Wnioskowanie genotypowe tropizmu HIV-1 przy użyciu sekwencjonowania populacyjnego V3

Podsumowanie

Tropizm HIV można wywnioskować z regionu V3 otoczki wirusa. V3 to PCR amplifikowany w trzech egzemplarzach przy użyciu zagnieżdżonego RT-PCR, sekwencjonowany i interpretowany za pomocą oprogramowania bioinformatycznego. Próbki z 1 lub więcej sekwencjami o niskich wynikach g2P są klasyfikowane jako wirusy inne niż R5.

Streszczenie

Tło: Przed otrzymaniem leku z grupy antagonistów CCR5 w terapii HIV, pacjent musi przejść test tropizmu HIV, aby potwierdzić, że jego lub jej populacja wirusowa używa koreceptora CCR5 do wejścia do komórki, a nie alternatywnego koreceptora. Jednym z podejść do badania tropizmu jest zbadanie sekwencji regionu V3 otoczki HIV, która oddziałuje z koreceptorem.

Metody: Wirusowe RNA jest ekstrahowane z osocza krwi. Region V3 jest amplifikowany w trzech egzemplarzach z zagnieżdżoną odwrotną transkryptazą-PCR. Wzmocnienia są następnie sekwencjonowane i analizowane za pomocą oprogramowania RE_Call. Sekwencje są następnie przesyłane do algorytmu bioinformatycznego, takiego jak geno2pheno, w celu wywnioskowania tropizmu wirusowego z regionu V3. Sekwencje uważa się za nie-R5, jeśli ich wskaźnik wyników fałszywie dodatnich geno2pheno spadnie poniżej 5,75%. Jeśli którakolwiek z trzech sekwencji z próbki zostanie wywnioskowana jako inna niż R5, jest mało prawdopodobne, aby pacjent zareagował na antagonistę CCR5.

Protokół

Procedura:

1. Ekstrakcja:

Co najmniej 500 μL osocza krwi jest potrzebne jako próbka wejściowa do tego testu na tropizm genotypowy HIV.

1. Ekstrakcja RNA wirusa HIV z 500 μl osocza za pomocą automatycznego ekstraktora easyMAG (bioMérieux) lub preferowanej metody ekstrakcji w Twoim laboratorium.
   Eluować wyekstrahowany wirusowy RNA do podwielokrotności 60 μl. Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza lub rozpocząć Reverse Transcriptase-PCR natychmiast po ekstrakcji.

2. RT-PCR:

4μL ekstraktu próbki zostanie amplifikowany w trzech egzemplarzach przy użyciu zagnieżdżonych metod RT-PCR. Reakcja RT-PCR musi być przeprowadzona w pomieszczeniu czystym PCR.

1. Obliczyć ilość odczynnika wymaganą dla liczby próbek, które mają być amplifikowane. Postępuj zgodnie z poniższą tabelą wskazującą objętości odczynników dla 1 reakcji.
   Odczynnik Objętość (μL)
   (1X reakcja) Woda uzdatniona DEPC Godzina 10,56 2x bufor reakcyjny 20 50% mieszanka sacharozy i 0,04% błękitu bromofenolowego 4 Starter do przodu ukierunkowany na region HIV V3 0,32 pkt. Odwrócony podkład 0,32 pkt. Enzym - Jednoetapowy system RT-PCR SuperScript III z polimerazą DNA Platinum Taq 0,8 łączny 36 Tabela 1. Objętości odczynników wymagane do 1 reakcji jednoetapowego testu RT PCR.
   Każda jednoetapowa reakcja RT-PCR wymaga następującej receptury:
   • 10,56 μL DEPC uzdatniona woda
   • 20 μL 2x bufor reakcyjny
   • 4 μl mieszanki 50% sacharozy i 0,04% błękitu bromofenolowego
   • 0,32 μl startera skierowanego do przodu ukierunkowanego na region HIV V3
   • 0,32 μl startera odwrotnego
   • 0,8 μL enzymu
   Łącznie 36 μl na reakcję.
2. Ułóż probówki z ekstraktem próbki w rzędzie obok pustej, oznaczonej 96-dołkowej płytki do PCR.
3. Za pomocą pipety powtarzalnej dodać 36 μl mieszaniny próbek do każdego dołka płytki PCR, tak aby dla każdej próbki przygotowano 3 dołki.
   *Uwaga: Procedurę tę należy wykonać co najmniej w trzech egzemplarzach, aby zapewnić odpowiednie pobieranie próbek z populacji wirusa.
4. Za pomocą 8-kanałowej pipety wielokanałowej dodaj 4 μl ekstraktu próbki do każdego z 3 dołków. Zmieniaj wskazówki między każdym dodawaniem.
5. Przykryj studzienki nakrętkami pasków PCR.
6. Po zakończeniu przenoszenia umieść płytkę PCR w termocyklerze. Ustaw termocykler tak, aby działał z następującym programem: 30 minut w temperaturze 52°C 2 minuty w temperaturze 94°C 40 cykli (15 sekund w temperaturze 94°C, 30 sekund w temperaturze 55°C i 1,5 minuty w temperaturze 68°C) 5 minut w 68°C
7. Wyjmij płytkę PCR z termocyklera. Płyta może być przechowywana w temperaturze pokojowej.

Przejdź do etapu drugiej rundy PCR

3. Druga runda PCR:

1. Obliczyć ilość odczynnika wymaganą dla liczby próbek, które mają być amplifikowane. Postępuj zgodnie z poniższą tabelą wskazującą objętości odczynników dla 1 reakcji.
   Odczynnik Objętość (μL)
   (1X reakcja) Woda uzdatniona DEPC godz. 13.45 60% sacharozy, 0,08% czerwonej mieszanki krezolu cyfra arabska Bufor systemu HiFi Roche 2 cyfra arabska MgCl₂ 0,8 Protokół dNTP 0,16 Starter do PCR do przodu 0,15 pkt. Starter do odwróconego PCR 0,15 pkt. Rozwiń stronę Enzym HiFi 0,29 pkt. łączny Rozdział 19 Tabela 2. Objętości odczynników wymagane do 1 reakcji 2^{. rundy} PCR.
   Każda reakcja PCR drugiej rundy wymaga następującego przepisu:
   • 13,45 μl DEPC uzdatnionej wody
   • 2 μl 60% sacharozy, 0,08% mieszanki czerwieni krezolowej
   • 2 μL buforu 2 systemu Roche Hifi
   • 0,8 μl z 25 mM MgCl₂
   • 0,16 μl 25 mM dNTP
   • 0,15 μl zarówno starterów do przodu, jak i do tyłu PCR
   • 0,29 μl Rozwiń enzym HiFi
   Łącznie 19 μl na reakcję.
2. W pomieszczeniu czystym PCR, używając pipety powtarzalnej, dodaj 19 μl buforu reakcyjnego na studzienkę do czystej płytki PCR.
3. W pomieszczeniu po amplifikacji, używając 8-kanałowej pipety wielokanałowej, przenieś 1 μl matrycy RT-PCR do bufora drugiej rundy PCR. Zmieniaj wskazówki między każdym dodawaniem.
4. Przykryj dołki nakrętkami pasków PCR i przenieś drugą rundę płytki PCR do termocyklera.
5. Ustaw termocykler tak, aby działał z następującym programem: 2 minuty w temperaturze 94°C 35 cykli (15 sekund w 94°C, 30 sekund w 55°C, 1 minuta w 72°C) 7 minut w temperaturze 72°C
6. Wyjąć płytkę z termocyklera po powrocie temperatury do 25°C.

4. Elektroforeza żelowa:

Aby potwierdzić, że region V3 został pomyślnie wzmocniony, przeprowadzany jest etap elektroforezy żelowej.

1. Przygotuj żel agarozowy z 0,8 g proszku agarozy w 50 ml 1X TAE Buffer. Mieszaj i rozpuść w kuchence mikrofalowej przez ~1 minutę lub do całkowitego rozpuszczenia agarozy.
2. Dodaj 6 μl bezpiecznej bejcy żelowej SYBR i zamieszaj do wymieszania.
3. Wlej roztwór do tacki na żel i dodaj tyle grzebieni żelowych, aby pomieścić liczbę dołków PCR.
4. Po wyschnięciu żelu usuń grzebienie i umieść żel w aparacie żelowym, upewniając się, że jest całkowicie zanurzony w buforze 1X TAE.
5. Za pomocą pipety wielokanałowej o pojemności 10 μl dodaj 8 μl każdej próbki PCR do osobnego dołka w żelu. Przykryć płytkę PCR po dodaniu amplifikacji do żelu.
6. Dodaj 6 μl drabinki DNA do co najmniej jednego dołka w rzędzie.
7. Uruchom aparat żelowy przy napięciu ~100 V przez ~10 minut, upewniając się, że opaski nie spływają z żelu.
8. Umieść żel na trans-rozświetlaczu UV i zrób zdjęcie żelu.
   Studzienki z DNA amplifikowanym PCR będą wyglądały na jasne, co wskazuje na udaną amplifikację.
9. Zanotuj wszystkie próbki, w których trzy amplifikacje zakończyły się sukcesem. W razie potrzeby powtórzyć RT-PCR dla próbek z mniej niż 3 amplifikacjami.

Przejdź do sekwencjonowania

5. Sekwencjonowanie:

Po amplifikacji wirusowego cDNA, próbki mogą być przygotowane do sekwencjonowania. Reakcja sekwencjonowania powinna odbywać się w pomieszczeniu po amplifikacji.

1. Wyjmij BigDye z zamrażarki, a startery sekwencjonujące z lodówki. Pozwól BigDye rozmrozić się w temperaturze pokojowej, nie dłużej niż 1 godzinę.
2. Obliczyć ilość odczynnika wymaganą do określenia liczby próbek, które mają zostać zbadane. Postępuj zgodnie z poniższą tabelą wskazującą objętości odczynników dla 1 reakcji.
   Odczynnik Objętość (μL)
   (1X reakcja) Duży barwnik 0,3 Bufor BigDye 2.1 podkład 2.6 łączny 5.0 Tabela 3. Objętości odczynników wymagane do 1 reakcji sekwencjonowania.
   *Uwaga: przygotuj osobną mieszankę dla każdego podkładu.
   **Uwaga: Bufor BigDye stosowany w reakcji sekwencjonowania można przygotować w następujący sposób: Wymieszać 17,5 ml roztworu buforowego chlorowodorku Trizma (1 M) (pH 9,0) i 0,125 ml chlorku magnezu (1 M). Doprowadzić końcową objętość do 100 ml wodą z odczynnikiem. Powinien być przechowywany w temperaturze 2-8° C.
3. Korzystając z obliczeń z ppkt 3.3, przygotować mieszaniny reakcji sekwencjonowania dla każdego startera i wiru przez nie więcej niż 5 sekund. Podzielić na 0,2 ml probówki paskowe.
4. Porcję 5 μl reakcji sekwencjonowania wymieszać do odpowiednich studzienek płytkowych za pomocą pipety wielokanałowej. Przykryj płytkę (płytki) zawierającą mieszaninę reakcji sekwencjonowania płynem Kimwipe i odstaw na bok.
5. Przygotować rozcieńczenie 1:15 amplifikowanego produktu PCR, dodając 180 μl sterylnej wody Baxter do pozostałego produktu PCR.
6. Odpipetować 1 μl rozcieńczonej próbki na dno odpowiednich dołków płytkowych, wymienić końcówki pipet.
7. Po zakończeniu przenoszenia próbki uszczelnij płytkę nakrętkami paskowymi i wiruj przez 1 sekundę
8. Umieść płytkę w wirówce. Ustaw prędkość na 145g, gdy prędkość wirowania osiągnie 145g, zatrzymaj wirowanie.
9. Umieść płytkę w termocyklerze (termocyklerach) ustawionym na następujący program: 25 cykli (10 sec.@ 96° C, 5 sek. @ 50° C, 55 sek. @ 60° C) Objętość powinna wynosić co najmniej 6 μl. Cykl powinien trwać około 1,2 godziny.

Przejdź do opadów

6. Opady:

Aby "oczyścić" wirusowe cDNA po reakcji sekwencjonowania, wykonaj wytrącanie etanolu przy użyciu 95% etanolu.

1. Wyjmij płytkę z termocyklera i przenieś do pomieszczenia po amplifikacji.
2. Zdejmij nakrętki z paskami i ułóż je w kolejności na czystym ręczniku papierowym lub Kimwipe.
3. Odpipetować 4 μl roboczego roztworu octanu EDTA-sodu na bok każdej studzienki na próbkę. Delikatnie postukaj w płytkę, aby roztwór EDTA-sodu opadł na dno studzienki. Można stosować te same końcówki, o ile nie stykają się one z próbką znajdującą się na dnie studzienki.
   *Uwaga: Działający roztwór octanu EDTA-sodu można przygotować w następujący sposób:
   1. Przygotować 3M octan sodu, rozpuszczając 246,1 g octanu sodu w 1 l wody z odczynnikiem. Przefiltrować roztwór przez mikrofiltr 0,45 i przygotować 50 ml porcji.
   2. Przygotować podstawowy roztwór EDTA-octanu sodu (1,5 M NaOAc, 250 mM EDTA) mieszając równe objętości octanu sodu (3 M) i roztworu EDTA (500 mM) o pH 8,0.
   3. Przygotować działający roztwór octanu EDTA-sodu, mieszając jedną część podstawowego roztworu octanu EDTA-sodu z trzema częściami wody z odczynnikiem (10 ml + 30 ml).
4. Odpipetować 40 μl schłodzonego 95% etanolu na przeciwną stronę dołków na próbkę i założyć nakrętki pasków.
5. Uszczelnij nakrętki i obracaj płytkę wirowo przez 10 sekund. Postukaj w płytkę, aby usunąć wszelkie bąbelki.
6. Umieść talerz w zamrażarce w temperaturze -20°C na minimum 30 minut i maksymalnie 2 godziny.
7. 1. Po wystąpieniu opadów wyjmij płytkę z zamrażarki i umieść w wirówce na 20 minut z prędkością 3700 obr./min.
   2. Wyjmij odpowiednią ilość Hi-Di Formamide (Applied Biosystems) z zamrażarki, aby umożliwić mu rozmrożenie przed denaturacją.
   *Uwaga: Denaturacja pełnej 96-dołkowej płytki wymaga 960 μl formamidu HiDi, dlatego korzystne jest wcześniejsze przygotowanie ~1,1 ml porcji.
8. Po odkręceniu płytki zdejmij i wyrzuć nasadki pasków. Odwrócić płytkę nad pojemnikiem na odpady (np. koszem na śmieci) i zdekantować supernatant. Pozbądź się pozostałego supernatantu, osuszając odwrócone płytki na ręczniku papierowym.
9. Złóż 2 arkusze ręcznika papierowego i połóż na powierzchni talerza. Umieść płytkę stroną zadrukowaną do dołu w wirówce i wiruj z prędkością 145 g, zatrzymując wirowanie, gdy osiągnie 145 g.
10. Wyjmij płytkę z wirówki i sprawdź, czy studzienki są puste. Odpipetować 155 μl schłodzonego 95% etanolu do studzienek.
11. Odlać sklarowany osad do pojemnika na odpady, osuszyć ręcznikiem papierowym i powtórzyć odwirowywanie w 4.10.
12. Po wyjęciu płytki z wirówki wyrzuć zużyty ręcznik papierowy i pozostaw płytkę skierowaną do góry na 2-5 minut, aby pozostały etanol odparował.

Przejdź do denaturacji

7. Denaturyzacja

1. Pobrać rozmrożony formamid HiDi i zdekantować do pojemnika wystarczająco dużego, aby zmieściła się w nim pipeta wielokanałowa,
   *Uwaga: W przypadku stosowania wstępnie podanych środków, jak podano w 6.7b, wymagana jest jedna probówka na każdą płytkę 96-dołkową, która ma być uruchomiona.
2. Za pomocą pipety wielokanałowej rozprowadź 10 μl formamidu HiDi we wszystkich studzienkach na płytce, w tym w tych, które są puste.
3. Przykryj płytkę matą septyczną, aby utworzyć uszczelnienie.
4. Umieść płytkę w termocyklerze w temperaturze 90°C na 2 minuty.
5. Po denaturacji umieść płytkę w uchwycie na płytkę, a następnie załaduj do sekwencera. Prześlij przygotowany układ sekwencjonowania. Płytki można przechowywać w temperaturze -20°C do tygodnia przed wykonaniem sekwencjonowania.

8. Analiza danych wynikowych za pomocą oprogramowania do wywoływania bazy.

1. Korzystając z ReCall, wykonuj automatyczne wywołanie bazy bez interwencji człowieka, dopuszczalne jest pokrycie pojedynczym podkładem. ReCall to niestandardowe oprogramowanie do wywoływania bazy, które można znaleźć pod następującym adresem URL: http://pssm.cfenet.ubc.ca/
   *Uwaga: Do zalogowania się wymagane jest konto. Aby założyć konto, kliknij przycisk "Zarejestruj się" na stronie logowania. Po utworzeniu konta możesz uzyskać dostęp do strony przesyłania.
2. Po zalogowaniu możesz wybrać przykładowe pliki do przesłania. Korzystając z opcji przeglądania, możesz zlokalizować swoje nieprzetworzone dane sekwencjonowania do przesłania z maksymalnym przesyłaniem 20Mb.
   *Uwaga: Web Recall akceptuje tylko pliki danych jako pliki ABI i SCF w pliku .zip, .tar lub .tar.gz
3. Po wybraniu plików do przesłania wybierz sekwencję referencyjną. W takim przypadku upewnij się, że sekwencja referencyjna jest ustawiona na "V3". Jesteś teraz gotowy, aby kliknąć "Przetwarzaj dane".
4. Przetworzone dane pojawią się po prawej stronie strony pod nagłówkiem "Poprzednie próbki". Każdy przetworzony przebieg lub zestaw próbek zostanie umieszczony w folderze oznaczonym datą. Można je ponownie oznaczyć, klikając przycisk "Zmień nazwę".
5. Kliknięcie folderu spowoduje wyświetlenie listy próbek. Te, które są czerwone, zawiodły; Te, które są zielone, przeminęły. Klikając na konkretną próbkę i przycisk "Widok", możesz przejrzeć sekwencję. Postępuj zgodnie z instrukcjami po prawej stronie, aby poruszać się po sekwencji.
   *Uwaga: W przypadku tej metody dopuszczalne jest eksportowanie sekwencji, które przechodzą przywołanie (pokazane na zielono) automatycznie, bez ręcznej interwencji.
6. Jeśli jesteś zadowolony z wyników, możesz pobrać sekwencje przechodzące, klikając "Pobierz". Pliki zostaną pobrane w spakowanym folderze.
   *Uwaga: w sekcji "Ustawienia" możesz wybrać opcje pobierania i poczty e-mail, w tym typ pliku.
7. Próbki, które nie wytwarzają czystych sekwencji potrójnych, powinny być ponownie amplifikowane w potrójnym roztworze ekstraktu. Jeśli RePCR nie zapewni czystej sekwencji, dopuszczalne są co najmniej 2 sekwencje do użycia we wnioskowaniu tropizmowym.

9. Wnioskowanie o tropizmie wirusowym na podstawie sekwencji generowanych przez sekwencjonowanie populacyjne przy użyciu algorytmu koreceptorów Geno2pheno.

1. Sekwencje mogą być uruchamiane przez usługę koreceptora geno2pheno pod następującym adresem URL: http://coreceptor.bioinf.mpi-inf.mpg.de/index.php.
2. Próbki do przesłania mogą być oznaczone według własnego uznania. Z menu rozwijanego ustawienia istotności wybierz "zoptymalizowane wartości odcięcia na podstawie analizy danych klinicznych z MOTIVATE (2% i 5,75% FPR)"
3. Wybierz, aby przesłać lub wkleić sekwencję do analizy, pliki fasta są dopuszczalne.
4. Produkt leczniczy geno2pheno można interpretować w następujący sposób: G2P FPR >5,75 jest reprezentatywny dla populacji wirusów wykorzystujących R5; istnieje prawdopodobieństwo, że zareagują na antagonistów CCR5 G2P FPR < 5,75 jest reprezentatywny dla populacji wirusów innych niż R5; jest mało prawdopodobne, aby zareagowały na antagonistów CCR5. Jest bardzo mało prawdopodobne, aby G2P <2 miał jakąkolwiek odpowiedź na antagonistów CCR5. Jeśli zostanie wywnioskowane, że którakolwiek z trzech sekwencji z próbki nie jest R5, pacjent prawdopodobnie nie zareaguje na antagonistę CCR5.

10. Reprezentatywne wyniki

Gdy protokół zostanie wykonany poprawnie, należy oczekiwać pomyślnego sekwencjonowania 2 lub 3 powtórzeń dla każdej próbki. Negatywy przeprowadzone wraz z próbkami nie powinny wskazywać na RNA. Większość sekwencji powinna "przechodzić" wywołanie bazowe przez ReCall.

Na podstawie rozkładu R5 i nie-R5 w populacji wirusów społeczności, większość losowo wybranych próbek pacjentów może zawierać wirusa używającego R5. W związku z tym, o ile projekt projektu nie sugeruje inaczej, należy spodziewać się większej liczby próbek R5 niż próbek innych niż R5.

Tabela 1. A) Objętości odczynników wymagane do 1 reakcji jednoetapowej RT-PCR oraz B) program termocyklera niezbędny do przeprowadzenia reakcji RT-PCR.

A)

Odczynnik Objętość (μL)
(1X reakcja) Woda uzdatniona DEPC Godzina 10,56 2x bufor reakcyjny 20 50% mieszanka sacharozy i 0,04% błękitu bromofenolowego 4 Podkład do przodu SQV3F1 0,32 pkt. Podkład odwrotny CO602 0,32 pkt. Enzym - Jednoetapowy system RT-PCR SuperScript III z polimerazą DNA Platinum Taq 0,8 łączny 36

*Uwaga:
Sekwencja startera SQV3F1: 5' GAG CCA ATT CCC ATA CAT TAT TGT 3'
Sekwencja starterów CO602: 5' GCC CAT AGT GCT TCC TGC TGC TCC CAA GAA CC 3'

B)

Liczba cykli Godzina temperatura 1 30 minut 52°C 1 2 minuty 94°C 40 15sekundy 94°C 30sekundy 55°C 1,5 minuty 68°C 1 5 minut 68°C

Tabela 2. A) Objętości odczynników wymagane do 1 reakcji drugiej rundy PCR oraz B) program termocyklera niezbędny do przeprowadzenia drugiej rundy reakcji PCR.

A)

Odczynnik Objętość (μL)
(1X reakcja) Woda uzdatniona DEPC godz. 13.45 60% sacharozy, 0,08% czerwonej mieszanki krezolu cyfra arabska Bufor systemu HiFi Roche 2 cyfra arabska MgCl₂ 0,8 Protokół dNTP 0,16 Podkład do przodu SQV3F2 0,15 pkt. Podkład odwrotny CD4R 0,15 pkt. Rozwiń stronę Enzym HiFi 0,29 pkt. łączny Rozdział 19

*Uwaga:
Sekwencja starterów SQV3F2: 5' TGT GCC CCA GCT GGT TTT GCG PRZY 3'
Sekwencja startera CD4R: 5' TAT AAT TCA CTT CTC CAA TTG TCC 3'

B)

Nie. Liczba cykli Godzina temperatura 1 2 minuty 94°C 35 Rozdział 15sekundy 94°C 30sekundy 55°C 1 minuta 72°C 1 7 minut 72°C

Tabela 3. A) Objętości odczynnika wymagane do 1 reakcji sekwencjonowania oraz B) program termocyklera niezbędny do przeprowadzenia reakcji sekwencjonowania.

A)

Odczynnik Objętość (μL)
(1X reakcja) Duży barwnik 0,3 Bufor BigDye 2.1 Grunt
Naprzód V3FO2F
Odwrócony SQV3R1 2.6 łączny 5.0

*Uwaga: NIE łącz podkładów; dla każdego podkładu należy przygotować osobną mieszankę
Sekwencja starterów V3O2F: 5' AAT GTC AGY ACA GTA CAA TGT ACA C 3'
Sekwencja starterów SQV3R1: 5' GAA AAA TTC CCT TCC ACA ATT AAA 3'

B)

Liczba cykli Godzina temperatura 25 10sekundy 96°C 5sekundy 50°C 55sekundy 60°C

Dyskusja

Przedstawiona tutaj metoda jest standardową metodą sekwencjonowania stosowaną do badania tropizmu. Kliniczne zastosowanie sekwencjonowania pętli V3 otoczki wirusa HIV do przewidywania tropizmu wirusowego było do niedawna ograniczone. W retrospektywnych analizach badań klinicznych marawiroku (ViiV Healthcare) wykazano, że metoda ta jest co najmniej w równym stopniu zdolna do przewidywania tropizmu wirusowego w porównaniu z innymi zwalidowanymi testami stosowanymi klinicznie.

Istnieje wiele korzyści z przeprowadzania analizy genotypowej pętli V3 w celu przewidywania tropizmu. Przede wszystkim procedura ta może być wykonywana w każdym obiekcie wyposażonym w działający sprzęt do sekwencjonowania, co znacznie zwiększa dostępność i skraca czas realizacji testów tropizmu. Dla porównania, fenotypowy test Enhanced Sensitivity Trofile Astest (ESTA) (Monogram Biosciences), który posłużył jako złoty standard w testach tropizmu, jest wykonywany w jednym z ośrodków w południowej Kalifornii. Dodatkowe korzyści obejmują wymóg mniejszej ilości materiału wyjściowego i minimalne wymagane miano wirusa w osoczu wynoszące 500 kopii/ml. Ponadto koszty operacyjne związane z przeprowadzeniem testu genotypowego są stosunkowo niskie w porównaniu z kosztami testu fenotypowego. W szczególności zastosowanie oprogramowania ReCall eliminuje konieczność ręcznego przeglądu sekwencji, który zwykle jest pracochłonną częścią analiz genotypów.

Przedstawiona tutaj metoda jest dość prosta, a żaden konkretny krok nie przeważa nad innym pod względem ważności. Sugerujemy przeprowadzenie PCR i sekwencjonowania w trzech egzemplarzach, aby zwiększyć szanse na uchwycenie gatunków mniejszościowych w populacji wirusa w próbce. Można przeprowadzić powtórzenia większe niż trzy, jednak stwierdziliśmy, że potrójne repliki są zarówno wydajne, jak i niezawodne. Sugerujemy również użycie zestawu One-Step Reverse Transcriptase PCR Kit (Qiagen), który wykonuje zarówno RT-PCR, jak i PCR pierwszej rundy w tej samej reakcji, zachowując przy tym wysoką czułość i swoistość.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ekstrakcja RNA za pomocą NucliSens easyMAG wersja 1.0
NucliSens easyMAG Krzemionka magnetyczna	bioMerieux	kat. # 280133	(48 x 0,6 ml)
NucliSens easyMAG Bufor do lizy	bioMerieux	kat. # 280134	(4 x 1000 ml)
NucliSens easyMAG Bufor ekstrakcyjny 1	bioMerieux	kat. # 280130	(4 x 1000 ml)
NucliSens easyMAG Extraction Buffer 2	bioMerieux	kat. # 280131	(4 x 1000 ml)
NucliSens easyMAG Extraction Buffer 3	bioMerieux	kat. # 280132	(4 x 1000 ml)
NucliSens easyMAG wersja 1.0	bioMerieux
Class II A2 komora
Jednoetapowa reakcja PCR z odwrotną transkryptazą i druga runda PCR
DEPC-uzdatniona woda	Ambion	kat. # 9922
SuperScrip III One-Step RT-PCR System z Platinum Taq High Fidelty	Invitrogen	cat#12574-035	Zastosowane elementy zestawu: - SuperScript III RT/ Platinum Taq High Fidelty Enzyme Mix - 2X Reaction Mix (bufor zawierający 0,4 mM każdego dNTP, 2,4 mM MgSO4)
Rozwiń stronę High Fidelity PCR System	Roche Group	kat. # 1 759 078	Użyte elementy zestawu:- Rozwiń konc. High Fidelity Buffer 10X za pomocą 15 mM MgCl2 (pokrywy oznaczone 2)- Rozwiń mieszankę enzymów HF PCR (3,5U/μ l)- MgCl2 Roztwór podstawowy (25mM) (pokrywki oznaczone 4)
dNTP: dATP, dGTP, dCTP, dTTP	Roche Group	kat. # 11969064001	100 mM)
Sacharoza	Kat. Sigma-Aldrich	# S0389-500G
Sól sodowa błękitu bromofenolowego	Kat. Sigma-Aldrich	.# B5525
Cresol Red	Sigma-Aldrich	kat.# 114472-5G	klasa wskaźnika
Termocykler
Gel Electroforeesis
50X TAE buffer	Invitrogen	kat. # 24710030	(1000 ml)
SYBR Bezpieczny barwnik żelowy DNA	Invitrogen	kat. # S33102
Agaroza (ultra czysta)	Invitrogen	kat. # 15510-027
E-Gel Low Range Ilościowa drabina DNA	Invitrogen	kat. # 12373-031
Odczynnik Klasa klasy II Woda
Żel Aparat
Sekwencjonowanie
ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit	Applied Biosciences	kat. # 4337458	25000 reakcji)
Hi-Di Formamid	Zastosowany Nauki biologiczne	kat. # 4311320
Octan sodu (NaOAc)	Sigma-Aldrich	kat. # S-2889
EDTA	Sigma-Aldrich	Kat.# 03690-100ML	0.5M, pH=8.0
TRIZMA Roztwór buforowy chlorowodorku	Sigma-Aldrich	kat. # T-2819	1 M, pH 9.0
Chlorek magnezu (MgCl2)	Sigma-Aldrich	kat. # M-1028	1 M
Bufor do biegania 95% etanolu
(10X) z EDTA	Applied Biosystems	kat. # 4335613	500 mL
Polymer Pop-7 (25mL) Lub Polymer Pop-7 (10mL)	Applied Biosystems	kat. # 44363929 lub kat. # 4352759
3700/3730 BigDye Terminator v3.1 Standardowy zestaw sekwencjonowania	Applied Biosciences	Cat# 4336943
Termocykler
Wirówka z uchwytami
3730xl Analizator DNA	Applied Biosciences