląc liczbę moli estrów metylowych kwasów tłuszczowych dla jednej klasy lipidów przez sumę moli wszystkich klas lipidów. Na przykład, aby obliczyć stosunek molowy MGDG:

(MGDG) mol% = ∑ [FAMEs(MGDG)] / ∑ [FAMEs(total)] x100%

Można porównać wynikowe stosunki molowe każdej klasy lipidów dla typu dzikiego oraz mutanta. Na przykład mutant tgd4-1 wykazuje zwiększone względne ilości MGDG i PG, ale zmniejszone ilości DGDG i PE (Rycina 5)18.

Schemat ekstrakcji lipidów; metoda TLC; siewki Arabidopsis; reakcja FAME; proces analizy GLC.
Rysunek 1. Schemat analizy lipidów polarnych z wykorzystaniem siewek Arabidopsis. Lipidy całkowite są ekstrahowane z 4-tygodniowych siewek Arabidopsis i rozdzielane metodą TLC. Rozdzielone lipidy można zeskrobać z płytek TLC w celu przeprowadzenia transestryfikacji, a następnie analizy GLC.

Schemat chromatografii lipidów z MGDG, PG, DGDG dla analizy próbek i wyników rozdziału.
Rycina 2. Rozdział lipidów na płytkach TLC. Ekstrakty lipidowe z 35 mg (masy świeżej) siewek typu dzikiego są rozdzielane metodą TLC i barwione kwasem siarkowym (A), α-naftolem (B) lub oparami jodu (C). Dla każdej metody barwienia przedstawiono trzy powtórzenia. DGDG, digalaktozyldiacyloglicerol; MGDG, monogalaktozyldiacyloglicerol; PC, fosfatydylocholina; PE, fosfatydyloetanoloamina; PG, fosfatydyloglicerol; PI, fosfatydyloinozytol; SQDG, sulfochinowozyldiacyloglicerol.

Proces chromatografii; sygnał detektora w funkcji czasu retencji; analiza piku chromatogramu.
Rysunek 3. Analiza GLC estrów metylowych kwasów tłuszczowych (FAMEs) pochodzących z MGDG typu dzikiego. FAMEs są rozdzielane na kolumnie kapilarnej o długości 30 m i detekowane za pomocą detektora FID. Jako standard wewnętrzny zastosowano kwas pentadekanowy (15:0).

Wykres słupkowy składu kwasów tłuszczowych dla Col2, tgd4-1; porównanie danych, mol% 16:0-18:3, wyniki eksperymentu.
Rysunek 4. Profil kwasów tłuszczowych MGDG w typie dzikim Col2 (białe słupki) i mutancie tgd4-1 (czarne słupki). Kwasy tłuszczowe przedstawiono jako liczbę węgli, a następnie liczbę wiązań podwójnych. Przedstawiono średnią z trzech powtórzeń oraz odchylenia standardowe.

Wykres słupkowy składu lipidów przedstawiający mol% MGDG, PG, DGDG, SQDG, PE, PC w Col2 vs. tgd4-1.
Rycina 5. Skład lipidów polarnych typu dzikiego Col2 (białe słupki) oraz mutanta tgd4-1 (czarne słupki). Przedstawiono średnie z trzech powtórzeń, a odchylenia standardowe zaznaczono słupkami błędów.

Dyskusja

TLC sprzężone z GLC stanowi niezawodne i szybkie narzędzie do ilościowej analizy lipidów polarnych w roślinach. Pozwala na identyfikację niewielkich zmian w składzie lipidów; dlatego metoda ta była stosowana do wielkoskalowego przesiewania mutantów z zaburzeniami w szlakach metabolicznych lipidów polarnych1,20. Metoda ta jest również szeroko wykorzystywana do monitorowania aktywności enzymów wykorzystujących lipidy polarne jako substrat.2,6,7

Oprócz liści, w ten sam sposób można określić skład lipidowy innych tkanek roślinnych, takich jak korzenie i nasiona, lub frakcji subkomórkowych, takich jak chloroplasty i mitochondria.

Zastosowany tutaj układ rozpuszczalników (aceton, toluen, woda) jest zoptymalizowany pod kątem rozdziału glikolipidów i fosfolipidów w roślinach. Jednak w mutantach tgd1,2,3,4 oraz w izolowanych chloroplastach TGDG współeluje z PE, natomiast tetragalaktosylodiacyloglicerol współeluje z PC. W takim przypadku stosuje się układ rozpuszczalników składający się z chloroformu, metanolu, kwasu octowego i wody (85: 20: 10: 4, v/v/v/v)13. Czasami, w celu dokładniejszego rozdziału glikolipidów i fosfolipidów, wykonuje się dwuwymiarową TLC z użyciem dwóch różnych układów rozpuszczalników19. Ponadto tkanki roślinne można poddać bezpośrednio reakcji FAME, a następnie analizie GLC, aby określić całkowity profil kwasów tłuszczowych bez wstępnego rozdziału metodą TLC5. Oprócz zaprezentowanego systemu TLC-GLC, inną metodą wykorzystywaną do profilowania lipidów jest bezpośrednia tandemowa spektrometria mas z jonizacją przez rozpylanie elektryczne17. W tej metodzie pomija się wstępny rozdział chromatograficzny lipidów w ekstrakcie. Metoda ta wymaga jednak drogiej aparatury i doświadczonego personelu, co czyni ją mniej użyteczną w rutynowych analizach laboratoryjnych lub w badaniach przesiewowych mutantów.

Oświadczenia

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Niniejsza praca jest finansowana z grantu przyznanego Christophowi Benningowi przez amerykańską Narodową Fundację Nauki (US National Science Foundation).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
α-naftolSigma-AldrichN1000
Metanolowy HCl 3NSigma-Aldrich33050-URozcieńczyć do 1N metanolem
Płytki TLC Si250-PAJT Baker7003-04Z warstwą wstępnego absorbenta
Komora TLCSigma-AldrichZ266000
Probówki z nakrętkąVWR international53283-800
NakrętkiSun Sri13-425
Podkładka PTFESun Sri200 608
System GLCHewlett-PackardHP6890
Kolumna DB-23J&W Scientific122-2332
Fiolki do GLCSun Sri500 132
Zakrętki do fiolek GLCSun Sri201 828
Oprogramowanie ChemstationAgilent TechnologiesG2070AA

Bibliografia

  1. Ajjawi, I. Large-scale reverse genetics in Arabidopsis: case studies from the Chloroplast 2010 Project. Plant Physiol. 152, 529-529 (2010).
  2. Andersson, M. X., Kjellberg, J. M., Sandelius, A. S. The involvement of cytosolic lipases in converting phosphatidyl choline to substrate for galactolipid synthesis in the chloroplast envelope. Biochim. Biophys. Acta. 1684, 46-46 (2004).
  3. Awai, K. A phosphatidic acid-binding protein of the chloroplast inner envelope membrane involved in lipid trafficking. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, e10817-e10817 (2006).
  4. Benning, C. Mechanisms of lipid transport involved in organelle biogenesis in plant cells. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 25, 71-71 (2009).
  5. Browse, J., McCourt, P. J., Somerville, C. R. Fatty acid composition of leaf lipids determined after combined digestion and fatty acid methyl ester formation from fresh tissue. Anal. Biochem. 152, 141-141 (1986).
  6. Dormann, P., Balbo, I., Benning, C. Arabidopsis galactolipid biosynthesis and lipid trafficking mediated by DGD1. Science. 284, 2181-2181 (1999).
  7. Guskov, A. Cyanobacterial photosystem II at 2.9-A resolution and the role of quinones, lipids, channels and chloride. 16, 334-334 (2009).
  8. Hartel, H., Dormann, P., Benning, C. DGD1-independent biosynthesis of extraplastidic galactolipids after phosphate deprivation in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 10649-10649 (2000).
  9. James, A. T., MARTIN, A. J. Gas-liquid partition chromatography; the separation and micro-estimation of volatile fatty acids from formic acid to dodecanoic acid. Biochem. J. 50, 679-679 (1952).
  10. Jordan, P. Three-dimensional structure of cyanobacterial photosystem I at 2.5 A resolution. Nature. 411, 909-909 (2001).
  11. Kobayashi, K. Type-B monogalactosyldiacylglycerol synthases are involved in phosphate starvation-induced lipid remodeling, and are crucial for low-phosphate adaptation. Plant J. 57, 322-322 (2009).
  12. Lu, B. A small ATPase protein of Arabidopsis, TGD3, involved in chloroplast lipid import. J. Biol. Chem. 282, 35945-35945 (2007).
  13. Ohlrogge, J., Browse, J. Lipid biosynthesis. Plant Cell. 7, 957-957 (1995).
  14. Stahl, E. Thin-layer chromatography; methods, influencing factors and an example of its use. Pharmazie. 11, 633-633 (1956).
  15. Stoffel, W., INSULL, W., AHRENS, E. H. Gas-liquid chromatography of highly unsaturated fatty acid methyl esters. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 99, 238-238 (1958).
  16. Welti, R., Wang, X., Williams, T. D. Electrospray ionization tandem mass spectrometry scan modes for plant chloroplast lipids. Anal. Biochem. 314, 149-149 (2003).
  17. Xu, C. Lipid trafficking between the endoplasmic reticulum and the plastid in Arabidopsis requires the extraplastidic TGD4 protein. Plant Cell. 20, 2190-2190 (2008).
  18. Xu, C. Mutation of the TGD1 chloroplast envelope protein affects phosphatidate metabolism in Arabidopsis. Plant Cell. 17, 3094-3094 (2005).
  19. Xu, C. A permease-like protein involved in ER to thylakoid lipid transfer in Arabidopsis. EMBO J. 22, 2370-2370 (2003).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Profilowanie lipid w polarnychmetyloestry kwas w t uszczowychekstrakcja lipid waktywacja p ytek TLCbarwienie jodemanaliza glicerolipid wprzesiew mutant w
Profilowanie polarnych glicerolipidów Arabidopsis thaliana za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) sprzężonej z chromatografią gazowo-cieczową (GLC)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.