Podskórna infekcja groncem złocistym opornym na metycylinę (MRSA)

Podsumowanie

Model infekcji skóry i tkanek miękkich u myszy jest wykorzystywany do oceny funkcji wirulencji gronkowca złocistego opornego na metycylinę (MRSA) oraz odpowiedzi immunologicznych gospodarza. W niniejszym materiale przedstawiamy model infekcji podskórnej w przebiegu zakażenia skóry i tkanek miękkich.

Streszczenie

MRSA stanowi globalne zagrożenie dla zdrowia publicznego, a infekcje skóry i tkanek miękkich wywołane przez MRSA odpowiadają obecnie za ponad połowę wszystkich infekcji tkanek miękkich w Stanach Zjednoczonych. Wśród zakażeń tkanek miękkich coraz częściej zgłasza się przypadki zapalenia mięśni, ropnego zapalenia mięśni oraz martwiczo zapalającego zapalenia powięzi powiązanych z MRSA pochodzącym ze środowiska pozyszpitalnego. Aby zrozumieć interakcję między MRSA a odpornością gospodarza prowadzącą do cięższego przebiegu zakażenia, kluczowa jest dostępność modeli zwierzęcych, umożliwiających badanie czynników gospodarza i bakterii. Wprowadzono kilka modeli zakażeń w celu oceny patogenezy S. aureus podczas powierzchownych infekcji skóry. W niniejszej pracy opisujemy model zakażenia podskórnego, który pozwala na badanie patologii skóry, tkanki podskórnej oraz mięśni.

Protokół

1. Przygotowanie szczepu MRSA do zakażenia (na dwa dni przed zakażeniem)

1. Zaszczep pętlą kolonie MRSA z kultury stokowej na płytkę z agarem krwi (agar Trypticase Soy Agar (TSA)).
2. Sprawdź fenotyp hemolizy (przejaśnienie wokół każdej kolonii) na płytce z agarem krwi.
3. Wybierz kolonię o fenotypie hemolitycznym zgodnym z innymi eksperymentami.
4. Zaszczep wybraną kolonię do 3 mL bulionu Todd-Hewitt (THB), z dodatkiem odpowiedniego antybiotyku w razie potrzeby, w probówce z zakrętką typu snap o pojemności 15 mL.
5. Inkubuj w temperaturze 37°C przez noc z wytrząsaniem przy 220 rpm.

2. Przygotowanie myszy do infekcji (na jeden dzień przed infekcją)

1. W zależności od wielkości myszy, ogolić futro z obszaru o wymiarach 3 x 4 cm na grzbiecie zwierząt.
2. Nanieść ~5 mm³ kremu do depilacji (zakupionego w lokalnej aptece) na ogolony obszar.
3. Pozostawić krem do depilacji na powierzchni skóry na około 1 min.
4. Zmoczyć ręczniki papierowe w ddH₂O.
5. Usunąć krem do depilacji za pomocą mokrego ręcznika papierowego.

3. Przygotowanie MRSA do infekcji (w dniu infekcji)

1. Rozcieńczyć nocną kulturę bakteryjną w stosunku od 1:500 do 1:1000, dodając 10 mL uprzednio ogrzanego THB do probówki z nakrętką o pojemności 50 mL.
2. Inkubować w temperaturze 37°C przez około 2,5 godziny przy wytrząsaniu z prędkością 220 rpm, aż A₅₄₀ osiągnie wartość 2,5.
3. zebrać MRSA poprzez wirowanie przy 3,225 x g przez 10 min w temperaturze 4°C.
4. Odlać nadsącz.
5. Resuspendować osad bakteryjny w 10 mL soli fizjologicznej z buforem fosforanowym Dulbecco (DPBS).
6. Powtórzyć kroki 3 i 4.
7. Resuspendować osad bakteryjny w DPBS do pożądanego stężenia.
8. Wykonać rozcieńczenia seryjne zawiesiny bakteryjnej od 10¹ do 10⁸.
9. Wysiać rozcieńczoną zawiesinę bakteryjną na płytki z agarem krwawym.
10. Inkubować płytki w temperaturze 37°C przez noc.
11. Zaobserwować i odnotować fenotyp hemolityczny inokulum.
12. Policzyć liczbę jednostek tworzących kolonie (CFU) na płytce.
13. Obliczyć miano inokulum na podstawie liczby CFU na płytce.

4. Podskórna infekcja MRSA (w dniu infekcji oraz 3 dni po infekcji)

1. Wstrzyknąć podskórnie 100 μL zawiesiny bakteryjnej w ogolonym obszarze.
2. Obserwować zwierzęta przez okres od 3 do 5 godzin po wstrzyknięciu, aby upewnić się, że myszy żyją.
3. Codziennie obserwować zmiany na grzbiecie zwierząt i w razie potrzeby codziennie zapisywać wielkość zmiany. Obserwacja zmian powinna obejmować zapisywanie ich rozmiaru i morfologii. Zmiany skórne oraz mięśniowe są ilościowo określane poprzez pomnożenie długości i szerokości zmiany. Zmiany o nieregularnym kształcie należy podzielić na mniejsze, symetryczne części, a każdą z nich zmierzyć tą samą metodą. Do pomiarów zmian można również wykorzystać program wspomaganej komputerowo oceny histomorfometrycznej (ImageJ; dostępne z otwartym kodem źródłowym z NIH pod adresem http://rsb.info.nih.gov/ij/) ².
4. Uśmiercić zwierzęta w 3. dobie po zakażeniu poprzez inhalację isofluranem, a następnie zwichnięcie kręgów szyjnych.
5. Zaobserwować i odnotować zmianę na skórze.
6. Naciąć skórę sterylnymi nożyczkami.
7. Ostrożnie zdjąć skórę, a następnie zaobserwować i odnotować zmianę w mięśniu.
8. Wyciąć zmianę wraz z około 2 - 5 mm otaczającego obszaru.
9. Pobrać śledzionę i nerki.
10. Zhomogenizować tkanki za pomocą homogenizatora tkankowego lub poprzez wielokrotne przykładanie tłoka z strzykawki 1 mL do probówki do wirówki zawierającej tkankę i 100 μL DPBS.
11. Dodać 900 μL DPBS do każdej probówki.
12. Mieszać próbki na wortexie przez 5 min.
13. Przygotować rozcieńczenia seryjne zawiesiny w DPBS od 10¹ do 10⁶.
14. Wysiać rozcieńczone zawiesiny na płytki THA.

5. Reprezentatywne wyniki:

1. Bezpośrednio po każdym wstrzyknięciu podskórnym, w przypadku prawidłowego przeprowadzenia infekcji, na powierzchni skóry powinien pojawić się pęcherzyk (Rycina 1A). Brak pęcherzyka na powierzchni skóry może oznaczać, że wstrzyknięcie było zbyt głębokie, co może wpłynąć na wynik infekcji (wielkość zmiany, CFU).
2. Zawiesina bakteryjna musi zostać poddana rozcieńczeniom seryjnym, a liczba CFU musi zostać sprawdzona na płytkach z agarem krwi dla każdego eksperymentu. Krok ten dostarczy istotnych informacji: 1) czy inokulum wykazuje jednorodny fenotyp; 2) dokładna liczba żywych bakterii użytych do infekcji.
3. Zmiany oraz przeżywalność bakterii można oceniać w różnych punktach czasowych po infekcji. W niniejszym przypadku analizowano infekcję w 3. dniu po zakażeniu. Wielkość zmian analizowano na powierzchni skóry (Rycina 1B: 1x 10⁹; Rycina 1D: 1 x 10⁷ CFU) oraz na powierzchni mięśnia (Rycina 1C: 1x 10⁹; Rycina 1E: 1 x 10⁷ CFU). W celu oceny uszkodzeń tkanki można zmierzyć pole powierzchni zmiany, obliczając je jako iloczyn długości (mm) i szerokości (mm) (Ryc. 2 A i B). Wynik ten może pomóc w określeniu zakresu uszkodzeń tkanki wywołanych przez dany czynnik wirulencji. Dodatkowo zmiany są wycinane, homogenizowane w DPBS, a następnie wysiewane w celu ilościowego oznaczenia liczby CFU (Rycina 2C), co wskazuje na żywotność bakterii w miejscu infekcji.

Rycina 1. Zmiany skórne i mięśniowe. Myszy CD1 poddano podskórnej inokulacji MRSA (LAC) w jednym z boków. Zdjęcia wykonano w czasie 0 oraz w 3. dniu po infekcji. (A) Czas 0 po infekcji (p.i.), (B)-(G) 3. dzień p.i.; B, D i F: zmiany skórne; C, E i G: zmiany mięśniowe; B i C: zakażone 1x 10⁹ CFU; D i E: zakażone 1x 10⁷ CFU; F i G: grupa kontrolna.

Rysunek 2. Wielkość zmian skórnych i liczba żywych bakterii w miejscu zakażenia w 3. dobie po zakażeniu. Zmiany skórne i mięśniowe u myszy CD1 zakażonych MRSA (LAC). (A) Wielkość zmiany skórnej. (B) Wielkość zmiany mięśniowej. (C) Całkowita liczba CFU w tkance. H: inokulum 1 x 10⁹ CFU; L: inokulum 1 x 10⁷ CFU. *: p < 0.05, test Mann-Whitneya.

Dyskusja

1. Myszowy model infekcji skóry i tkanek miękkich jest potężnym narzędziem do oceny wirulencji patogenu in vivo. Patogenność S. aureus w infekcjach skóry i tkanek miękkich może się różnić w zależności od szeregu parametrów. Obejmują one wielkość inokulum, fazę wzrostu bakterii, głębokość inokulacji, wiek myszy oraz tło genetyczne myszy ^{7, 8}. Podczas badania funkcji wirulencji z wykorzystaniem tego modelu kluczowe jest kontrolowanie tych parametrów, aby zapewnić spójność wyników. Badaliśmy infekcję skóry MRSA ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
THB	VWR international	95025-314
DPBS	Invitrogen	21-031-CV
Strzykawka 1 ml	BD Biosciences	309602
Igła 27G1/2	BD Biosciences	305109
Agar z krwią owczą (TSA)	VWR international	90004-328