Gromadzenie zbiorów danych kalorymetrii izotermicznej miareczkowania o zmiennym stężeniu w celu określenia mechanizmów wiązania

Podsumowanie

ITC to potężne narzędzie do badania wiązania liganda z jego gospodarzem. Jednak w złożonych systemach kilka modeli może równie dobrze pasować do danych. Opisana tutaj metoda umożliwia wyjaśnienie odpowiedniego modelu wiązania dla złożonych układów i wyodrębnienie odpowiednich parametrów termodynamicznych.

Streszczenie

Kalorymetria miareczkowa izotermiczna (ITC) jest powszechnie stosowana do określania parametrów termodynamicznych związanych z wiązaniem liganda z makrocząsteczką gospodarza. ITC ma pewne zalety w porównaniu z popularnymi podejściami spektroskopowymi do badania interakcji gospodarz/ligand. Na przykład ciepło uwalniane lub pochłaniane, gdy te dwa składniki oddziałują na siebie, jest mierzone bezpośrednio i nie wymaga żadnych egzogenicznych reporterów. W ten sposób entalpia wiązania i stała asocjacyjna (Ka) są uzyskiwane bezpośrednio z danych ITC i mogą być używane do obliczania wkładu entropii. Co więcej, kształt izotermy zależy od wartości c i zastosowanego modelu mechanistycznego. Wartość c definiuje się jako c = n[P]tKa, gdzie [P]t jest stężeniem białka, a n jest liczbą miejsc wiązania ligandów w organizmie gospodarza. W wielu przypadkach wiele miejsc wiązania dla danego liganda nie jest równoważnych, a ITC pozwala na scharakteryzowanie parametrów wiązania termodynamicznego dla każdego pojedynczego miejsca wiązania. Wymaga to jednak użycia odpowiedniego modelu wiązania. Ten wybór może być problematyczny, jeśli różne modele mogą pasować do tych samych danych eksperymentalnych. Wcześniej wykazaliśmy, że problem ten można obejść, przeprowadzając eksperymenty przy kilku wartościach c. Wiele izoterm uzyskanych przy różnych wartościach c jest dopasowywanych jednocześnie do oddzielnych modeli. Następnie identyfikowany jest prawidłowy model na podstawie stopnia dopasowania w całym zestawie danych zmiennej c. Proces ten stosuje się tutaj do enzymu powodującego oporność na aminoglikozydy, aminoglikozydu N-6'-acetylotransferazy-Ii (AAC(6')-Ii). Chociaż nasza metodologia ma zastosowanie do każdego systemu, konieczność tej strategii jest lepiej pokazana na przykładzie układu makrocząsteczka-ligand wykazującego allosterię lub kooperatywność oraz gdy różne modele wiązania zapewniają zasadniczo identyczne dopasowania do tych samych danych. O ile nam wiadomo, takie systemy nie są dostępne na rynku. AAC(6')-Ii, jest homo-dimerem zawierającym dwa miejsca aktywne, wykazującym kooperacyjność między dwiema podjednostkami. Jednak dane ITC uzyskane przy jednej wartości c mogą być równie dobrze dopasowane do co najmniej dwóch różnych modeli: niezależnego modelu z dwoma zestawami lokalizacji i dwumiejscowego modelu sekwencyjnego (kooperacyjnego). Poprzez różnicowanie wartości c, jak wyjaśniono powyżej, ustalono, że prawidłowym modelem wiązania dla AAC(6')-Ii jest dwumiejscowy model wiązania sekwencyjnego. W niniejszym artykule opisujemy kroki, które należy podjąć podczas wykonywania eksperymentów ITC w celu uzyskania zestawów danych odpowiednich do analiz zmiennych c.

Protokół

1. Przygotowanie roztworów podstawowych

1. Oczyść interesującą makrocząsteczkę. (W tym przypadku aminoglikozyd N-6'-acetylotransferaza-Ii (AAC6'-Ii) jest izolowany, jak opisano gdzie indziej. ¹³)
2. Przygotować 4 litry buforu do dializy. (W tym przypadku użyliśmy 25 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES, MW 238,3 g/mol), zawierającego 2 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA, MW 292,2), o pH 7,5.)
3. Dializować białko Użyta próbka AAC(6')-Ii (5 ml przy 400 μM) musi być dializowana w buforze do dializy (3 x 1,3 l). Końcowy roztwór do dializy przechowuje się w celu przepłukania urządzenia i rozcieńczenia próbek.
4. Przefiltruj końcowy roztwór dializacyjny przez filtr celulozowy 0,45 μm i przechowuj w temperaturze 4°C. Będzie określany jako "uruchomiony bufor"
5. Przefiltrować roztwór białka przez filtr strzykawkowy 0,2 μm, który został dokładnie przepłukany działającym buforem. Zmierz końcowe stężenie białka za pomocą standardowego testu (Bradford, Lowry itp.) lub absorbancji UV. Przechowuj białko, aby zmaksymalizować długoterminową stabilność. (W przypadku AAC(6')-Ii oznacza to przechowywanie w temperaturze 4°C. AAC(6')-Ii nie zachowuje aktywności po zamrożeniu i rozmrożeniu).
6. Przygotować 200 μl 25 mM roztworu podstawowego acetylokoenzymu A (AcCoA, ligand, MW 809.57), rozpuszczając 4,0 mg w bieżącym buforze. Zamrażać w temperaturze -78°C do momentu użycia.
7. Wszystkie próbki białek i ligandów muszą pochodzić z tych samych roztworów podstawowych, aby zminimalizować losowe wahania stężenia między próbkami. W analizie dostosowywany jest pojedynczy współczynnik korygujący dla stężenia białka w całym zbiorze danych zmiennej c. ¹⁰

2. Przygotowanie próbek ITC

1. Rozcieńczyć roztwór enzymu do wartości c 64 z końcową objętością 2 ml. (W przypadku AAC(6')-Ii odpowiada to 192 μM.)
2. Szybko rozmrozić roztwór podstawowy liganda (AcCoA) w lodowatej wodzie.
3. Przygotować 0,5 ml roztworu AcCoA o stężeniu 10 razy większym niż liczba miejsc wiązania na białku, w tym przypadku 4 mM, rozcieńczając 80 μl roztworu podstawowego AcCoA w 420 μl buforu bieżącego. Przenieść do rurki do napełniania pipetą. Szybko przywróć roztwór podstawowy AcCoA do temperatury -78°C.
4. Odgazować białko i roztwory w próżni przez 5 minut w temperaturze o 1°C niższej od żądanej temperatury roboczej (19 °C).

3. Ustawianie strzykawki¹⁴

1. Włożyć strzykawkę do wstrzykiwań przez uchwyt strzykawki do momentu, aż wstępnie zamontowany zacisk strzykawki znajdzie się na tej samej wysokości co uchwyt.
2. Przełożyć drugi zacisk strzykawki na strzykawkę do wstrzykiwań, aż zostanie mocno dociśnięty do dolnej części uchwytu strzykawki. Delikatnie dokręć zacisk za pomocą dostarczonego napędu sześciokątnego 0,050" z kulką.
3. Umieścić uchwyt strzykawki w uchwycie na pipety.
4. Delikatnie wsunąć wstrzykiwacz pipety do strzykawki iniekcyjnej. Upewnić się, że końcówka tłoka jest wprowadzona bezpośrednio do otworu strzykawki. Po całkowitym włożeniu wkręcić pierścień blokujący uchwytu strzykawki w wtryskiwacz do pipet.

4. Ładowanie próbki¹⁴

1. Przemyć próbkę komory co najmniej 50 ml bieżącego buforu i usunąć pozostały płyn za pomocą szklanej strzykawki o pojemności 2,5 ml z długimi igłymi.
2. Powoli pobrać co najmniej 1,8 ml roztworu próbki białka do czystej i suchej strzykawki o pojemności 2,5 ml z długimi igłami. Uważaj, aby nie wprowadzić żadnych bąbelków.
3. Ostrożnie włóż igłę do celi na próbkę i delikatnie dotknij dolnej części celi. Lekko podnieś końcówkę (~1 mm) i delikatnie wstrzyknij roztwór AAC(6')-Ii do celi, aż nadmiar płynu będzie widoczny powyżej górnej części celi próbki.
4. Powoli podnieś igłę o około 1 cm, upewniając się, że płyn pozostał w przelewie. Szybko odbierz i wstrzyknij niewielką ilość roztworu (~0,25 ml), aby usunąć wszelkie uwięzione pęcherzyki w komórce próbki.
5. Usuń cały nadmiar roztworu. Osiąga się to poprzez delikatne przesuwanie igły wzdłuż boku przelewu do celi próbki. Końcówka strzykawki uderzy w półkę, jest to pożądana wysokość dla roztworu do biegania. Usuń cały płyn, który znajduje się powyżej tej linii.

5. Ładowanie strzykawki iniekcyjnej i rozpoczęcie biegu¹⁴

1. Podłącz plastikową rurkę ładującą strzykawkę do portu napełniania.
2. Dolna końcówka tłoka do górnej części otworu napełniania.
3. Umieść roztwór AcCoA w rurce do napełniania pipet na dnie uchwytu na pipety. Końcówka strzykawki nie powinna dotykać dna rurki do napełniania.
4. Powoli wciągać roztwór do strzykawki, aż niewielka ilość dostanie się do rurki strzykawki ładującej.
5. Zamknij port napełniania, opuszczając końcówkę tłoka i kliknij przycisk Zamknij port napełniania. Wyczyść i napełnij, klikając przycisk Czyść->Uzupełnij, 3 razy, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza, które mogły zostać uwięzione podczas ładowania.
6. Wyjąć rurkę do napełniania z uchwytu na pipety i delikatnie wytrzeć końcówkę strzykawki.
7. Weź zestaw pipet i delikatnie opuść strzykawkę do celi na próbkę. Postępuj powoli, ponieważ strzykawka może się łatwo zgiąć, dlatego należy zachować szczególną ostrożność. Upewnij się, że strzykawka jest całkowicie włożona, naciskając podstawę pierścienia blokującego.
8. Ustaw żądaną temperaturę pracy (w tym przypadku 20°C) i wybierz moc odniesienia, która jest nieco większa niż maksymalny oczekiwany przepływ ciepła wtrysku (w tym przypadku 20 μcal/s).
9. Zaprogramuj żądane objętości i opóźnienia wtrysku. (W tym przypadku zastosowano 28 zastrzyków. Pierwsze wstrzyknięcie miało objętość 2 μl z 60-sekundowym opóźnieniem. Wszystkie kolejne wstrzyknięcia miały objętość 10 μL z opóźnieniem 330 s.)

6. Kolejne uruchomienia

1. We wszystkich kolejnych seriach powtórz kroki 2-5, zmniejszając stężenia AAC(6')-Ii i AcCoA o współczynnik 2,4,8,16 i 32.

7. Analiza danych

1. Stosować procedurę dopasowania, która globalnie dopasowuje wszystkie izotermy do jednego zestawu parametrów wiązania, jak opisano wcześniej¹⁰.

8. Reprezentatywne wyniki

Reprezentatywne dane są pokazane na rysunku 1. Kształty izoterm powinny zmieniać się w zależności od stężenia. Oczekuje się, że ostrzejsze przejścia będą miały miejsce w przypadku wyższych wartości c (tj. wyższych stężeń białek i ligandów) (ryc. 2).

W przypadku AAC(6')-Ii, dwumiejscowy model sekwencyjny daje lepsze dopasowanie niż ten opisujący dwa zestawy identycznych, niezależnych miejsc z regulowanymi stechiometrami.

Rysunek 1. Izotermy wytwarzane przez miareczkowanie AcCoA (3,86 mM) do AAC(6')-Ii (192 μM). A) Surowy ślad ITC. B) Zintegrowane wartości używane do określania parametrów wiązania (kwadratów) z 2-miejscowym pasowaniem sekwencyjnym (-).

Rysunek 2. Izotermy ITC dla AcCoA miareczkowane do AAC(6')-Ii w różnych stężeniach. Dane eksperymentalne (otwarte okręgi) dopasowano do niezależnego modelu składającego się z 2 zestawów lokalizacji (przerywany kolor purpurowy) i modelu sekwencyjnego z 2 miejscami (jednolity niebieski). Model sekwencyjny z 2 lokalizacjami wyraźnie zapewnia lepszą ogólną zgodność. Stosowane stężenia wynosiły: A) 6 μM, 0,25 mM, B) 12 μM, 0,25 mM, C) 24 μM, 0,5 mM, D) 48 μM, 1,0 mM, E) 96 μM, 1,9 mM i F) 196 μM, 3,86 mM, odpowiednio dla AAC(6')-Ii i AcCoA.

Dyskusja

Ta analityczna część dopasowania zmiennej c została wcześniej szczegółowo opisana w¹⁰. W tym miejscu przedstawiamy praktyczne aspekty zbierania zestawów danych zmiennych c odpowiednich dla tego podejścia. Istotne jest, aby wszystkie próbki białek i ligandów były pobierane z tych samych roztworów podstawowych. Dlatego ważne jest, aby na początku przygotować wystarczającą ilość roztworu podstawowego, aby zakończyć całą serię eksperymentów. Zapewnia to, że stosunek AAC(6')-Ii i AcCoA jest stały we wszystkich eks...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Acetyl c– nzyme A (AcCoA)	Sigma-Aldrich	A2056
Kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES)	Fisher Scientific	7365-45-9
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)	Sigma-Aldrich	431788
Spectra/Por 2 Rurki dializacyjne	Spectrum Labs	132678
Sterylny filtr strzykawkowy (0,2 μ m)	VWR international	281445-477
Filtry membranowe z azotanu celulozy (0,45 μ m)	Whatman, GE Healthcare	7184-004
VP-ITC	MicroCal	VP-ITC	Mikrokalorymetr używany do pomiarów
ThermoVac	MicroCal	USB Thermo Vac	Stacja odgazowywania z kontrolowaną temperaturą