Gromadzenie zbiorów danych izotermicznej kalorymetrii miareczkowej o zmiennym stężeniu w celu określenia mechanizmów wiązania

Podsumowanie

ITC jest potężnym narzędziem do badania wiązania liganda z jego gospodarzem. Jednak w układach złożonych kilka modeli może równie dobrze dopasowywać się do danych. Metoda opisana w niniejszej pracy umożliwia wyjaśnienie odpowiedniego modelu wiązania dla układów złożonych oraz wyznaczenie odpowiadających im parametrów termodynamicznych.

Streszczenie

Izotermiczna kalorymetria miareczkowa (ITC) jest powszechnie stosowana do wyznaczania parametrów termodynamicznych związanych z wiązaniem ligandu z makromolekułą gospodarza. ITC posiada pewne zalety w stosunku do powszechnych metod spektroskopowych stosowanych do badania oddziaływań gospodarz-ligand. Na przykład ciepło wydzielane lub pochłaniane podczas oddziaływania dwóch komponentów jest mierzone bezpośrednio i nie wymaga zastosowania żadnych zewnętrznych reporterów. W związku z tym entalpia wiązania oraz stała asocjacji (Ka) są uzyskiwane bezpośrednio z danych ITC i mogą być wykorzystane do obliczenia wkładu entropowego. Co więcej, kształt izotermy zależy od wartości c oraz zastosowanego modelu mechanistycznego. Wartość c definiuje się jako c = n[P]tKa, gdzie [P]t oznacza stężenie białka, a n liczbę miejsc wiązania ligandu w gospodarzu. W wielu przypadkach wiele miejsc wiązania danego ligandu nie jest równoważnych, a ITC pozwala na charakterystykę termodynamicznych parametrów wiązania dla każdego pojedynczego miejsca wiązania. Wymaga to jednak zastosowania poprawnego modelu wiązania. Wybór ten może być problematyczny, jeśli różne modele mogą dopasować te same dane eksperymentalne. Wykazaliśmy wcześniej, że problem ten można obejść, przeprowadzając eksperymenty przy kilku wartościach c. Uzyskane izotermy dla różnych wartości c są dopasowywane jednocześnie do oddzielnych modeli. Następnie poprawny model jest identyfikowany na podstawie jakości dopasowania w całym zbiorze danych o zmiennej wartości c. Proces ten zastosowano tutaj do enzymu wywołującego oporność na aminoglikozydy, aminoglikozydowej N-6'-acetylotransferazy-II (AAC(6')-II). Chociaż nasza metodologia jest możliwa do zastosowania w każdym układzie, konieczność stosowania tej strategii jest lepiej widoczna w układzie makromolekuła-ligand wykazującym allosterię lub kooperatywność, a także wtedy, gdy różne modele wiązania dają w zasadzie identyczne dopasowania do tych samych danych. Z naszej wiedzy takie układy nie są dostępne w sprzedaży. AAC(6')-II jest homodimerem zawierającym dwa miejsca aktywne, wykazującym kooperatywność między dwiema podjednostkami. Jednak dane ITC uzyskane przy pojedynczej wartości c można równie dobrze dopasować do co najmniej dwóch różnych modeli: niezależnego modelu dwóch zestawów miejsc (two-sets-of-sites independent model) oraz sekwencyjnego (kooperatywnego) modelu dwóch miejsc (two-site sequential model). Poprzez zmianę wartości c, zgodnie z powyższym opisem, ustalono, że poprawnym modelem wiązania dla AAC(6')-II jest sekwencyjny model wiązania dwóch miejsc. W niniejszej pracy opisujemy kroki, które należy podjąć podczas przeprowadzania eksperymentów ITC, aby uzyskać zbiory danych odpowiednie do analiz zmiennej wartości c.

Protokół

1. Przygotowanie roztworów zapasowych

1. Oczyszczono badaną makrocząsteczkę. (W tym przypadku aminoglikozydową N-6'-acetylotransferazę-Ii (AAC6'-Ii), wyizolowaną zgodnie z opisem zamieszczonym w innym opracowaniu.¹³)
2. Przygotowano 4 litry buforu do dializy. (W tym przypadku zastosowano 25 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES, MW 238.3 g/mol), zawierającego 2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA, MW 292.2), o pH 7.5.)
3. Przeprowadzono dializę białka. Próbkę AAC(6')-Ii (5 mL o stężeniu 400 μM) należy poddać dializie w buforze do dializy (3 x 1.3 L). Ostatnią porcję roztworu do dializy zachowano do przepłukania urządzenia i rozcieńczania próbek.
4. Końcowy roztwór do dializy przefiltrowano przez filtr celulozowy 0.45 μm i przechowywano w temperaturze 4°C. Będzie on określany jako „bufor roboczy”.
5. Roztwór białka przefiltrowano przez filtr strzykawkowy 0.2 μm, uprzednio dokładnie przepłukany buforem roboczym. Ostateczne stężenie białka zmierzono za pomocą standardowego testu (Bradford, Lowry itp.) lub absorbancji UV. Białko przechowywano w sposób maksymalizujący jego długoterminową stabilność. (W przypadku AAC(6')-Ii oznacza to przechowywanie w 4°C; AAC(6')-Ii traci aktywność po zamrożeniu i rozmrożeniu).
6. Przygotowano 200 μL roztworu stokowego acetylokoenzymu A (AcCoA, ligand, MW 809.57) o stężeniu 25 mM poprzez rozpuszczenie 4.0 mg w buforze roboczym. Roztwór zamrożono w temperaturze -78°C do momentu użycia.
7. Wszystkie próbki białka i ligandu muszą pochodzić z tych samych roztworów stokowych, aby zminimalizować przypadkowe wahania stężenia między próbkami. W analizie zastosowano jeden wspólny współczynnik korekcji stężenia białka dla całego zestawu danych o zmiennym stężeniu (variable-c).¹⁰

2. Przygotowanie próbek do ITC

1. Rozcieńczyć roztwór enzymu do wartości c równej 64, tak aby objętość końcowa wynosiła 2 mL. (W przypadku AAC(6')-Ii odpowiada to stężeniu 192 μM).
2. Szybko rozmrozić roztwór zapasowy ligandu (AcCoA) w wodzie z lodem.
3. Przygotować 0,5 mL roztworu AcCoA o stężeniu 10-krotnie wyższym niż liczba miejsc wiążących na białku, w tym przypadku 4 mM, poprzez rozcieńczenie 80 μL roztworu zapasowego AcCoA w 420 μL buforu roboczego. Przenieść do probówki do napełniania pipety. Szybko przenieść roztwór zapasowy AcCoA z powrotem do temperatury -78°C.
4. Odgazować białko i roztwory w próżni przez 5 min w temperaturze o 1°C niższej od pożądanej temperatury roboczej (19 °C).

3. Przygotowanie strzykawki¹⁴

1. Wsuń strzykawkę wstrzykującą przez uchwyt strzykawki, aż zamontowany wcześniej zacisk strzykawki znajdzie się na tej samej wysokości co uchwyt.
2. Nasuń drugi zacisk strzykawki na strzykawkę wstrzykującą, aż zostanie on mocno dociśnięty do podstawy uchwytu strzykawki. Delikatnie dokręć zacisk za pomocą dołączonego klucza imbusowego 0.050" Ball Point.
3. Umieść uchwyt strzykawki w uchwycie pipety.
4. Delikatnie wsuń wtryskiwacz pipety do strzykawki wstrzykującej. Upewnij się, że końcówka tłoka została wprowadzona bezpośrednio do otworu strzykawki. Po pełnym wsunięciu wkręć pierścień blokujący uchwytu strzykawki we wtryskiwacz pipety.

4. Napełnianie kuwety z próbką¹⁴

1. Przemyć kuwetę z próbką minimum 50 mL buforu do elektroforezy i usunąć pozostałą ciecz za pomocą szklanej strzykawki o pojemności 2,5 ml z długą igłą.
2. Powoli nabrać minimum 1,8 ml roztworu próbki białka do czystej i suchej strzykawki 2,5 ml z długą igłą. Należy uważać, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.
3. Ostrożnie wprowadzić igłę do kuwety i delikatnie dotknąć jej dna. Nieznacznie unieść końcówkę (~1 mm) i powoli wstrzyknąć roztwór AAC(6')-Ii do kuwety, aż nad jej górną krawędzią pojawi się nadmiar cieczy.
4. Powoli unieść igłę o około 1 cm, upewniając się, że ciecz nadal znajduje się w części przelewowej. Szybko odessać i ponownie wstrzyknąć niewielką ilość roztworu (~0,25 ml), aby usunąć ewentualne pęcherzyki powietrza uwięzione w kuwecie.
5. Usunąć cały nadmiar roztworu. W tym celu należy delikatnie przesunąć igłę wzdłuż ścianki przelewu w głąb kuwety. Końcówka strzykawki napotka krawędź, która wyznacza pożądany poziom roztworu roboczego. Usunąć całą ciecz znajdującą się powyżej tej linii.

5. Napełnianie strzykawki wstrzykiвающей i rozpoczęcie analizy¹⁴

1. Zamocuj plastikową strzykawkę do załadunku w porcie napełniającym.
2. Obniż końcówkę tłoka do górnej krawędzi portu napełniającego.
3. Umieść roztwór AcCoA w rurce napełniającej pipety na dnie uchwytu do pipet. Końcówka strzykawki nie powinna dotykać dna rurki napełniającej.
4. Powoli pobierz roztwór do strzykawki, aż niewielka ilość cieczy dostanie się do rurki strzykawki do załadunku.
5. Zamknij port napełniający, obniżając końcówkę tłoka, a następnie kliknij przycisk Close Fill Port. W celu usunięcia pęcherzyków powietrza, które mogły zostać uwięzione podczas załadunku, kliknij 3 razy przycisk Purge->Refill, aby przepłukać i ponownie napełnić układ.
6. Wyjmij rurkę napełniającą z uchwytu do pipet i delikatnie przetrzyj końcówkę strzykawki.
7. Chwyć zespół pipety i ostrożnie wprowadź strzykawkę do celi pomiarowej. Postępuj powoli, ponieważ strzykawka może się łatwo wygiąć, co wymaga zachowania szczególnej ostrożności. Upewnij się, że strzykawka została całkowicie włożona, dociskając podstawę pierścienia blokującego.
8. Ustaw pożądaną temperaturę pracy (w tym przypadku 20°C) i wybierz moc referencyjną nieco wyższą niż maksymalny oczekiwany przepływ ciepła podczas wtrysku (w tym przypadku 20μcal/sec).
9. Zaprogramuj pożądane objętości wtrysku oraz opóźnienia. (W tym przypadku zastosowano 28 wtrysków. Pierwszy wtrysk miał objętość 2 μL z opóźnieniem 60 s. Wszystkie kolejne wtryski miały objętość 10 μL z opóźnieniami 330 s).

6. Kolejne uruchomienia

1. W kolejnych seriach powtórz kroki 2-5, zmniejszając stężenia AAC(6')-Ii oraz AcCoA o współczynniki 2, 4, 8, 16 i 32.

7. Analiza danych

1. Należy zastosować procedurę dopasowania, która globalnie dopasowuje wszystkie izotermy do jednego zestawu parametrów wiązania, zgodnie z wcześniejszym opisem¹⁰.

8. Reprezentatywne wyniki

Reprezentatywne dane przedstawiono na Rysunku 1. Kształty izoterm powinny zmieniać się wraz z koncentracją. Przewiduje się ostrzejsze przejścia dla wyższych wartości c (tj. wyższych stężeń białka i ligandu) (Rysunek 2).

W przypadku AAC(6')-Ii model sekwencyjny dwumiejscowy zapewnia lepsze dopasowanie niż model opisujący dwa zestawy identycznych, niezależnych miejsc o regulowanej stechiometrii.

Rysunek 1. Izotermy uzyskane w wyniku miareczkowania AcCoA (3.86 mM) do AAC(6')-Ii (192 μM). A) Surowy zapis ITC. B) Wartości zintegrowane wykorzystane do wyznaczenia parametrów wiązania (kwadraty) z dopasowaniem sekwencyjnym dla 2 miejsc wiązania (-).

Rycina 2. Izotermy ITC dla AcCoA miareczkowanego do AAC(6')-Ii w różnych stężeniach. Dane eksperymentalne (otwarte okręgi) dopasowano do modelu niezależnych dwóch zestawów miejsc (przerywana linia purpurowa) oraz sekwencyjnego modelu dwumiejscowego (linia ciągła niebieska). Model sekwencyjny dwumiejscowy wykazuje wyraźnie lepszą zgodność ogólną. Zastosowane stężenia dla AAC(6')-Ii i AcCoA wynosiły odpowiednio: A) 6 μM, 0,25 mM, B) 12 μM, 0,25 mM, C) 24 μM, 0,5 mM, D) 48 μM, 1,0 mM, E) 96 μM, 1,9 mM oraz F) 196 μM, 3,86 mM.

Dyskusja

Ta analityczna część dopasowania zmiennego-c została wcześniej szczegółowo opisana¹⁰. W niniejszym opracowaniu przedstawiamy praktyczne aspekty gromadzenia zbiorów danych zmiennego-c odpowiednich dla tego podejścia. Niezbędne jest, aby wszystkie próbki białka i ligandu pobierano z tych samych roztworów stokowych. Dlatego ważne jest, aby początkowo przygotować wystarczającą ilość roztworu stokowego do przeprowadzenia całej serii eksperymentów. Zapewnia to stały stosunek AAC(6')-Ii do AcCoA we wszystkich doświad...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Acetylcholina–Enzym A (AcCoA)	Sigma-Aldrich	A2056
kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES)	Fisher Scientific	7365-45-9
kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)	Sigma-Aldrich	431788
Rurki do dializy Spectra/Por 2	Spectrum Labs	132678
Sterylny filtr strzykawkowy (0,2 μm)	VWR international	281445-477
filtry membranowe z azotanu celulozy (0,45 μm)	Whatman, GE Healthcare	7184-004
VP-ITC	MicroCal	VP-ITC	Mikrokalorymetr użyty do pomiarów
ThermoVac	MicroCal	USB Thermo Vac	Stacja odgazowywania z kontrolą temperatury