Gromadzenie zbiorów danych izotermicznej kalorymetrii miareczkowej o zmiennym stężeniu w celu określenia mechanizmów wiązania

Podsumowanie

ITC jest potężnym narzędziem do badania wiązania liganda z jego gospodarzem. Jednak w układach złożonych kilka modeli może równie dobrze dopasowywać się do danych. Metoda opisana w niniejszej pracy umożliwia wyjaśnienie odpowiedniego modelu wiązania dla układów złożonych oraz wyznaczenie odpowiadających im parametrów termodynamicznych.

Streszczenie

Izotermiczna kalorymetria miareczkowa (ITC) jest powszechnie stosowana do wyznaczania parametrów termodynamicznych związanych z wiązaniem ligandu z makromolekułą gospodarza. ITC posiada pewne zalety w stosunku do powszechnych metod spektroskopowych stosowanych do badania oddziaływań gospodarz-ligand. Na przykład ciepło wydzielane lub pochłaniane podczas oddziaływania dwóch komponentów jest mierzone bezpośrednio i nie wymaga zastosowania żadnych zewnętrznych reporterów. W związku z tym entalpia wiązania oraz stała asocjacji (Ka) są uzyskiwane bezpośrednio z danych ITC i mogą być wykorzystane do obliczenia wkładu entropowego. Co więcej, kształt izotermy zależy od wartości c oraz zastosowanego modelu mechanistycznego. Wartość c definiuje się jako c = n[P]tKa, gdzie [P]t oznacza stężenie białka, a n liczbę miejsc wiązania ligandu w gospodarzu. W wielu przypadkach wiele miejsc wiązania danego ligandu nie jest równoważnych, a ITC pozwala na charakterystykę termodynamicznych parametrów wiązania dla każdego pojedynczego miejsca wiązania. Wymaga to jednak zastosowania poprawnego modelu wiązania. Wybór ten może być problematyczny, jeśli różne modele mogą dopasować te same dane eksperymentalne. Wykazaliśmy wcześniej, że problem ten można obejść, przeprowadzając eksperymenty przy kilku wartościach c. Uzyskane izotermy dla różnych wartości c są dopasowywane jednocześnie do oddzielnych modeli. Następnie poprawny model jest identyfikowany na podstawie jakości dopasowania w całym zbiorze danych o zmiennej wartości c. Proces ten zastosowano tutaj do enzymu wywołującego oporność na aminoglikozydy, aminoglikozydowej N-6'-acetylotransferazy-II (AAC(6')-II). Chociaż nasza metodologia jest możliwa do zastosowania w każdym układzie, konieczność stosowania tej strategii jest lepiej widoczna w układzie makromolekuła-ligand wykazującym allosterię lub kooperatywność, a także wtedy, gdy różne modele wiązania dają w zasadzie identyczne dopasowania do tych samych danych. Z naszej wiedzy takie układy nie są dostępne w sprzedaży. AAC(6')-II jest homodimerem zawierającym dwa miejsca aktywne, wykazującym kooperatywność między dwiema podjednostkami. Jednak dane ITC uzyskane przy pojedynczej wartości c można równie dobrze dopasować do co najmniej dwóch różnych modeli: niezależnego modelu dwóch zestawów miejsc (two-sets-of-sites independent model) oraz sekwencyjnego (kooperatywnego) modelu dwóch miejsc (two-site sequential model). Poprzez zmianę wartości c, zgodnie z powyższym opisem, ustalono, że poprawnym modelem wiązania dla AAC(6')-II jest sekwencyjny model wiązania dwóch miejsc. W niniejszej pracy opisujemy kroki, które należy podjąć podczas przeprowadzania eksperymentów ITC, aby uzyskać zbiory danych odpowiednie do analiz zmiennej wartości c.

Protokół

1. Przygotowanie roztworów zapasowych

1. Oczyść interesującą makrocząsteczkę. (W tym przypadku aminoglikozydową N-6'-acetylotransferazę-Ii (AAC6'-Ii) wyizolowano zgodnie z opisem zamieszczonym w innym opracowaniu.¹³)
2. Przygotuj 4 litry buforu do dializy. (W tym przypadku zastosowano 25 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES, MW 238,3 g/mol), zawierającego 2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA, MW 292,2), o pH 7,5.)
3. Przeprowadź dializę białka. Próbkę AAC(6')-Ii (5 mL o stężeniu 400 μM) należy poddać dializie w buforze do dializy (3 x 1,3 L). Końcowy roztwór do dializy należy zachować do przepłukania urządzenia oraz do rozcieńczania próbek.
4. Przefiltruj końcowy roztwór do dializy przez filtr celulozowy 0,45 μm i przechowuj w temperaturze 4°C. Będzie on dalej określany jako „bufor roboczy”.
5. Przefiltruj roztwór białka przez filtr strzykawkowy 0,2 μm, który został uprzednio dokładnie przepłukany buforem roboczym. Zmierz końcowe stężenie białka, stosując standardowy test (Bradforda, Lowry'ego itp.) lub pomiar absorbancji UV. Przechowuj białko w sposób zapewniający maksymalną stabilność długoterminową. (W przypadku AAC(6')-Ii oznacza to przechowywanie w 4°C. AAC(6')-Ii traci aktywność po zamrożeniu i rozmrożeniu).
6. Przygotuj 200 μL 25 mM roztworu stokowego acetylokoenzymu A (AcCoA, ligand, MW 809,57), rozpuszczając 4,0 mg w buforze roboczym. Zamroź w temperaturze -78°C do momentu użycia.
7. Wszystkie próbki białka i ligandu muszą pochodzić z tych samych roztworów stokowych, aby zminimalizować przypadkowe wahania stężenia między próbkami. W analizie stosowany jest pojedynczy współczynnik korekcyjny dla stężenia białka w całym zbiorze danych variable-c.¹⁰

2. Przygotowywanie próbek do ITC

1. Rozcieńcz roztwór enzymu do wartości c równej 64, tak aby objętość końcowa wynosiła 2 mL. (W przypadku AAC(6')-Ii odpowiada to stężeniu 192 μM).
2. Szybko rozmroź roztwór zapasowy ligandu (AcCoA) w wodzie z lodem.
3. Przygotuj 0,5 mL roztworu AcCoA o stężeniu 10-krotnie wyższym niż liczba miejsc wiążących w białku, w tym przypadku 4 mM, rozcieńczając 80 μL roztworu zapasowego AcCoA w 420 μL buforu roboczego. Przenieś go do probówki do napełniania pipety. Szybko przenieś roztwór zapasowy AcCoA z powrotem do temperatury -78°C.
4. Odgazuj białko i roztwory w próżni przez 5 min w temperaturze o 1°C niższej od zamierzonej temperatury roboczej (19 °C).

3. Przygotowanie strzykawki¹⁴

1. Wsuń strzykawkę do iniekcji przez uchwyt strzykawki, aż zamocowany wcześniej zacisk strzykawki znajdzie się na tej samej wysokości co uchwyt.
2. Nasuń drugi zacisk strzykawki na strzykawkę do iniekcji, aż zostanie on mocno dociśnięty do podstawy uchwytu strzykawki. Delikatnie dokręć zacisk za pomocą dołączonego klucza imbusowego 0.050" Ball Point Hex Drive.
3. Umieść uchwyt strzykawki w uchwycie pipety.
4. Ostrożnie wsuń wstrzykiwacz pipety do strzykawki do iniekcji. Upewnij się, że końcówka tłoka została wprowadzona bezpośrednio do otworu strzykawki. Po całkowitym wsunięciu przykręć pierścień blokujący uchwytu strzykawki do wstrzykiwacza pipety.

4. Załadunek celi z próbką¹⁴

1. Przemyj celę pomiarową co najmniej 50 mL buforu do elektroforezy, a następnie usuń pozostałą ciecz za pomocą szklanej strzykawki o pojemności 2,5 ml z długą igłą.
2. Powoli pobierz do czystej i suchej strzykawki 2,5 ml z długą igłą co najmniej 1,8 ml roztworu próbki białka. Należy uważać, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.
3. Ostrożnie wprowadź igłę do celi pomiarowej i delikatnie dotknij jej dna. Podnieś końcówkę nieco (~1 mm) i delikatnie wstrzyknij roztwór AAC(6')-Ii do celi, aż nad górną krawędzią celi pomiarowej pojawi się nadmiar cieczy.
4. Powoli podnieś igłę o około 1 cm, upewniając się, że ciecz pozostaje w przelewie. Szybko wciągnij i wstrzyknij niewielką ilość roztworu (~0,25 ml), aby usunąć ewentualne pęcherzyki powietrza uwięzione w celi pomiarowej.
5. Usuń cały nadmiar roztworu z przelewu. Można to osiągnąć, delikatnie przesuwając igłę wzdłuż krawędzi przelewu do wnętrza celi pomiarowej. Końcówka strzykawki napotka krawędź, co wyznacza pożądaną wysokość roztworu roboczego. Usuń całą ciecz znajdującą się powyżej tej linii.

5. Napełnianie strzykawki iniekcyjnej i uruchomienie analizy¹⁴

1. Przymocuj plastikową strzykawkę do załadunku do otworu napełniającego.
2. Opuść końcówkę tłoka do górnej krawędzi otworu napełniającego.
3. Umieść roztwór AcCoA w rurce do napełniania pipety w dolnej części uchwytu pipety. Końcówka strzykawki nie powinna dotykać dna rurki napełniającej.
4. Powoli pobierz roztwór do strzykawki, aż niewielka ilość cieczy dostanie się do rurki strzykawki do załadunku.
5. Zamknij otwór napełniający, opuszczając końcówkę tłoka, i kliknij przycisk Close Fill Port. Aby usunąć pęcherzyki powietrza, które mogły powstać podczas załadunku, wykonaj procedurę odpowietrzania i ponownego napełnienia, klikając przycisk Purge->Refill 3 razy.
6. Wyjmij rurkę napełniającą z uchwytu pipety i delikatnie przetrzyj końcówkę strzykawki.
7. Chwyć zespół pipety i ostrożnie wprowadź strzykawkę do celi próbkowej. Postępuj powoli, ponieważ strzykawka może się łatwo wygiąć, dlatego wymagana jest szczególna ostrożność. Upewnij się, że strzykawka jest całkowicie włożona, dociskając podstawę pierścienia blokującego.
8. Ustaw żądaną temperaturę pomiaru (w tym przypadku 20°C) i wybierz moc referencyjną nieco wyższą niż maksymalny oczekiwany przepływ ciepła podczas wstrzyknięcia (w tym przypadku 20μcal/sec).
9. Zaprogramuj żądane objętości wstrzykiwania i opóźnienia. (W tym przypadku zastosowano 28 wstrzyknięć. Pierwsze wstrzyknięcie miało objętość 2 μL z opóźnieniem 60 s. Wszystkie kolejne wstrzyknięcia miały objętość 10 μL z opóźnieniami 330 s).

6. Kolejne uruchomienia

1. W kolejnych próbach powtórz kroki 2-5, zmniejszając stężenia AAC(6')-Ii i AcCoA odpowiednio 2, 4, 8, 16 i 32-krotnie.

7. Analiza danych

1. Należy zastosować procedurę dopasowania, która globalnie dopasowuje wszystkie izotermy do jednego zestawu parametrów wiązania, zgodnie z wcześniejszym opisem¹⁰.

8. Reprezentatywne wyniki

Reprezentatywne dane przedstawiono na Rysunku 1. Kształt izoterm powinien zmieniać się wraz z koncentracją. Bardziej gwałtownych przejść należy spodziewać się dla wyższych wartości c (tj. wyższych stężeń białka i liganda) (Rysunek 2).

W przypadku AAC(6')-Ii model sekwencyjny dwumiejscowy zapewnia lepsze dopasowanie niż model opisujący dwa zestawy identycznych, niezależnych miejsc o regulowanej stechiometrii.

Rycina 1. Izotermy otrzymane w wyniku miareczkowania AcCoA (3.86 mM) do AAC(6')-Ii (192 μM). A) Surowy zapis ITC. B) Zintegrowane wartości wykorzystane do wyznaczenia parametrów wiązania (kwadraty) z dopasowaniem sekwencyjnym dla 2 miejsc (-).

Rycina 2. Izotermy ITC dla AcCoA miareczkowanego do AAC(6')-Ii przy różnych stężeniach. Dane eksperymentalne (otwarte kółka) dopasowano do modelu niezależnego z 2 zestawami miejsc (przerywana linia purpurowa) oraz sekwencyjnego modelu 2 miejsc (linia ciągła niebieska). Model sekwencyjny 2 miejsc wykazuje wyraźnie lepszą zgodność ogólną. Zastosowane stężenia dla AAC(6')-Ii i AcCoA wynosiły odpowiednio: A) 6 μM, 0,25 mM, B) 12 μM, 0,25 mM, C) 24 μM, 0,5 mM, D) 48 μM, 1,0 mM, E) 96 μM, 1,9 mM oraz F) 196 μM, 3,86 mM.

Dyskusja

Ta analityczna część dopasowania zmiennego-c została wcześniej szczegółowo opisana¹⁰. W niniejszym opracowaniu przedstawiamy praktyczne aspekty gromadzenia zbiorów danych zmiennego-c odpowiednich dla tego podejścia. Niezbędne jest, aby wszystkie próbki białka i ligandu pobierano z tych samych roztworów stokowych. Dlatego ważne jest, aby początkowo przygotować wystarczającą ilość roztworu stokowego do przeprowadzenia całej serii eksperymentów. Zapewnia to stały stosunek AAC(6')-Ii do AcCoA we wszystkich doświad...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Acetylcholina–Enzym A (AcCoA)	Sigma-Aldrich	A2056
kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES)	Fisher Scientific	7365-45-9
kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)	Sigma-Aldrich	431788
Rurki do dializy Spectra/Por 2	Spectrum Labs	132678
Sterylny filtr strzykawkowy (0,2 μm)	VWR international	281445-477
filtry membranowe z azotanu celulozy (0,45 μm)	Whatman, GE Healthcare	7184-004
VP-ITC	MicroCal	VP-ITC	Mikrokalorymetr użyty do pomiarów
ThermoVac	MicroCal	USB Thermo Vac	Stacja odgazowywania z kontrolą temperatury