Tropizm HIV można wywnioskować z regionu V3 otoczki wirusa. Region V3 jest amplifikowany w trzech powtórzeniach metodą zagnieżdżonej RT-PCR, sekwencjonowany, a następnie interpretowany przy użyciu oprogramowania bioinformatycznego. Próbki zawierające jedną lub więcej sekwencji z niskimi wartościami g2P są klasyfikowane jako wirusy non-R5.
Artykuł metodologiczny
Genotypowe wnioskowanie o tropizmie HIV-1 z wykorzystaniem sekwencjonowania populacyjnego pętli V3
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wprowadzenie: Przed podaniem leku z grupy antagonistów CCR5 w terapii HIV, pacjent musi przejść test tropizmu HIV, aby potwierdzić, że jego populacja wirusów wykorzystuje koreceptor CCR5 do wniknięcia do komórki, a nie koreceptor alternatywny. Jednym z podejść do badania tropizmu jest analiza sekwencji regionu V3 otoczki HIV, która wchodzi w interakcję z koreceptorem.
Metody: Viralne RNA jest ekstrahowane z osocza krwi. Region V3 jest powielany w trzech powtórzeniach metodą zagnieżdżonej odwrotnej transkrypcji i PCR. Produkty amplifikacji są następnie sekwencjonowane i analizowane przy użyciu oprogramowania RE_Call. Sekwencje są następnie przekazywane do algorytmu bioinformatycznego, takiego jak geno2pheno, w celu wnioskowania o tropizmie wirusa na podstawie regionu V3. Sekwencje uznaje się za nie-R5, jeśli wskaźnik wyników fałszywie dodatnich w geno2pheno spadnie poniżej 5,75%. Jeśli którakolwiek z trzech sekwencji z próbki zostanie uznana za nie-R5, prawdopodobne jest, że pacjent nie odpowie na antagonistę CCR5.
Protokół
Procedura:
1. Ekstrakcja:
Do tego genotypowego testu tropizmu HIV jako materiału wejściowego wymagane jest co najmniej 500 μL osocza krwi.
- Wyizoluj RNA HIV z 500 μL osocza, korzystając z automatycznego ekstraktora easyMAG (bioMérieux) lub preferowanej metody ekstrakcji stosowanej w Twoim laboratorium.
Eluuj wyizolowane RNA wirusowe do 60 μL aliquoty. Przechowuj w temperaturze -20 °C lub niezwłocznie po ekstrakcji rozpocznij procedurę Reverse Transcriptase-PCR.
2. RT-PCR:
4μL ekstraktu z próbki zostanie poddanych amplifikacji w trzech powtórzeniach z wykorzystaniem metody nested RT-PCR. Reakcję RT-PCR należy przeprowadzić w pomieszczeniu przeznaczonym do PCR (PCR-clean room).
- Oblicz ilość odczynników potrzebną dla liczby próbek przeznaczonych do amplifikacji. Postępuj zgodnie z poniższą tabelą, w której określono objętości odczynników dla jednej reakcji.
Tabela 1. Objętości odczynników wymagane dla jednej reakcji One-Step RT-PCR.Odczynnik Objętość (μL)
(reakcja 1X)woda traktowana DEPC 10.56 2x bufor reakcyjny 20 mieszanina 50% sacharozy i 0,04% błękitu bromofenolowego 4 Starter bezpośredni do regionu V3 HIV 0.32 Starter odwrotny 0.32 Enzym - SuperScript III One-Step RT-PCR System z polimerazą DNA Platinum Taq 0.8 Suma 36
Każda reakcja jednoetapowego RT-PCR wymaga następującego składu:- 10,56 μL wody traktowanej DEPC
- 20 μL 2x buforu do reakcji
- mieszanina 4 μL 50% sacharozy i 0,04% błękitu bromofenolowego
- 0,32 μL startera forward skierowanego na region V3 wirusa HIV
- 0,32 μL prawego praimera
- 0,8 μL enzymu
- Ustaw probówki z ekstraktami próbek w rzędzie obok pustej, opisanej płyty PCR z 96 dołkami.
- Za pomocą pipety wielokanałowej (repeater pipette) nanieś 36 μL mieszaniny próbki do każdego dołka płyty PCR, tak aby dla każdego ekstraktu z próbki przygotowano 3 dołki.
*Uwaga: Procedurę tę należy przeprowadzić w co najmniej trzech powtórzeniach, aby zapewnić odpowiednią reprezentatywność próbek populacji wirusowej. - Za pomocą 8-kanałowej pipety wielokanałowej nanieś 4 μL ekstraktu z próbki do każdej z 3 studzienek. Zmieniaj końcówki po każdym naniesieniu.
- Przykryj dołki odpowiednimi nakrętkami do pasków PCR.
- Po zakończeniu przenoszenia umieść płytkę PCR w termocyklerze. Zaprogramuj termocykler zgodnie z następującym protokołem: 30 minut w 52°C 2 minuty w 94°C 40 cykli (15 sekund w 94°C, 30 sekund w 55°C i 1,5 minuty w 68°C) 5 minut w 68°C
- Wyjmij płytkę PCR z termocyklera. Płytkę można przechowywać w temperaturze pokojowej.
Przejdź do drugiego etapu PCR
3. PCR w drugiej rundzie:
- Oblicz ilość odczynników potrzebną dla liczby próbek przeznaczonych do amplifikacji. Należy zastosować poniższą tabelę określającą objętości odczynników na 1 reakcję.
Tabela 2. Objętości odczynników wymagane dla 1 reakcji PCR w 2nd rundzie.Odczynnik Objętość (μL)
(reakcja 1X)woda traktowana DEPC 13.45 mieszanina 60% sacharozy i 0,08% czerwieni kreolowej 2 bufor 2 systemu Roche HiFi 2 MgCl2 0.8 dNTP 0.16 Forwardowy starter PCR 0.15 Reverse’owy starter PCR 0.15 enzym Expand HiFi 0.29 Suma 19
Każda reakcja PCR w drugiej rundzie wymaga następującego składu:- 13.45 μL wody traktowanej DEPC
- 2 μL mieszaniny 60% sacharozy i 0,08% czerwieni kreolowej
- 2 μL buforu 2 systemu Roche Hifi
- 0.8 μL 25 mM MgCl2
- 0.16 μL 25 mM dNTP
- 0.15 μL każdego ze starterów PCR: forwardowego i reverse’owego
- 0.29 μL enzymu Expand HiFi
- W pomieszczeniu do przygotowania PCR, używając pipety z dozownikiem wielokrotnym (repeater), nanieś 19 μL buforu do reakcji do każdej studni czystej płytki PCR.
- W pomieszczeniu poamplifikacyjnym, używając 8-kanałowej pipety wielokanałowej, przenieś 1 μL matrycy RT-PCR do buforu PCR drugiej rundy. Zmieniaj końcówki po każdym dodaniu.
- Przykryj studnie nakrętkami paskowymi do PCR i przenieś płytkę PCR drugiej rundy do termocyklera.
- Ustaw termocykler na następujący program: 2 minuty w 94°C 35 cykli (15 sekund w 94°C, 30 sekund w 55°C, 1 minuta w 72°C) 7 minut w 72°C
- Wyjmij płytkę z termocyklera po powrocie temperatury do 25°C.
4. Elektroforeza żelowa:
W celu potwierdzenia, że region V3 został pomyślnie amplifikowany, przeprowadza się etap elektroforezy żelowej.
- Przygotuj żel agarozowy, rozpuszczając 0,8 g proszku agarozy w 50 mL buforu 1X TAE. Mieszaj i podgrzewaj w mikrofalówce przez ok. 1 minutę lub do całkowitego rozpuszczenia agarozy.
- Dodaj 6 μL barwnika do żeli SYBR safe i zamieszaj przez delikatne potrząsanie.
- Wlej roztwór do formy do żelu i wstaw odpowiednią liczbę grzebieni, aby zapewnić miejsce dla wszystkich próbek PCR.
- Po zastygnięciu żelu wyjmij grzebienie i umieść żel w aparacie do elektroforezy, upewniając się, że jest on całkowicie zanurzony w buforze 1X TAE.
- Za pomocą wielokanałowej pipety 10 μL nanieś 8 μL każdej próbki PCR do odpowiednich dołków w żelu. Po naniesieniu produktów amplifikacji na żel przykryj płytkę PCR.
- Dodaj 6 μL drabinki DNA do co najmniej jednego dołka w każdym rzędzie.
- Przeprowadź elektroforezę przy napięciu ok. 100V przez ok. 10 minut, dbając o to, aby prążki nie wyszły poza obszar żelu.
- Umieść żel na transiluminatorze UV i wykonaj zdjęcie żelu.
Dołki z DNA amplifikowanym metodą PCR będą świecić, co wskazuje na pomyślną amplifikację. - Odnotuj wszystkie próbki, w których trzy amplifikacje zakończyły się sukcesem. W razie potrzeby powtórz RT-PCR dla próbek, w których uzyskano mniej niż 3 amplifikacje.
Przejdź do sekwencjonowania
5. Sekwencjonowanie:
Po amplifikacji viralnego cDNA próbki można przygotować do sekwencjonowania. Reakcja sekwencjonowania powinna odbywać się w pomieszczeniu poamplifikacyjnym.
- Wyjmij BigDye z zamrażarki, a primery sekwencyjne z lodówki. Pozostaw BigDye do rozmrożenia w temperaturze pokojowej na czas nie dłuższy niż 1 godzina.
- Oblicz ilość odczynników wymaganą dla liczby próbek do analizy. Postępuj zgodnie z poniższą tabelą, która wskazuje objętości odczynników dla 1 reakcji.
Tabela 3. Objętości odczynników wymagane dla 1 reakcji sekwencjonowania.Odczynnik Objętość (μL)
(reakcja 1X)BigDye 0.3 Bufor BigDye 2.1 Primer 2.6 Suma 5.0
*Uwaga: przygotuj oddzielną mieszaninę dla każdego primera.
**Uwaga: bufor BigDye stosowany w reakcji sekwencjonowania może zostać przygotowany w następujący sposób: zmieszaj 17,5 mL roztworu buforowego chlorku trizmy (1 M) (pH9.0) i 0,125 mL chlorku magnezu (1 M). Doprowadź objętość końcową do 100 mL za pomocą wody o czystości reagentowej. Roztwór ten należy przechowywać w temperaturze 2-8° C. - Korzystając z obliczeń z punktu 3.3, przygotuj mieszaniny do reakcji sekwencjonowania dla każdego primera i wymieszaj w wortexie przez nie więcej niż 5 sekund. Rozdziel do probówek paskowych o objętości 0,2 mL.
- Nanieś 5 μL mieszaniny reakcyjnej do sekwencjonowania do odpowiednich dołków płytki, używając pipety wielokanałowej. Przykryj płytkę(i) zawierające mieszaninę reakcyjną chusteczką Kimwipe i odstaw.
- Przygotuj rozcieńczenie 1:15 amplifikowanego produktu PCR, dodając 180 μL sterylnej wody Baxter do pozostałego produktu PCR.
- Pipetuj 1 μL rozcieńczonej próbki na dno odpowiednich dołków płytki, a następnie wymień końcówki pipety.
- Po zakończeniu przenoszenia próbek zamknij płytkę nakrętkami paskowymi i wymieszaj w wortexie przez 1 sekundę.
- Umieść płytkę w wirówce. Ustaw prędkość na 145g; gdy prędkość wirowania osiągnie 145g, zatrzymaj wirowanie.
- Umieść płytkę w termocyklerze(ach) ustawionym na następujący program: 25 cykli (10 s @ 96° C, 5 s @ 50° C, 55 s @ 60° C) Objętość powinna wynosić co najmniej 6μL. Cykl powinien trwać około 1,2 godziny.
Przejdź do etapu wytrącania
6. Wytrącanie:
W celu „oczyszczenia” wirusowego cDNA po reakcji sekwencjonowania, przeprowadź wytrącanie etanolem przy użyciu 95% etanolu.
- Wyjmij płytkę z termocyklera i przenieś ją do pomieszczenia poamplifikacyjnego.
- Zdejmij nakrętki paskowe i ułóż je w odpowiedniej kolejności na czystym ręczniku papierowym lub chusteczce Kimwipe.
- Pipetuj 4μL roboczego roztworu EDTA-octanu sodu na ściankę każdej studni z próbką. Delikatnie stuknij płytkę, aby roztwór EDTA-octanu osiadł na dnie studni. Można używać tych samych końcówek, pod warunkiem, że nie dotkną one próbki na dnie studni.
*Uwaga: Roboczy roztwór EDTA-octanu sodu można przygotować w następujący sposób:- Przygotuj 3M octan sodu, rozpuszczając 246,1 g octanu sodu w 1 L wody czystości odczynnikowej. Przefiltruj roztwór przez filtr 0,45 μm i przygotuj aliquoty po 50 mL.
- Przygotuj roztwór zapasowy EDTA-octanu sodu (1,5 M NaOAc, 250 mM EDTA), mieszając równe objętości octanu sodu (3 M) oraz roztworu EDTA (500 mM) o pH 8,0.
- Przygotuj roboczy roztwór EDTA-octanu sodu, mieszając jedną część roztworu zapasowego EDTA-octanu sodu z trzema częściami wody czystości odczynnikowej (10 mL + 30 mL).
- Pipetuj 40μL schłodzonego 95% etanolu na przeciwległą ściankę studni z próbkami i załóż nakrętki paskowe.
- Zaciśnij nakrętki i wstrząśnij płytkę w wortexie przez 10 sekund. Stuknij płytkę, aby usunąć pęcherzyki powietrza.
- Umieść płytkę w zamrażarce w temperaturze -20°C na minimum 30 minut i maksimum 2 godzin.
-
- Po zajściu precypitacji wyjmij płytkę z zamrażarki i umieść w wirówce na 20 minut przy 3700 rpm.
- Wyjmij z zamrażarki odpowiednią ilość formamidu Hi-Di (Applied Biosystems), aby mógł się rozmrozić przed denaturacją.
- Po wirowaniu płytki zdejmij i wyrzuć nakrętki paskowe. Odwróć płytkę nad pojemnikiem na odpady (np. koszem na śmieci) i odlej naddestylat. Pozbądź się pozostałego naddestylatu, osuszając odwróconą płytkę ręcznikiem papierowym.
- Złóż 2 arkusze ręcznika papierowego i połóż je na powierzchni płytki. Umieść płytkę stroną skierowaną w dół w wirówce i wiruj przy 145g, zatrzymując wirowanie w momencie osiągnięcia 145g.
- Wyjmij płytkę z wirówki i upewnij się, że studnie są puste. Pipetuj 155μL schłodzonego 95% etanolu do studni.
- Wylej naddestylat do pojemnika na odpady, osusz ręcznikiem papierowym i powtórz wirowanie zgodnie z punktem 4.10.
- Po wyjęciu płytki z wirówki wyrzuć zużyty ręcznik papierowy i pozostaw płytkę stroną górną do góry przez 2-5 minut, aby pozostały etanol odparował.
Przejdź do denaturacji
7. Denaturowanie
- Wyjąć rozmrożony formamid HiDi i przelać do pojemnika wystarczająco dużego dla pipety wielokanałowej,
*Uwaga: W przypadku stosowania wcześniej przygotowanych aliquot, zgodnie z opisem w punkcie 6.7b, wymagana jest jedna probówka dla każdej płytki 96-dołkowej poddawanej analizie. - Za pomocą pipety wielokanałowej nanieść 10μL formamidu HiDi do wszystkich dołków na płytce, w tym do tych pustych.
- Przykryć płytkę matą z przegrodami w celu uszczelnienia.
- Umieścić płytkę w termocyklerze w temperaturze 90°C na 2 minuty.
- Po denaturacji umieścić płytkę w uchwycie, a następnie załadować do sekwenatora. Wgrać przygotowany układ sekwencjonowania. Płytki można przechowywać w temperaturze -20°C do jednego tygodnia przed przeprowadzeniem sekwencjonowania.
8. Analiza uzyskanych danych przy użyciu oprogramowania do odczytu zasad (base calling).
- Używając programu ReCall, wykonaj automatyczne odczytywanie zasad (base calling) bez ingerencji człowieka; dopuszczalne jest pokrycie pojedynczym starterem. ReCall to specjalistyczne oprogramowanie do odczytywania zasad, które znajduje się pod następującym adresem URL: http://pssm.cfenet.ubc.ca/
*Uwaga: Logowanie wymaga posiadania konta. Aby utworzyć konto, kliknij przycisk „Register” na stronie logowania. Po utworzeniu konta uzyskasz dostęp do strony przesyłania plików. - Po zalogowaniu można wybrać pliki próbek do przesłania. Korzystając z opcji przeglądania, można zlokalizować surowe dane sekwencyjne do przesłania, przy maksymalnym rozmiarze pliku 20Mb.
*Uwaga: Web Recall akceptuje pliki danych wyłącznie w formatach ABI i SCF w archiwach .zip, .tar lub .tar.gz - Po wybraniu plików do przesłania wybierz sekwencję referencyjną. W tym przypadku upewnij się, że sekwencja referencyjna jest ustawiona na „V3”. Możesz teraz kliknąć „Process Data”.
- Przetworzone dane pojawią się po prawej stronie strony pod nagłówkiem „Past Samples”. Każdy przetworzony przebieg lub zestaw próbek zostanie umieszczony w folderze oznaczonym datą. Można je zmienić, klikając przycisk „Rename”.
- Kliknięcie w folder spowoduje wyświetlenie listy próbek. Te zaznaczone na czerwono nie przeszły weryfikacji; te zaznaczone na zielono przeszły pomyślnie. Klikając konkretną próbkę i przycisk „View”, można przejrzeć sekwencję. Postępuj zgodnie z instrukcjami po prawej stronie strony, aby nawigować po sekwencji.
*Uwaga: W tej metodzie dopuszczalne jest automatyczne eksportowanie sekwencji, które przeszły weryfikację w programie ReCall (oznaczone na zielono), bez ręcznej ingerencji. - Jeśli wyniki są satysfakcjonujące, można pobrać sekwencje, które przeszły weryfikację, klikając „Download”. Pliki zostaną pobrane w skompresowanym folderze.
*Uwaga: w sekcji „Settings” można wybrać opcje pobierania i wysyłki e-mail, w tym typ pliku. - Próbki, które nie pozwoliły na uzyskanie czystych sekwencji w trzech powtórzeniach, powinny zostać ponownie amplifikowane w trzech powtórzeniach z ekstraktu. Jeśli ponowne PCR (RePCR) nie zapewni czystej sekwencji, do wnioskowania o tropizmie dopuszczalne jest minimum 2 sekwencje.
9. Wnioskowanie o tropizmie wirusa na podstawie sekwencji uzyskanych w ramach sekwencjonowania populacyjnego z wykorzystaniem algorytmu koreceptora Geno2pheno.
- Sekwencje można przeanalizować za pomocą usługi coreceptor geno2pheno pod adresem: http://coreceptor.bioinf.mpi-inf.mpg.de/index.php.
- Próbki do przesłania można oznaczyć w dowolny sposób. Z rozwijanego menu ustawień istotności należy wybrać opcję „optimized cutoffs based on analysis of clinical data from MOTIVATE (2% and 5.75% FPR)”.
- Należy wybrać opcję przesłania lub wklejenia sekwencji do analizy; dopuszczalne są pliki fasta.
- Wartość geno2pheno FPR można interpretować w następujący sposób: G2P FPR >5.75 reprezentuje populację wirusa wykorzystującą R5; prawdopodobna odpowiedź na antagonisty CCR5. G2P FPR < 5.75 reprezentuje populację wirusa nie-R5; mało prawdopodobna odpowiedź na antagonisty CCR5. G2P <2 wskazuje na bardzo niskie prawdopodobieństwo jakiejkolwiek odpowiedzi na antagonisty CCR5. Jeśli którakolwiek z trzech sekwencji z danej próbki zostanie uznana za nie-R5, pacjent prawdopodobnie nie zareaguje na antagonistę CCR5.
10. Reprezentatywne wyniki
Przy prawidłowym wykonaniu protokołu należy spodziewać się pomyślnego zsekwencjonowania 2 lub 3 powtórzeń dla każdej próbki. Kontrole negatywne analizowane wraz z próbkami nie powinny wykazywać obecności RNA. Większość sekwencji powinna przejść proces basecallingu za pomocą programu ReCall.
Biorąc pod uwagę rozkład wirusów R5 i non-R5 w populacji wirusowej w obrębie organizmu, w większości losowo wybranych próbek pacjentów należy spodziewać się obecności wirusa wykorzystującego R5. W związku z tym, o ile projekt badania nie przewiduje inaczej, należy oczekiwać większej liczby próbek R5 niż non-R5.
Tabela 1. A) Objętości odczynników wymagane dla 1 reakcji One Step RT-PCR oraz B) program termocyklera niezbędny do przeprowadzenia reakcji RT-PCR.
A)
Odczynnik | Objętość (μL) (reakcja 1X) |
| Woda traktowana DEPC | 10.56 |
| Bufor reakcyjny 2x | 20 |
| Mieszanina 50% sacharozy i 0,04% błękitu bromofenolowego | 4 |
| Startery forward SQV3F1 | 0.32 |
| Startery reverse CO602 | 0.32 |
| Enzym - SuperScript III One-Step RT-PCR System z polimerazą Platinum Taq DNA | 0.8 |
| Suma | 36 |
*Uwaga:
Sekwencja primera SQV3F1: 5' GAG CCA ATT CCC ATA CAT TAT TGT 3'
Sekwencja primera CO602: 5' GCC CAT AGT GCT TCC TGC TGC TCC CAA GAA CC 3'
B)
| Liczba cykli | Czas | Temperatura |
| 1 | 30 minut | 52°C |
| 1 | 2 minuty | 94°C |
| 40 | 15 sekund | 94°C |
| 30 sekundów | 55°C | |
| 1,5 minuty | 68°C | |
| 1 | 5 minut | 68°C |
Tabela 2. A) Objętości odczynników wymagane dla jednej reakcji drugiej rundy PCR oraz B) program termocyklera niezbędny do przeprowadzenia reakcji drugiej rundy PCR.
A)
Odczynnik | Objętość (μL) (reakcja 1X) |
| Woda traktowana DEPC | 13.45 |
| Mieszanina 60% sacharozy i 0,08% czerwieni krezolowej | 2 |
| Bufor 2 z systemu Roche HiFi | 2 |
| MgCl2 | 0.8 |
| dNTP | 0.16 |
| Starter przedni SQV3F2 | 0.15 |
| Starter odwrotny CD4R | 0.15 |
| Enzym Expand HiFi | 0.29 |
| Suma | 19 |
*Uwaga:
Sekwencja primera SQV3F2: 5' TGT GCC CCA GCT GGT TTT GCG AT 3'
Sekwencja primera CD4R: 5' TAT AAT TCA CTT CTC CAA TTG TCC 3'
B)
Liczba cykli | Czas | Temperatura |
| 1 | 2minutes | 94°C |
| 35 | 15seconds | 94°C |
| 30seconds | 55°C | |
| 1minute | 72°C | |
| 1 | 7minutes | 72°C |
Tabela 3. A) Objętości odczynników wymagane dla jednej reakcji sekwencjonowania oraz B) program termocyklera niezbędny do przeprowadzenia reakcji sekwencjonowania.
A)
| Odczynnik | Objętość (μL) (reakcja 1X) |
| BigDye | 0.3 |
| Bufor BigDye | 2.1 |
| Starter Forward V3FO2F Odwrócenie SQV3R1 | 2.6 |
| Suma | 5.0 |
*Uwaga: NIE łączyć starterów; dla każdego startera należy przygotować osobną mieszaninę
sekwencja startera V3O2F: 5' AAT GTC AGY ACA GTA CAA TGT ACA C 3'
sekwencja startera SQV3R1: 5' GAA AAA TTC CCT TCC ACA ATT AAA 3'
B)
Liczba cykli | Czas | Temperatura |
| 25 | 10 seconds | 96°C |
| 5 seconds | 50°C | |
| 55 seconds | 60°C |
Dyskusja
Metoda przedstawiona w niniejszym opracowaniu jest standardową metodą sekwencjonowania stosowaną w badaniach tropizmu. Zastosowanie kliniczne sekwencjonowania pętli V3 otoczki HIV w celu przewidywania tropizmu wirusa było do niedawna ograniczone. Wykazano, że metoda ta, w analizach retrospektywnych badań klinicznych nad marawirokiem (ViiV Healthcare), pozwala na przewidywanie tropizmu wirusa co najmniej równie skutecznie, jak inne walidowane testy stosowane w praktyce klinicznej.
Wykonanie analizy genotypowej pętli V3 w celu przewidzenia tropizmu niesie ze sobą wiele korzyści. Przede wszystkim procedura ta może być przeprowadzona w każdej placówce dysponującej sprawnym sprzętem do sekwencjonowania, co znacznie zwiększa dostępność i skraca czas oczekiwania na wyniki testów tropizmu. W przeciwieństwie do niej fenotypowy test ESTA (Enhanced Sensitivity Trofile Assay) firmy Monogram Biosciences, który uznawany jest za złoty standard w badaniu tropizmu, jest wykonywany w jednym ośrodku w południowej Kalifornii. Dodatkowe korzyści obejmują wymóg mniejszej ilości materiału wyjściowego oraz minimalną wymaganą wiremię w osoczu na poziomie 500copies/mL. Ponadto koszty operacyjne przeprowadzenia analizy genotypowej są stosunkowo niskie w porównaniu do kosztów analizy fenotypowej. Wykorzystanie oprogramowania ReCall w szczególności eliminuje konieczność ręcznego przeglądu sekwencji, co zazwyczaj jest najbardziej pracochłonnym elementem analiz genotypowych.
Przedstawiona tutaj metoda jest dość prosta i żaden z etapów nie jest ważniejszy od pozostałych. Sugerujemy przeprowadzenie PCR oraz sekwencjonowania w trzech powtórzeniach, aby zwiększyć szansę na wykrycie rzadszych gatunków w obrębie populacji wirusów w próbce. Można wykonać więcej niż trzy powtórzenia, jednak w naszej ocenie potrójne analizy są zarówno efektywne, jak i wiarygodne. Sugerujemy również zastosowanie zestawu One-Step Reverse Transcriptase PCR Kit (Qiagen), który umożliwia przeprowadzenie zarówno RT-PCR, jak i pierwszej rundy PCR w jednej reakcji, zachowując przy tym wysoką czułość i specyficzność.
Oświadczenia
P. Richard Harrigan ma konflikty interesów z ViiV Healthcare, Virco, Merck, Abbott i Quest. Ten artykuł wideo jest sponsorowany przez ViiV Healthcare.
Podziękowania
Opracowanie tego testu było wspierane przez Viiv Healthcare oraz Kanadyjskie Instytuty Badań nad Zdrowiem (CIHR), a także poprzez fundusz GlaxoSmithKline/CIHR Chair in Clinical Virology dla dr. Harrigana.
Wsparcie zapewnione przez Pfizer oraz ViiV Healthcare.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Ekstrakcja RNA przy użyciu zestawu NucliSens easyMAG wersja 1.0 | |||
| NucliSens easyMAG Magnetic Silica | bioMerieux | cat. # 280133 | (48 x 0,6 ml) |
| NucliSens easyMAG Lysis Buffer | bioMerieux | cat. # 280134 | (4 x 1000 ml) |
| NucliSens easyMAG Extraction Buffer 1 | bioMerieux | cat. # 280130 | (4 x 1000 ml) |
| NucliSens easyMAG Extraction Buffer 2 | bioMerieux | cat. # 280131 | (4 x 1000 ml) |
| NucliSens easyMAG Extraction Buffer 3 | bioMerieux | cat. # 280132 | (4 x 1000 ml) |
| NucliSens easyMAG wersja 1.0 | bioMerieux | ||
| Dygestorium biologiczne klasy II A2 | |||
| Jednoetapowa RT-PCR i PCR drugiej rundy | |||
| Woda traktowana DEPC | Ambion | cat. # 9922 | |
| SuperScrip III One-Step RT-PCR System z Platinum Taq High Fidelity | Invitrogen | cat#12574-035 | Wykorzystane komponenty zestawu: - Mieszanka enzymów SuperScript III RT/ Platinum Taq High Fidelity - 2X Reaction Mix (bufor zawierający 0,4mM każdego dNTP, 2,4mM MgSO4) |
| Expand High Fidelity PCR System | Roche Group | cat. # 1 759 078 | Wykorzystane komponenty zestawu: - Bufor Expand High Fidelity 10X z 15 mM MgCl2 (nakrętki oznaczone cyfrą 2) - Mieszanka enzymów Expand HF PCR (3,5U/μl) - Roztwór stokowy MgCl2 (25mM) (nakrętki oznaczone cyfrą 4) |
| dNTP: dATP, dGTP, dCTP, dTTP | Roche Group | cat. # 11969064001 | (100 mM) |
| Sacharoza | Sigma-Aldrich | cat. # S0389-500G | |
| Sól sodowa błękitu bromofenolowego | Sigma-Aldrich | cat.# B5525 | |
| Czerwień krezylowa | Sigma-Aldrich | cat.# 114472-5G | stopień analityczny (wskaźnik) |
| Termocykler | |||
| Elektroforeza żelowa | |||
| Bufor TAE 50X | Invitrogen | cat. # 24710030 | (1000 ml) |
| Barwnik do żeli DNA SYBR Safe | Invitrogen | cat. # S33102 | |
| Agaroza (ultra czysta) | Invitrogen | cat. # 15510-027 | |
| E-Gel Low Range Quantitative DNA Ladder | Invitrogen | cat. # 12373-031 | |
| Woda typu II stopnia reagentowego | |||
| Aparat do elektroforezy | |||
| Sekwencjonowanie | |||
| ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit | Applied Biosciences | cat. # 4337458 | (25000 reakcji) |
| Formamida Hi-Di | Applied Biosciences | cat. # 4311320 | |
| Octan sodu (NaOAc) | Sigma-Aldrich | cat. # S-2889 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | Cat.# 03690-100ML | 0,5M, pH=8,0 |
| Bufor TRIZMA Hydrochloride | Sigma-Aldrich | cat. # T-2819 | 1 M, pH 9,0 |
| Chlorek magnezu (MgCl2) | Sigma-Aldrich | cat. # M-1028 | 1 M |
| 95% etanol | |||
| Bufor do elektroforezy (10X) z EDTA | Applied Biosystems | cat. # 4335613 | 500 mL |
| Polymer Pop-7 (25mL) lub Polymer Pop-7 (10mL) | Applied Biosystems | cat. # 44363929 lub cat. # 4352759 | |
| 3700/3730 BigDye Terminator v3.1 Sequencing Standard Kit | Applied Biosciences | Cat# 4336943 | |
| Termocykler | |||
| Wirówka z uchwytami na płytki | |||
| Analizator DNA 3730xl | Applied Biosciences |
Bibliografia
- Feng, Y., Broder, C. C., Kennedy, P. E. HIV-1 entry cofactor: functional cDNA cloning of a seven transmembrane, G protein-coupled receptor. Science. 272, 872-877 (1996).
- Dragic, T., Litwin, V., Allaway, G. P. HIV-1 entry into CD4+ cells is mediated by the chemokine receptor CC-CKR-5. Nature. 381, 667-673 (1996).
- Dorr, P., Westby, M., Dobbs, S. Maraviroc (UK-427,857), a potent, orally bioavailable, and selective small-molecule inhibitor of chemokine receptor CCR5 with broad-spectrum anti-human immunodeficiency virus type 1 activity. Antimicrob. Agents Chemother. 49, 4721-4732 (2005).
- Gulick, R. M., Lalezari, J., Goodrich, J. Maraviroc for previously treated patients with R5 HIV-1 infection. N. Engl. J. Med. 359, 1429-1441 (2008).
- Cooper, D. A., Heera, J., Goodrich, J. Maraviroc versus efavirenz, both in combination with zidovudine/lamivudine, for the treatment of antiretroviral-naíve subjects with CCR5-tropic HIV-1. J. Infect. Dis. 201, 803-813 (2010).
- Low, A. J., McGovern, R. A., Harrigan, P. R. Trofile HIV co-receptor usage assay. Expert Opin. Med. Diagnostics. 3, 181-191 (2000).
- Sing, T., Low, A. J., Beerenwinkel, N. Predicting HIV co-receptor usage based on genetic and clinical covariates. Antiviral Ther. 12, 1097-1106 (2007).
- Screening for HIV tropism using population-based V3 genotypic analysis: a retrospective virological outcome analysis using stored plasma screening samples from MOTIVATE-1. Harrigan, P. R., McGovern, R., Dong, W. 5th International AIDS Society Conference, 2009 19-22 July, Cape Town, South Africa, , (2009).
- Optimization of clinically relevant cut-points for the determination of HIV co-receptor usage to predict maraviroc responses in treatment experienced (TE) patients using population V3 genotyping. Harrigan, P. R., McGovern, R., Dong, W. 12th European AIDS Conference, 2009 11-14 Nov, Cologne, Germany, , (2009).
- Optimization of clinically relevant cutoffs for determining HIV co-receptor use by population and "deep" sequencing methods. Swenson, L. C., McGovern, R. A. 47th Annual Meeting of the Infectious Diseases Society of America, 2009 Oct 29 - Nov 1, Philadelphia, PA, USA, , (2009).
- Phenotypic screening for HIV tropism versus both population-based and "deep" sequencing. Swenson, L., McGovern, R., Dong, W. 49th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2009 12-15 Sept, San Francisco, CA, , (2009).
- Swenson, L. C., Moores, A., Low, A. J., Thielen, A., Dong, W., Woods, C., Jensen, M. A., Wynhoven, B., Chan, D., Glascock, C., Harrigan, P. R. Improved Detection of CXCR4-Using HIV by V3 Genotyping: Application of Population-based and 'Deep' Sequencing to Plasma RNA and Proviral DNA. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 54, 506-510 (2010).
- Swenson, L. C., Boehme, R., Thielen, A., McGovern, R. A., Harrigan, P. R. Genotypic determination of HIV-1 tropism in the clinical setting. HIV Therapy. 4, 293-303 (2010).
Przedruki i uprawnienia
