Pasywna administracja przeciwciał monoklonalnych przeciwko H. capsulatum oraz innym patogenom grzybiczym

Podsumowanie

Do badania patogenezy Hc wykorzystano myszy C57BL/6, które stanowią najlepszy model. Badamy potencjalne korzyści z odporności humoralnej przeciwko temu grzybowi i wytworzyliśmy kilka przeciwciał monoklonalnych (mAbs) [przeciwko histonie H2B oraz białku szoku termicznego 60kDa], których skuteczność ochronną przetestowano po podaniu domięśniowym.

Streszczenie

Celem zastosowania tej metodologii jest 1) zwiększenie naszych możliwości ochrony osób za pomocą przeciwciał lub szczepionki w celu zapobiegania lub leczenia histoplazmozy wywoływanej przez grzyb Histoplasma capsulatum oraz 2) zbadanie roli czynników wirulencji jako celów terapeutycznych. Aby uzyskać przeciwciała monoklonalne (mAbs), immunizuje się myszy, ocenia odpowiedzi immunologiczne za pomocą systemu ELISA w fazie stałej opracowanego w naszym laboratorium, a następnie wybiera myszy o najlepszej odpowiedzi w celu izolacji splenocytów do fuzji z komórkami hybridoma. Myszy C57BL/6 są szeroko wykorzystywane do badania patogenezy H. capsulatum i stanowią najlepszy model do uzyskania wymaganych danych. W celu oceny roli mAbs w infekcji, myszom podaje się doprzewnowszykowo albo mAb przeciwko H. capsulatum, albo kontrolne mAb o zgodnym izotypie, a następnie zaraża się je drogą dożylną (i.v.), doshywną (i.p.) lub donosową (i.n.). W literaturze naukowej skuteczność mAbs w przypadku infekcji grzybiczych u myszy opiera się na śmiertelności jako punkcie końcowym, w połączeniu z oceną jednostek tworzących kolonie (CFU) w wcześniejszych punktach czasowych. Badania przeżywalności (czas do śmierci) są niezbędne, ponieważ najlepiej odzwierciedlają przebieg choroby u ludzi. Zatem skuteczność naszej interwencji nie zostałaby w sposób odpowiedni ustalona bez krzywych przeżywalności. Dotyczy to również ustalania skuteczności szczepionki lub testowania mutantów pod kątem wirulencji. W przypadku histoplazmozy myszy często przechodzą ze stanu wysokiej aktywności do śmierci w ciągu kilku godzin. Zdolność interwencji, takiej jak podanie mAb, może początkowo chronić zwierzę przed chorobą, ale choroba może nawrócić, co nie zostałoby zauważone w krótkotrwałych eksperymentach CFU. Oprócz testów przeżywalności i obciążenia grzybiczego, badamy odpowiedzi zapalne na infekcję (histologia, rekrutacja komórkowa, odpowiedzi cytokinowe). W eksperymentach dotyczących przeżywalności/czasu do śmierci, myszy są zarażane i monitorowane co najmniej dwa razy dziennie pod kątem objawów zachorowania. W celu oceny obciążenia grzybiczego, histopatologii i odpowiedzi cytokinowych, myszy są uśpione w różnych odstępach czasu po infekcji. Doświadczenia na zwierzętach są przeprowadzane zgodnie z wytycznymi Instytutu Badań nad Zwierzętami Albert Einstein College of Medicine.

Protokół

1. Hodowla H. Capsulatum

1. Przygotować komorę bezpieczeństwa biologicznego do pracy z grzybem, oczyszczając ją 10% roztworem wybielacza, a następnie naświetlając promieniami UV przez 20 min. H. capsulatum w fazie drożdżakowej wymaga praktyk poziomu bezpieczeństwa biologicznego (BSL) II, natomiast forma strzępkowa wymaga BSLIII. W kolejnych krokach należy używać formy drożdżakowej.
2. Następnie przygotować probówkę stożkową 15 ml z 5 ml PBS. Pobrać kolonię H. capsulatum (szczep Hc ATCC G217B) z płytki z agarem BHI z krwią [glukoza 10 g/L, cysteina 0,1 g/L, penicylina-streptomycyna 1% i owcze erytrocyty 50 ml/L (Colorado Serum Co., Colorado, USA)] hodowanej w 37°C lub pobrać aLIKwot z zamrożonego banku drożdżaków w -80°C i dodać do PBS. Komórki intensywnie wymieszać na wortexie i wirować przy 1100 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usunąć nadosad, nie naruszając osadu, i dodać 10 mL świeżego PBS. Powtórzyć tę procedurę trzy razy. Resuspendować komórki w 5 mL PBS i przenieść do probówki stożkowej 50 mL.
3. Aby rozbić agregaty komórkowe, przepuścić zawiesinę komórek drożdżaków przez igłę 26G1/2 za pomocą strzykawki 10 mL pięć razy w komorze bezpieczeństwa biologicznego (stosując ochronę twarzy). Aby wyizolować małe, jednorodnie wielkościowe drożdżaki, wirować komórki przy 55 x g przez 1 min w temperaturze pokojowej, a następnie usunąć górne 1 ml.
4. Dodać zawiesinę komórkową do sterylnej kolby Erlenmeyera zawierającej 100 ml pożywki HAM F12 (GIBCO) uzupełnionej o 16 g/L glukozy, 1 g/L kwasu glutaminowego, 8,4 mg/L cystyny oraz 6 g/L kwasu glutaminowego, a następnie hodować komórki w 37°C przez 48 h w inkubatorze z wytrząsaniem przy 150 rpm.

2. Hodowla hybridom i oczyszczanie przeciwciał monoklonalnych

1. Przenieść wybrane hybridomy do pożywki DMEM zawierającej 10% płodowej surowicy cielęcej, 10% NCTC, 1% nieessentialnych aminokwasów oraz 1% penicyliny i streptomycyny. Hodować komórki w kolbie do hodowli komórkowej (Becton Dickenson) przez 5-7 dni w temperaturze 37°C/5%CO₂.
2. Następnie odwirować pożywkę z prędkością 1100 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej i zebrać cały nadsącz, uważając, aby nie naruszyć osadu.
3. W kolejnym kroku oczyścić nadsącz pozbawiony komórek przy użyciu żywicy białka A/G metodą FPLC.
4. Stężenie mAb można następnie obliczyć za pomocą testu capture ELISA (1), stosując kontrolę izotypu IgG jako wzorzec (Rycina 1B).

3. Przygotowanie Histoplasma Capsulatum inokulum

1. Odczekać 48 h Histoplasma capsulatum (szczep Hc kultura fazy drożdżowej (ATCC G217B) hodowana w medium HAM F-12.
2. Wirować komórki przy 1100 x g przez 10 min. Odlać nadsącz i dodać świeży PBS.
3. Powtórz procedurę 3.2 trzykrotnie.
4. Przepuść zawiesinę komórek drożdży 5 razy przez igłę 26G1/2 za pomocą strzykawki.
5. Wirować zawiesinę z prędkością 55 x g przez 1 min, aby odwirować pozostałe skupiska komórek. Przenieść nadsącz zawierający zawiesinę pojedynczych komórek do nowej probówki.
6. Policz komórki w zawiesinie jednokomórkowej przy użyciu hematocytometru.
7. Dostosuj stężenie komórek, aby uzyskać 1,25 x 10⁷ drożdże (przeżywalność) lub 5,0 x 10⁶ (JCF, cytokiny i histologia) w zawiesinie <50 μL (Rycina 2).

4. Podanie domięśniowe przeciwciał monoklonalnych (MAbs)

1. Chwyć mysz za ogon i kark (Rys. 3A). Unieruchom mysz, chwytając ją za kark jak najbliżej uszu (należy ująć wystarczającą ilość skóry, aby mysz nie mogła obrócić głowy i ugryźć osoby ją trzymającej; Rysunek 3B i 3C).
2. Stabilizuj ogon, delikatnie dociskając go małym palcem do wnętrza dłoni (Rysunek 3D).
3. Przed wprowadzeniem igły przemyj miejsce wstrzyknięcia 70% etanolem, a następnie wykonaj aspirację, aby sprawdzić, czy nie pojawi się krew przed podaniem preparatu.
4. Używając igły 26G1/2, przebij skórę i mięśnie brzucha, aby wstrzyknąć roztwór mAb zawierający 500μg (PBS, przeciwciało kontrolne izotypowe lub testowane mAb, rozcieńczone w 1 mL PBS) do dolnej lewej lub dolnej prawej ćwiartki brzucha (jama otrzewnowa). Zwierzę powinno znajdować się w pozycji z głową skierowaną w dół; należy zachować ostrożność, aby nie uszkodzić przepony ani innych narządów wewnętrznych (Rysunek 3E).
5. Przed wycofaniem igły odczekaj chwilę, aby zmniejszyć ryzyko wycieku preparatu.
6. Odczekaj minimum dwie godziny przed przejściem do następnego kroku.

5. Znieczulenie myszy i infekcje donosowe

1. Przygotować znieczulenie z ketaminy i ksylazyny w dawkach odpowiednio 100 mg/Kg i 10 mg/Kg. Wykonać podanie dootrzewnowe PBS, przeciwciała kontrolnego izotypowego lub przeciwciała eksperymentalnego zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole pisemnym. Odczekać dwie godziny po wstrzyknięciu mAb przed znieczuleniem myszy i przystąpieniem do infekcji donosowej.
   
   Przygotować znieczulenie z ketaminy i ksylazyny w dawkach odpowiednio 100 mg/Kg i 10 mg/Kg (7).
    
2. W trakcie 2-godzinnego okresu oczekiwania przygotować inokulum Histoplasma capsulum zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole pisemnym.
3. Postępować zgodnie z punktami od 5.1 do 5.5. Ścisnąć pęsetą palec u nogi zwierzęcia, aby zweryfikować brak odruchu i potwierdzić działanie znieczulenia. Po znieczuleniu delikatnie zawiesić mysz za przednimi zębami na nylonowej lub bawełnianej sznurówce. Do zawieszenia zwierząt użyć dwóch statywów kolumnowych do przywiązania sznurków.
4. Powoli podać około 50 μl inokulum do nozdrza za pomocą mikropipety, ściśle monitorując częstotliwość oddechów myszy. Pozostawić mysz w tej pozycji przez 2-5 min po infekcji donosowej, aby ułatwić osadzanie się drożdżaków w płucach zwierzęcia (Rysunek 3F).
5. Po zainfekowaniu myszy utrzymywać ją w monitorowanym, ciepłym środowisku (temperatura od 25 do 37°C), w razie potrzeby ostrożnie stosując lampę grzewczą, aż do momentu wybudzenia z narkozy. Po przebudzeniu myszy przenieść ją do czystej klatki z dostępem ad libitum do pokarmu i wody. Klatki zostają zwrócone do naszego pomieszczenia dla zwierząt i przechowywane w czystym pomieszczeniu dla zwierząt (BLSI).

6. Badania przeżywalności

1. Oceniaj stan kliniczny zwierząt zainfekowanych i pozornie zainfekowanych pod kątem tachypnoe, letargu, otępienia oraz utraty masy ciała. Zwierzęta powinny być sprawdzane dwa razy dziennie przez członków laboratorium i codziennie przez opiekunów zwierząt.
2. W przypadku histoplazmozy mysiej, aż do okresu bliskiego śmierci, zazwyczaj nie występują żadne wyraźne objawy infekcji poza łagodnym wzrostem częstości oddychania. W stadium zaawansowanym, które zwykle następuje między 10. a 11. dniem, u myszy pojawia się znaczna tachypnoe oraz obniżona aktywność. Zazwyczaj zwierzęta szybko stają się konające i giną.
3. Zwierzęta w stanie cierpienia należy odpowiednio uśpić za pomocą CO₂ w dedykowanej komorze. Liczbę martwych zwierząt należy odnotowywać codziennie.

7. Badania CFU, histologia i badania cytokin

1. Przygotować probówki stożkowe 15 ml zawierające 10 mL PBS dla każdego organu przeznaczonego do pobrania.
2. Uśmiercić zwierzęta 7 i 14 dni po zakażeniu subletalną dawką inokulum (5.0 x 10⁶), zgodnie z wcześniej opisaną procedurą, a następnie niezwłocznie pobrać płuca, śledzionę i wątrobę.
3. Odciąć fragment organu do oceny i utrwalić go w formalinie przez noc. Przekroje zostaną poddane badaniu mikroskopowemu w celu oceny patomorfologicznej.
4. Przygotować probówki stożkowe 50 ml zawierające 5 mL PBS, wyposażone w sitka komórkowe 70 μm, dla każdego organu przeznaczonego do homogenizacji. Pozostałe części organów macerować oddzielnie w probówkach 50 mL, używając sterylnych tłoków strzykawek 5 mL.
5. Następnie wykonać rozcieńczenia seryjne homogenatów organów (1:100, 1:1000 i 1:5000) i wysiać 100 μL każdego rozcieńczenia na płytki z agarem BHI-krew (2).
6. Do homogenatów dodać tabletki z inhibitorem proteaz zgodnie z instrukcją producenta (Roche, Niemcy).
7. Inkubować płytki w temperaturze 37°C do 14 dni i zliczyć CFU.
8. Homogenaty organów wirować przy 4000xg przez 10 min i zebrać nadsączniki, które zostaną wykorzystane w analizach cytokin przeprowadzonych standardowymi metodami zgodnie z instrukcją producenta.

8. Ochrona przeciwko H. capsulatum za pomocą przeciwciał monoklonalnych zależy od specyficzności i izotypu przeciwciał

1. Izotyp przeciwciał monoklonalnych (MAb) ma kluczowe znaczenie dla ochrony przed H. capsulatum, ponieważ myszy leczone przeciwciałami monoklonalnymi IgG1 lub IgG2a przeciwko Hsp60 wykazały znacznie dłuższe przeżycie w porównaniu z myszami kontrolnymi, które otrzymały przeciwciało monoklonalne IgG2b przeciwko Hsp60, przeciwciało kontrolne izotypowe lub PBS (Rycina 4).
2. Ponadto, u myszy, które otrzymały ochronne przeciwciała monoklonalne, odnotowano znaczną redukcję liczby CFU w płucach i śledzionie w 7. dniu oraz spadek liczby drożdżaków w płucach o 2 i 2,5 jednostki logarytmicznej w 14. dniu (Rycina 5).

Rycina 1: Wzrost H. capsulatum i hybridomów. (A) Przygotowanie hodowli płynnej HAM F-12 z pojedynczej kolonii uzyskanej z H. capsulatum hodowanego na płytkach z agarem BHI z krwią. (B) Wzrost hybridomów w kolbach do hodowli komórkowej i oczyszczanie mAb przy użyciu żywicy białka A/G z zastosowaniem chromatografii powinowactwa.

Rysunek 2: H. capsulatum przygotowanie inokulum do zakażenia donosowego. Zawiesinę komórkową uzyskaną po rozbiciu agregatów H. capsulatum za pomocą strzykawki i wirowaniu zlicza się przy użyciu komory licznikowej. Stężenie komórek dostosowuje się do 1,25 x 10⁷ (do doświadczeń nad przeżywalnością) lub 5 x 10⁶ (do wyznaczania CFU, cytokin i badań histologicznych) w objętości <50 μL.

Rycina 3: Obsługa myszy podczas podawania przeciwciał mAb. (A) Myszy podnosi się za ogon i (B i C) unieruchamia, chwytając za kark jak najbliżej uszu. (D) Ogon trzyma się między małym palcem a dłonią. (E) Roztwór mAb wstrzykuje się za pomocą igły 26G1/2. (F) Inokulum H. capsulatum podaje się donosowo, delikatnie wpipetowując zawiesinę komórkową do nozdrza.

Rycina 4: Przeciwciała monoklonalne (MAbs) przeciwko Hsp60 mogą zmieniać patogenezę histoplazmozy. Iniekcje i.p. z 500 μg IgG1 lub IgG2a mAbs na 2 h przed zakażeniem znacząco przedłużyły przeżywalność (p<0.05 w porównaniu z grupami kontrolnymi), natomiast nie zrobiło tego mAb IgG2b.

Rycina 5: Oznaczenia JCF w płucach w 7. i 14. dniu po subletalnym podaniu donosowym 5x10⁶ drożdżaków Hc u myszy leczonych d.o. wybranymi przeciwciałami mAb przeciwko Hsp60 lub nieistotnym przeciwciałami mAb wykazały redukcję obciążenia grzybiczego u zwierząt leczonych przeciwciałami mAb IgG1 i IgG2a. Czarne słupki reprezentują JCF w 7. dniu, a białe słupki w 14. dniu po infekcji (*p<0.001 w 7. dniu i **p<0.001 w 14. dniu po infekcji).

Dyskusja

Przedstawiony tutaj protokół wykazuje, że przeciwciała monoklonalne (mAb) przeciwko H. capsulatum mogą modyfikować przebieg eksperymentalnej histoplazmozy u myszy. Przeciwciała monoklonalne skierowane przeciwko antygenom powierzchni komórkowej patogenów mogą modyfikować złożoną dynamikę zachodzącą podczas interakcji między gospodarzem a patogenem. Niniejsze badanie potwierdza, że przeciwciała monoklonalne zapewniają ochronę w mysim modelu śmiertelnej histoplazmozy po wstrzyknięciu do otrzewnej, a także wskazuje ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kabineta bezpieczeństwa biologicznego (BSL2)
Probówki stożkowe 15 mL	Falcon BD
Pożywka HAM F-12	GIBCO, by Life Technologies
Inkubator z wytrząsaniem 37°C
Wiertarka laboratoryjna (vortex)
Probówki stożkowe 50 mL	Falcon BD
Igła 26G1/2	BD Biosciences
Strzykawka 10 mL	BD Biosciences
Kolby 250 mL
System FPLC (Szybka chromatografia cieczowa białek)	GE Healthcare
Czytnik ELISA	BioTek
Znieczulenie (ketamina i ksylazyna)
Statywy do kolumn
Sznurek nylonowy
Lampa grzewcza
Sita komórkowe 70μm	Falcon BD
Płytki z agarem BHI	GIBCO, by Life Technologies