Hybrydyzacja in situ całego preparatu (WISH) została zastosowana w ramach zaawansowanego kursu biologii porównawczej kręgowców dla studentów studiów licencjackich, jako uzupełnienie sekcji kręgowców. Dzięki temu studenci mieli możliwość zbadania wzorców ekspresji genów oraz anatomii makroskopowej, co pozwoliło na powiązanie badań nad biologią molekularną i organizmalną w ramach jednego kursu.
Artykuł metodologiczny
Zastosowanie preparatów całych (Whole Mount) in situ Hybrydyzacja w celu powiązania biologii molekularnej i organizmalnej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Hybrydyzacja in situ w preparatach całych (WISH) jest powszechną techniką w laboratoriach biologii molekularnej, stosowaną do badania ekspresji genów poprzez lokalizację specyficznych transkryptów mRNA w całych preparatach. Technika ta (zaadaptowana z Albertson i Yelick, 2005) została wykorzystana w ramach zajęć laboratoryjnych z biologii porównawczej kręgowców dla studentów wyższych lat studiów licencjackich na Uniwersytecie w Syracuse. Pierwsze dwie trzecie kursu laboratoryjnego z biologii porównawczej kręgowców dawały studentom możliwość zapoznania się z embriologią i anatomią makroskopową kilku organizmów reprezentujących różne taksony strunowców, głównie poprzez tradycyjne sekcje i wykorzystanie modeli. Końcowa część kursu obejmowała innowacyjne podejście do nauczania anatomii poprzez obserwację rozwoju kręgowców z wykorzystaniem technik molekularnych, w ramach których przeprowadzono WISH na embrionach danio pręgowanego. Wykorzystano heterozygotyczną linię mutantów czynnika wzrostu fibroblastów 8 a (fgf8a), ace. Zgodnie z dziedziczeniem mendlowskim, krzyżówki w obrębie linii ace dawały osobniki typu dzikiego, heterozygoty oraz mutanty homozygotyczne ace/fgf8a w stosunku 1:2:1. Zastosowano sondy RNA o znanych wzorach ekspresji w linii środkowej oraz w rozwijających się strukturach anatomicznych, takich jak serce, somity, pączek ogonowy, miotom i mózg. WISH przeprowadzono na danio pręgowanym w stadiach 13 somitów oraz prim-6, przy czym studenci przeprowadzali reakcję barwienia podczas zajęć. Badanie embrionów danio pręgowanego na różnych etapach rozwoju umożliwiło studentom obserwację zmian zachodzących w tych strukturach anatomicznych w trakcie ontogenezy. Ponadto u niektórych mutantów ace/fgf8a zaobserwowano nieprawidłowe zapętlenie serca oraz wady rozwoju somitów i mózgu. Studenci w tym laboratorium obserwowali prawidłowy rozwój różnych układów narządowych, opierając się zarówno na anatomii zewnętrznej, jak i na wzorach ekspresji genów. Identyfikowali i opisywali również embriony wykazujące nieprawidłowy rozwój anatomiczny i ekspresję genów (tj. domniemane mutanty).
W przypadku instruktorów w placówkach, które nie posiadają niezbędnego sprzętu lub gdzie fundusze na innowacje laboratoryjne i programowe są ograniczone, koszty finansowe odczynników i aparatury mogą być czynnikiem wartym rozważenia, podobnie jak czas i wysiłek wymagany ze strony instruktora, niezależnie od warunków. Niemniej jednak uważamy, że zastosowanie metody WISH w tego typu zajęciach laboratoryjnych może stanowić istotny pomost między genetyką rozwoju a anatomią. Wraz z postępem technologicznym oraz tym, że badanie rozwoju organizmów na poziomie molekularnym staje się łatwiejsze, tańsze i coraz bardziej popularne, wielu biologów ewolucyjnych, ekologów i fizjologów zwraca się ku strategiom badawczym z zakresu biologii molekularnej. Wykorzystanie WISH w ramach zajęć laboratoryjnych z porównawczej biologii kręgowców jest przykładem tego, jak cząsteczki i anatomia mogą zbiegać się w ramach jednego kursu. Daje to studentom wyższych lat studiów możliwość praktykowania nowoczesnych technik badawczych w biologii, co prowadzi do bardziej zdywersyfikowanej edukacji i promowania przyszłych interdyscyplinarnych badań naukowych.
Protokół
1. Transformacja plazmidowa docelowego cDNA
Część I: Transformacja plazmidu
(Wymagany czas: 3 godziny plus inkubacja przez noc)
- Podgrzej pożywkę SOC w kąpieli wodnej o temperaturze 42°C (500 μL na reakcję)
- Rozmroź kompetentne komórki na lodzie
- Dodaj 1 μL plazmidu do 25 μL kompetentnych komórek
- Pozostaw na lodzie przez 20 minut
- Przeprowadź szok termiczny komórek w kąpieli wodnej o temperaturze 42°C przez 45 sekund
- Natychmiast umieść komórki na lodzie na 2 minuty
- Dodaj 500 μL pożywki o temperaturze 42°C do każdej probówki z komórkami
- Inkubuj z wytrząsaniem w temperaturze 37°C przez 2 godziny przy prędkości 255 obrotów na minutę (rpm)
- Wysiej 75 μL mieszaniny transformacyjnej na płytki z agarem Luria Bertani (LB)
- Inkubuj płytki w pozycji odwróconej w temperaturze 37°C przez noc
Część II: Hodowla E. coli
(Wymagany czas: 15 minut plus inkubacja przez noc)
- Do każdej probówki hodowlanej odmierzyć 3 mL bulionu LB oraz 3 μL ampicyliny o stężeniu 50 mg/mL
- Z pobrać jedną kolonię bakterii z płytki agarowej i przenieść ją do każdej probówki hodowlanej
- Inkubować probówki hodowlane w temperaturze 37°C przy 255 rpm przez noc
Część III: Izolacja plazmidów
(Czas wymagany: 1,5 godziny)
- Wyizolować plazmid z kultur nocnych, korzystając z zestawu 5 Prime FastPlasmid Mini Kit (Catalog #2300000)
- Aby sprawdzić obecność przygotowanego plazmidu, należy poddać DNA wyeluowanego z zestawu elektroforezie na żelu 1% Tris-Acetate-EDTA (TAE) barwionym bromkiem etydyny
2. Synteza sondy RNA znakowanej DIG do hybrydyzacji in situ
Część I: Linearyzacja plazmidu
(Wymagany czas: 2,5 godziny)
- W probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1.5 mL połączyć:
Przygotowany plazmid 20 mL Enzym restrykcyjny* 2 mL Bufor** 10 mL 10X Bovine Serum Albumin (BSA) 10 mL Woda DEPC (Diethyl Pyrocarbonate) 58 mL 100 mL - Inkubować w temperaturze 37°C przez 2 godziny
*Zależnie od plazmidu
**Zależnie od enzymu restrykcyjnego
Część II: Transkrypcja
(Wymagany czas: 3 godziny)
- W probówce do mikrowirówki o pojemności 1.5 mL połączyć:
Plazmid liniowy 4 mL Bufor do transkrypcji 10X** 4 mL Mieszanina znakująca Digoxigenin 4 mL Polimeraza* 2 mL Inhibitor RNazy 2 mL Woda DEPC 24 mL 40 mL - Inkubować w temperaturze 37°C przez 1 godzinę
- Dodać 2 μL polimerazy*
- Inkubować w temperaturze 37°C przez 1 godzinę
- Dodać 2 μL DNazy
- Inkubować w temperaturze 37°C przez 20 minut
*Zależne od plazmidu
**Zależne od polimerazy
Część III: Wytrącanie
(Wymagany czas: 5 minut oraz od 2 godzin do inkubacji nocnej, 1 godzina na wirowanie i ponowne zawieszenie)
- Dodać 4 μL 0.2M EDTA
- Dodać 5 μL 4M chlorku litu
- Dodać 150 μL lodowatego 100% etanolu
- Inkubować w temperaturze -80°C od 2 godzin do całej nocy
- Wirować przy 14 000 rpm przez 30 minut w temperaturze 4°C, a następnie odlać nadsącz
- Suszyć osad przez 7 minut
- Resuspendować w 20 μL wody z DEPC
- Inkubować w temperaturze 37°C przez 5 minut
Część IV: Frakcjonowanie – przeprowadzić tylko w przypadku, gdy rozmiar sondy przekracza 0.6 kb
(Wymagany czas: Zależny od rozmiaru sondy, zazwyczaj nie więcej niż 20 minut)
- W probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1.5 mL połączyć:
Sonda RNA 20 mL Woda z DEPC 12 mL Wodorowęglan sodu 4 mL Węglan sodu 4 mL 40 mL - Inkubować w kąpieli wodnej o temperaturze 60°C. Czas inkubacji wyznaczyć na podstawie równania:
Czas (min.) = (początkowe kb - pożądane kb) / (.11 x początkowe kb x pożądane kb)
Średnia pożądana wielkość = 0.6 kb
Część V: Wytrącanie końcowe
(Wymagany czas: 5 minut plus od 2 godzin do inkubacji przez noc, 1 godzina na wirowanie i ponowne zawieszenie, 1 godzina na elektroforezę w żelu)
- Dodać 40 μL wody DEPC
- Dodać 8 μL octanu sodu
- Dodać 1,04 μL octu lodowatego
- Dodać 240 μL lodowatego 100% etanolu
- Inkubować w temperaturze -80°C od 2 godzin do całej nocy
- Wirować przy 14 000 rpm przez 30 minut w temperaturze 4°C, a następnie odlać nadsącz
- Osuszyć osad przez 7 minut
- Resuspender w 20 μL wody DEPC
- Wymieszać za pomocą vortexa
- Aby sprawdzić obecność sondy rybonukleinowej, poddać zresuspenderowany roztwór elektroforezie na żelu 1% TAE barwionym bromkiem etydyny
3. Hybrydyzacja in situ całego preparatu
Część I: Fixacja embrionów i trawienie proteinazą K
(Wymagany czas: fiksacja przez noc, a następnego dnia 4 godziny na przechowywanie, 2,5 godziny od momentu przechowywania do Części II)
- Zebrać zarodki danio pręgowanego o określonym stadium rozwoju i utrwalić w 4% paraformaldehydzie (PFA) przez noc w temperaturze 4°C
- Przemyć utrwalone zarodki 3 razy przez 10 minut w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym zawierającym 0,1% Tween-20 (PBSt)
- Aby zapewnić ekspozycję zarodków na odczynniki eksperymentalne, w razie potrzeby przeprowadzić ręczne usuwanie otoczek (dechorionację) za pomocą pęsety z cienkimi końcówkami
- Odwodnić zarodki, przemywając je w serii roztworów metanolu w PBSt o stężeniach 25% i 50% przez jedną godzinę dla każdego etapu, a następnie przechowywać w 100% metanolu w temperaturze -20°C
- Przed użyciem nawodnić zarodki w PBSt, przemywając je w 50% (2 razy) i 25% (1 raz) metanolu w PBSt przez 10 minut na każdy etap. Na koniec przemyć 2 razy po 10 minut w 100% PBSt. Dokładny czas przemywania PBSt/metanolem nie jest krytyczny
- Jeśli jest to konieczne, odbarwić zarodki w 10% roztworze nadtlenku wodoru w PBSt w celu usunięcia ciemnych pigmentów. Zarodki powinny inkubować w roztworze nadtlenku wodoru przez 10-20 minut, zależnie od wieku zarodka; nakrętka probówki do mikrocentryfugi powinna pozostać otwarta, aby zapobiec wzrostowi ciśnienia powietrza
- Przetrawić zarodki za pomocą 50 mg/mL Proteinazy K rozcieńczonej 1:5000 w PBSt przez 3-15 minut, zależnie od wieku zarodka
- Ponownie utrwalić zarodki w 4% PFA przez 30 minut, a następnie przemyć 3 razy w PBSt po 5 minut każdy
Część II: Hybrydyzacja sond ryboprobowych
(Wymagany czas: 3 godziny oraz noc na hybrydyzację, 1,5 godziny następnego dnia do Części III)
- Przeprowadzić prehybrydyzację embrionów w roztworze do prehybrydyzacji (PHS) w podgrzanej do 70°C łaźni wodnej przez 2-3 godziny
- Usunąć PHS, dodać 0,5 mL roztworu do hybrydyzacji oraz 1,5 μL wcześniej zsyntetyzowanych sond ryboprobowych znakowanych digoksigeniną i inkubować w 70°C przez noc. Temperatura może wahać się o kilka stopni w zależności od celu ryboproby
- Następnego dnia przemyć embriony w 70°C w stopniowanych roztworach PHS o stężeniach 75%, 50% i 25% w 2X SSC (saline-sodium citrate) przez 10 minut każdy, a następnie przemyć w 0,2X SSC przez 30 minut w 68°C
- Przemyć w buforze kwasu maleinowego (MAB) 2 razy po 10 minut w temperaturze pokojowej
Część III: Inkubacja z przeciwciałem przeciwko digoksigeninie (α-DIG)
(Wymagany czas: 3 godziny oraz blokowanie przez noc, 2,5 godziny następnego dnia do Części IV)
- Przenieś embriony na płytkę 12-dołkową
- Przeprowadź wstępne blokowanie embrionów w 1-2 mL roztworu blokującego przez co najmniej 3 godziny w temperaturze pokojowej
- Jednocześnie wykonaj wstępne blokowanie przeciwciała, przygotowując drugą porcję roztworu blokującego i rozcieńczając w nim przeciwciało anty-digoksygeninę w stosunku 1:2000
- Usuń roztwór do wstępnego blokowania i dodaj 1-2 mL wstępnie zablokowanego roztworu α-DIG, a następnie inkubuj przez noc w temperaturze 4°C
- Następnego dnia przemyj embriony w MAB. Pozostaw embriony do inkubacji w MAB na 5 minut, a następnie wymieniaj bufor i inkubuj w dwóch 10-minutowych, jednym 30-minutowym i jednym 60-minutowym odstępie czasu. Dokładne zachowanie czasu nie jest konieczne
- Przemyj embriony 3 razy przez 5 minut każdy w buforze do fosfatazy alkalicznej (AP)
Część IV: Barwienie i końcowe przetwarzanie
(Wymagany czas: od 1 godziny do całej nocy na barwienie, w zależności od użytej sondy ryboprobowej, 4 godziny do rozpoczęcia przemywania glicerolem, 6-10 godzin na każde przemywanie glicerolem, można przechowywać w glicerolu)
- Do zarodków dodać 1-2 mL roztworu barwiącego, owinąć płytkę folią i sprawdzać stopień zabarwienia w regularnych odstępach czasu (około co 20 minut), aż do uzyskania wystarczającego natężenia barwy
- Zarodki przemyć 2 razy w PBSt przez 5 minut każdy, aby zatrzymać reakcję barwienia
- Zarodki odwodnić, przemywając je przez 10 minut w 25% (1 raz) i 50% (2 razy) metanolu w PBSt, a następnie w 100% metanolu, aby usunąć zabarwienie tła
- Inkubować zarodki w 100% metanolu przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej
- Rehydratować w PBSt, przemywając przez 10 minut w 50% (2 razy) i 25% (1 raz) metanolu w PBSt, a następnie przemyć 2 razy w 100% PBSt
- Przenieść zabarwione zarodki do 80% roztworu glicerolu w PBSt, stosując szereg przemywań o stopniowanym stężeniu, i przechowywać w 4°C.
Przepisy:
- Szybkie płytki agarowe LB – 10 g agaru LB + 250 mL wody destylowanej, autoklawowanie, po ostygnięciu do temperatury bezpiecznej w dotyku dodać 250 μL ampicyliny, wlać 15-20 mL ciepłego roztworu do każdej szalki Petriego, pozostawić agar do stężenia
- Pożywka płynna LB – 12,5 g pożywki LB + 200 mL wody destylowanej, autoklawowanie, pozostawić do ostygnięcia przed użyciem
- Żel 1% TAE – 0,4 g agarozy, 40 mL 1X TAE, 2 μL bromku etydyny; nanieść 7 μL plazmidu (Transformacja plazmidowa docelowego cDNA) lub 3 μL ryboprody i 4 μL wody DEPC (Synteza sondy RNA znakowanej DIG In situ) + 1 μL barwnika do ładowania, 5 μL drabinki DNA
- Roztwór do prehybrydyzacji – 50% formamid, 5X SSC, 9,2mM kwasu cytrynowego, 1% Tween-20
- Roztwór do hybrydyzacji – roztwór do prehybrydyzacji oraz 500 μg/mL tRNA i 50 μg/mL heparyny
- MAB – 100mM kwasu maleinowego, 150mM NaCl, 0,2M NaOH, 0,1% Tween-20, pH ustawione na 7,5
- Roztwór blokujący – 3 części MAB, 1 część 10% odczynnika blokującego Boehringer w MAB, 1 część inaktywowanego termicznie surowicy jagnięcej
- Bufor AP – 60mM Tris-HCl pH ustawione na 9,5, 60mM NaCl, 30mM MgCl2, 0,1% Tween-20
- Roztwór barwiący – fosforan 5-bromo-4-chloro-3-indolylu (BCIP) i nitro błękit tetrazoliowy (NBT) w buforze AP
4. REPREZENTATYWNE WYNIKI
Przy prawidłowym przebiegu reakcja pomiędzy NBT, BCIP a fosfatazą alkaliczną prowadzi do powstania fioletowego osadu, który powinien pojawić się na embrionie danio pręgowanego w formie fioletowego zabarwienia. Sondy ryboprobowe powinny zostać uprzednio zsyntetyzowane z cDNA odpowiadającego badanemu genowi. Zatem można wywnioskować, że każde zaobserwowane zabarwienie reprezentuje obszary organizmu danio pręgowanego, w których badany gen był transkrybowany na danym etapie rozwoju. Na potrzeby niniejszego kursu sondy ryboprobowe zsyntetyzowano z cDNA genów aldh1a2 (wcześniej raldh2; Begemann et al., 2001; Rycina 1); fgf8a (Reifers et al., 1998; Rycina 2); deltaC (Oates et al., 2005); myod1 (Weinberg et al., 1996); shha (Krauss et al., 1993), pax2a (Brand et al., 1996; Rycina 3) oraz myl7 (wcześniej cmlc2; Yelon et al., 1999). Zabarwienia oczekiwano w linii środkowej oraz w strukturach anatomicznych, takich jak somity, pączek ogonowy, miotom, mózg i serce. W przypadku mutantów Ace/fgf8a spodziewano się wystąpienia wad w wielu z tych struktur. Zabarwienie było łatwo widoczne przy użyciu standardowego mikroskopu stereoskopowego. Dodatkowe źródła zawierają więcej informacji oraz wskazówek dotyczących rozwiązywania problemów związanych z technikami WISH podobnymi do opisanych tutaj (Clark, 2003; D'Costa et al., 2009; Schmoldt et al., 2009; Schoenwolf, 2009).
Rycina 1. Zarodek danio pręgowanego 24 godziny po zapłodnieniu, poddany hybrydyzacji z ryboprobnami specyficznymi dla aldh1a2. Specyficzne barwienie widoczne jest w oczach, ródmózgu, primordiach pąków płetw piersiowych oraz somytach. Góra obrazu odpowiada stronie przedniej, dół stronie tylnej.
Rysunek 2. Zarodek danio pręgowanego na etapie 13 somytów, poddany hybrydyzacji z sondą specyficzną dla fgf8a. Specyficzne barwienie widoczne jest w telencefalonie, grzbietowej części diencefalonu, granicy śródmózgowia i rąbku, somytach oraz pączku ogonowym. Strona brzuszna znajduje się po lewej, grzbietowa po prawej.
Rycina 3. Embrion zebrafish 22 godziny po zapłodnieniu, który został poddany hybrydyzacji z ryb sondą specyficzną dla pax2a, będącą silnym markerem przydatnym do wizualizacji układu nerwowego. Specyficzne barwienie widoczne jest w szczelinie naczyniówkowej, na granicy śródmózgowia i rądmózgowia, w pęcherzyku słuchowym oraz w neuronach rdzenia kręgowego. Widok grzbietowy, przód po lewej stronie.
Dyskusja
Metoda WISH została wykorzystana w laboratorium z biologii porównawczej kręgowców, aby pomóc studentom zrozumieć rolę genetyki w rozwoju anatomicznym poprzez wizualizację znanych wzorów ekspresji genów. W pierwszej części kursu studenci przeprowadzili sekcje organizmów reprezentujących kilka różnych taksonów strunowców, co zapewniło im wystarczającą ilość czasu na badanie, zrozumienie, porównywanie i zestawianie anatomii kręgowców.
W ramach wprowadzenia do drugiej części kursu studenci uczestniczyli w wykładzie formalnym, podczas którego omówiono rozwój i anatomię danio pręgowanego. Przedyskutowano również metody oraz oczekiwane wyniki eksperymentu WISH. Następnie studentom przekazano żywe osobniki danio pręgowanego na etapie somitogenezy i stadium prim-6, a także w 2 i 5 dniach po zapłodnieniu (dpf), w celu ich zbadania pod mikroskopem stereoskopowym. Miało to na celu lepsze zapoznanie studentów z wyglądem embrionów danio pręgowanego oraz rodzajami zmian morfologicznych zachodzących podczas ontogenezy.
Podczas następnego zajęcia laboratoryjnego studenci otrzymali embriony danio pręgowanego, w których wcześniej przeprowadzono hybrydyzację in situ całego embrionu (WISH). Poproszono ich o zbadanie i opisanie wzorów ekspresji każdego z badanych genów (użytej sondy rybowej). Embriony wykorzystane do WISH pochodziły z krzyżówek osobników heterozygotycznej linii ace/fgf8a. Zgodnie z prawami dziedziczenia mendlowskiego oczekiwano, że 25% embrionów z krzyżówek ace/fgf8a będzie mutantami homozygotycznymi i wykaże wady w wielu strukturach anatomicznych omawianych w ramach tego kursu. Na podstawie opublikowanych raportów oraz niepublikowanych obserwacji przeprowadzonych w laboratorium Albertson oczekiwano wystąpienia wad mózgu i nieprawidłowego zawijania serca, a także wad somytów (Brand et al., 1996; Albertson and Yelick, 2005; obserwacje własne).
Studenci zostali poproszeni o zbadanie wszystkich okazów, zarówno typu dzikiego (zwierzęta heterozygotyczne są nieodróżnialne od rodzeństwa typu dzikiego we wczesnych stadiach rozwoju), jak i mutantów homozygotycznych, dla każdego przedstawionego wzorca ekspresji genów. Następnie poproszono ich o sporządzenie raportów laboratoryjnych z opisem uzyskanych wyników oraz wyjaśnieniem, w oparciu o wiedzę z zakresu anatomii i genetyki, w jaki sposób wadliwa ekspresja genów mogła doprowadzić do powstania malformacji anatomicznych.
Studenci przyjęli to ćwiczenie laboratoryjne z entuzjazmem i ciekawością. Większość z nich nigdy wcześniej nie korzystała z metody WISH i była niezwykle zainteresowana tą częścią kursu. Studenci uznali różne wzory ekspresji genów w embrionach danio pręgowanego za intrygujące; niektórzy opisywali wizualizowane wzory barwienia, kojarząc je ze znanymi kształtami i symbolami, takimi jak uśmiechnięta buźka. Powstałe raporty laboratoryjne wykazały, że studenci posiedli ogólną wiedzę na temat protokołu WISH oraz ekspresji genów w konkretnych strukturach anatomicznych. Od studentów wymagano również zrozumienia specyficznych funkcji genów badanych podczas zajęć za pomocą WISH (Stickney et al., 2000; Huelsken et al., 2002; Geetha-Loganathan et al., 2008a; Geetha-Loganathan et al., 2008b). Było jednak ewidentne, że niektórzy studenci posiadali ograniczoną wiedzę wstępną na temat szlaków sygnalizacyjnych i analizowanych genów. Rozszerzenie wykładu wprowadzającego do metody WISH o więcej informacji na temat tych zagadnień mogłoby być korzystnym uzupełnieniem w przyszłych kursach biologii porównawczej kręgowców.
Ponieważ protokół trwa zazwyczaj cztery kolejne dni, w zależności od harmonogramu kursu studenci mogą być w stanie zrealizować w klasie tylko część eksperymentu, a za pozostałą część odpowiedzialny musi być instruktor. W naszym kursie Biologii Porównawczej Kręgowców studenci przeprowadzali reakcje barwienia w laboratorium, podczas gdy asystent przeprowadzał wszystkie poprzedzające etapy. Jeśli preferowane jest, aby studenci przeprowadzili WISH w klasie, protokół można podzielić na podjednostki, które mogą być realizowane podczas kilku sesji laboratoryjnych, zależnie od ram czasowych zajęć. Jeśli przeprowadzenie całego protokołu przez studentów nie jest możliwe, co miało miejsce w tym przypadku ze względu na spotkania laboratoryjne odbywające się tylko raz w tygodniu, studenci mogą dodać roztwór barwiący na początku zajęć i, w zależności od użytej sondy rybowej, zakończyć barwienie w ciągu godziny. Czas potrzebny na wywołanie barwienia znacznie różni się w zależności od sondy rybowej oraz różnorodnych warunków eksperymentalnych i powinien zostać określony przed zajęciami. Warto zauważyć, że jeśli studenci będą jedynie wywoływać barwienie w laboratorium, instruktorzy będą odpowiedzialni za wszystkie poprzednie kroki, co będzie wymagało znacznego nakładu czasu i wysiłku poza salą lekcyjną. Jeśli jest to pożądane, krótszą alternatywą dla WISH mogłaby być immunohistochemia, wykorzystująca znaczniki przeciwciał do wizualizacji lokalizacji białek, jednak obecnie przeciwciała specyficzne dla zebrafish dla genów rozwojowych nie są łatwo dostępne. Inną opcją byłoby przeprowadzenie WISH na różnych gatunkach kręgowców i polecenie studentom porównania wzorców ekspresji tych samych genów w różnych organizmach (Pizard et al., 2004; Aramaki et al., 2007; Emerging Model Organisms, 2008; Emerging Model Organisms, 2010).
Nadrzędnym celem zastosowania metody WISH w kursie biologii porównawczej kręgowców było zaprezentowanie studentom, w jaki sposób techniki biologii molekularnej są wykorzystywane do badania rozwoju anatomicznego. Stanowiło to również okazję dla studentów do rozważań nad tym, jak zmieniona ekspresja genów może prowadzić nie tylko do wad rozwojowych, ale także do zmian ewolucyjnych. Sformalizowana jako ewolucyjna biologia rozwoju (często określana jako „evo-devo”), ta szybko rozwijająca się dziedzina badań dąży do powiązania genotypu z fenotypem poprzez proces rozwoju oraz do wyjaśnienia potencjalnych mechanistycznych podstaw zmian ewolucyjnych. Wraz z rozwojem tej dyscypliny coraz więcej ekologów, biologów organizmów i fizjologów stosuje techniki molekularne w swoich badaniach. Twierdzimy, że wykorzystanie WISH w kursie biologii porównawczej kręgowców pomoże utrzymać program nauczania na poziomie zgodnym z aktualnymi postępami technologicznymi i koncepcyjnymi w badaniach oraz ułatwi lepsze poziome dopasowanie zaawansowanych kursów biologii poprzez łączenie biologicznych poddziedzin. Co więcej, to zintegrowane podejście zapewni studentom możliwość opanowania szeregu technik badawczych z zakresu biologii w ramach jednego kursu, co prowadzi do bardziej zróżnicowanego wykształcenia i promowania przyszłych interdyscyplinarnych badań naukowych.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Autorzy pragną podziękować Katedrze Biologii na Uniwersytecie w Syracuse oraz dr Marilyn Kerr za ich wkład w organizację kursu Biologii Porównawczej Kręgowców. Laboratorium Albertsona jest wspierane przez grant R21DE019223 z National Institutes of Health/National Institute of Dental and Craniofacial Research, a także przez grant R01AG031922 z National Institutes of Health/National Institute on Aging.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 5 Prime Fast Plasmid Mini Kit (100 preps) | Fisher Scientific | 2300000 | |
| Chemicznie kompetentne komórki E. coli One Shot TOP10 z pożywką SOC | Invitrogen | C404003 | |
| Agar LB | Fisher Scientific | BP1425-500 | |
| Pożywka LB | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| Sód ampicyliny | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Izopropanol | Acros Organics | 42383-0010 | |
| Szalka Petri 100 x 20 mm nieobrobiona | Sprzedaż produktów laboratoryjnych | 430591 | |
| probówka do hodowli 14 ml, z zamknięciem typu snap-top | Fisher Scientific | 1495911B | |
| Enzymy restrykcyjne &buforowanie & 10xBSA | New England Biolabs | zmienny | |
| pirokarbonian dwuetylowy (DEPC) 25 ml | Sigma-Aldrich | D5758-25mL | |
| Octan sodu trójwodny USP/FCC 500 g | Fisher Scientific | S608500 | |
| Gal alkoholu etylowego 200 proof | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| Roztwór Tris-octan-EDTA (TAE) 50x 1L | Fisher Scientific | bp13321 | |
| Agaroza Low EEO 100 g | Fisher Scientific | BP160-100 | |
| bromek etydyny 10 ml | Sigma-Aldrich | 45-E1510 | |
| Barwnik do nakładania na żel sacharozowy, 40% sacharozy | Fisher Scientific | BP655-1 | |
| Drabinka DNA 1 kb Full Scale | Fisher Scientific | BP2582200 | |
| Mieszanina do znakowania RNA DIG | Grupa Roche | 11277073910 | |
| Polimeraza RNA T3 | Grupa Roche | 1031163 | |
| Polimeraza RNA T7 | Grupa Roche | 10881767001 | |
| Polimeraza RNA SP6 | Grupa Roche | 810274 | |
| Inhibitor RNazy Protector | Grupa Roche | 3335399001 | |
| DNaza I, wolna od RNaz 10 000 jednostek | Grupa Roche | 4716728001 | |
| odczynnik do biologii molekularnej EDTA | Sigma-Aldrich | e5134-500G | |
| Chlorek litu 100 g | Fisher Scientific | L121100 | |
| Węglan sodu 1 kg | Fisher Scientific | BP357-1 | |
| Wodorowęglan sodu, 500 g | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Kwas octowy lodowaty ACS 500 ml | Fisher Scientific | a38500 | |
| Paraformaldehyd R 500 g | Fisher Scientific | Przeprowadzenie testu ELISA do oznaczania cytokin w surowicy krwi Streszczenie W niniejszym protokole przedstawiono metodę wykonywania testu ELISA (enzymatycznego testu immunosorpcyjnego) w celu ilościowego oznaczenia poziomów cytokin w surowicy krwi. Test ELISA jest niezwykle czułą i specyficzną techniką analityczną, która wykorzystuje przeciwciała do wykrywania i pomiaru białek w próbkach biologicznych. W tym zestawieniu opisano metodę typu „sandwich” (kanapkową), w której przeciwciało wychwytujące unieruchomione na płytce mikrodołkowej wiąże docelową cytokinę, a następnie przeciwciało detekcyjne sprzężone z enzymem wiąże się z kompleksem, co po dodaniu substratu prowadzi do powstania sygnału kolorystycznego proporcjonalnego do stężenia analitu. Słowa kluczowe cytokiny, ELISA, surowica krwi, analiza ilościowa, przeciwciała, białka zapalne Materiały i odczynniki 1. Zestaw do testu ELISA na konkretną cytokinę (zawierający płytki z przeciwciałami wychwytującymi, standardy, przeciwciała detekcyjne sprzężone z HRP, substrat TMB, roztwór stopujący i bufor do mycia) 2. Surowica krwi (próbki badawcze) 3. Pipety wielokanałowe i jednokanałowe z odpowiednimi końcówkami z filtrem 4. Czytnik płytek mikrodołkowych (spektrofotometr ELISA) 5. Inkubator lub inkubator z wstrząsaniem 6. Woda destylowana lub dejonizowana 7. Probówki mikrocentryfugowe Procedura Przygotowanie próbek i standardów 1. Rozmrozić surowicę krwi w temperaturze 4°C i wymieszać delikatnie poprzez odwracanie probówki. 2. Przygotować szereg rozcieńczeń standardu zgodnie z instrukcją producenta zestawu, aby stworzyć krzywą kalibracyjną. 3. Rozcieńczyć próbki surowicy w odpowiednim buforze do rozcieńczania, aby stężenie cytokin mieściło się w zakresie dynamicznym standardów. Przeprowadzenie testu 1. Do każdego dołka płytki mikrodołkowej nanieść odpowiednią objętość standardów oraz rozcieńczonych próbek (zazwyczaj w powtórzeniach n=2). 2. Przykryć płytkę i inkubować w temperaturze wskazanej przez producenta (np. 37°C przez 2 godziny) w celu związania cytokin z przeciwciałami wychwytującymi. 3. Odessać zawartość dołków i przemyć płytkę buforem do mycia (np. trzy razy), dbając o całkowite usunięcie cieczy po każdym cyklu. 4. Nanieść do każdego dołka przeciwciało detekcyjne sprzężone z enzymem (np. HRP). 5. Inkubować płytkę ponownie w odpowiedniej temperaturze i czasie, unikając bezpośredniego nasłonecznienia. 6. Powtórzyć cykl mycia, aby usunąć niezwiązane przeciwciała detekcyjne. 7. Dodać substrat TMB do każdego dołka i inkubować przez określony czas do momentu pojawienia się niebieskiego zabarwienia. 8. Zatrzymać reakcję poprzez dodanie roztworu stopującego, co spowoduje zmianę koloru z niebieskiego na żółty. Pomiar i analiza danych 1. Zmierzyć absorbancję (gęstość optyczną) płytek za pomocą czytnika płytek przy długości fali określonej w instrukcji (zazwyczaj 450 nm). 2. Wykreślić krzywą standardową, nanosząc wartości absorbancji standardów w funkcji ich stężenia. 3. Obliczyć stężenie cytokin w próbkach surowicy na podstawie krzywej standardowej, uwzględniając zastosowane rozcieńczenia. | |
| PBS roztwór buforu fosforanowo-solnego 10X | Fisher Scientific | bp3991 | |
| Tween 20 500 ml | Fisher Scientific | bp337500 | |
| Metanol 5 L | Fisher Scientific | A4124 | |
| Proteinaza K 50 mg | Fisher Scientific | bp170050 | |
| Formamid 1 l | Fisher Scientific | F841 | |
| 1 L 20x SSC | Fisher Scientific | bp13251 | |
| Kwas cytrynowy bezwodny ACS 500 g | Fisher Scientific | a940500 | |
| Transferowy kwas rybonukleinowy V | Sigma-Aldrich | r7876-2.5KU | |
| Sód heparyny 50 mg | Fisher Scientific | bp252450 | |
| Kwas maleinowy R 500 g | Fisher Scientific | O3417500 | |
| Chlorek sodu 500 g | Fisher Scientific | s271500 | |
| Wodorotlenek sodu 500 g | Fisher Scientific | s318500 | |
| Odczyn blokujący | Grupa Roche | 11096176001 | |
| Surowica jagnięca 500 ml | Invitrogen | 16070096 | |
| Fragmenty przeciwciał anty-DIG AP | Grupa Roche | 11093274910 | |
| Roztwór Tris 2M 500 ml | Fisher Scientific | bp1759500 | |
| Chlorek magnezu 500 g | Fisher Scientific | Podsumowanie W niniejszym protokole opisano procedurę izolacji i oczyszczania białka GFP (zielonego białka fluorescencyjnego) z bakterii Escherichia coli przy użyciu chromatografii powinowactwa. Metoda ta opiera się na specyficznym wiązaniu białka GFP z odpowiednią macierzą, co pozwala na jego skuteczne oddzielenie od pozostałych białek komórkowych. W protokole szczegółowo omówiono etapy przygotowania hodowli bakteryjnej, lizy komórek, wiązania białka do kolumny oraz jego elucji i analizy za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (SDS-PAGE). Procedura ta służy jako model do nauki podstawowych technik oczyszczania białek i analizy ich czystości oraz wydajności procesu. | |
| BCIP 3 ml | Grupa Roche | 11383221001 | |
| NBT 3 ml | Grupa Roche | 11383213001 | |
| Glicerol 99% 2,5 L | Fisher Scientific | AC158920025 | |
| Płytka 12-dołkowa PS ST z pokrywką | VWR international | 62406-165 | |
| Probówka 15 ml z zakrętką, 50 szt./stelaż 500 szt./opakowanie | Sprzedaż produktów laboratoryjnych | L262861 | |
| Probówka 50 ml z nakrętką 25 szt./stelaż 500 szt./opakowanie | Sprzedaż produktów laboratoryjnych | L262890 | |
| probówka do mikrowirówki o pojemności 1,6 ml | Sprzedaż produktów laboratoryjnych | L234401 | |
| 2 Parafilm M" x 250 stóp | Fisher Scientific | s37441 | |
| Pipeta transferowa 7 ml | USA Scientific, Inc. | 1020-2520 | |
| .1-10 μNapiwek do pipety, opakowanie zbiorcze | USA Scientific, Inc. | 1111-3000 | |
| 1-200 μNapiwnik do pipety, opakowanie zbiorcze | USA Scientific, Inc. | 1111-0006 | |
| 101-1000 μKońcówki do pipet, opakowania zbiorcze | USA Scientific, Inc. | 1111-2021 | |
| Folia aluminiowa | Sklep spożywczy | ||
|
Bibliografia
- Albertson, R. C., Yelick, P. C. Roles for fgf8 signaling in left-right patterning of the visceral organs and craniofacial skeleton. Dev. Biol. 283, 310-321 (2005).
- Aramaki, M., Kimura, T., Udaka, T., Kosaki, R., Mitsuhashi, T., Okada, Y., Takahashi, T., Kosaki, K. Embryonic expression profile of chicken CHD7, the ortholog of the causative gene for CHARGE syndrome. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 79, 50-57 (2007).
- Begemann, G., Schilling, T. F., Rauch, G. J., Geisler, R., Ingham, P. W. The zebrafish neckless mutation reveals a requirement for raldh2 in mesodermal signals that pattern the hindbrain. Development. 128, 3081-3094 (2001).
- Brand, M., Heisenberg, C. P., Jiang, Y. J., Beuchle, D., Lun, K., Furutani-Seiki, M., Granato, M., Haffter, P., Hammerschmidt, M., Kane, D. A., Kelsh, R. N., Mullins, M. C., Odenthal, J., van Eeden, F. J., Kane, D. A., Nüsslein-Volhard, C. Mutations in zebrafish genes affecting the formation of the boundary between midbrain and hindbrain. Development. 123, 179-190 (1996).
- Clark, M. In situ Hybridization: Laboratory Companion. , Wiley-VCH. (2003).
- D'Costa, A., Shepherd, I. T. Zebrafish development and genetics: Introducing undergraduates to developmental biology and genetics in a large introductory laboratory class. Zebrafish. 6, 169-177 (2009).
- Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual, Volume 1. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2008).
- Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual, Volume 2. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2010).
- Geetha-Loganathan, P., Nimmagadda, S., Scaal, M. Wnt signaling in limb organogenesis. Organogenesis. 4, 109-115 Forthcoming.
- Geetha-Loganathan, P., Nimmagadda, S., Scaal, M., Huang, R., Christ, B. Wnt signaling in somite development. Ann Anat. 190, 208-222 Forthcoming.
- Huelsken, J., Behrens, J. The Wnt signaling pathway. J Cell Sci. 15, 3977-3978 (2002).
- Krauss, S., Concordet, J. P., Ingham, P. W. A functionally conserved homolog of the Drosophila segment polarity gene hh is expressed in tissues with polarizing activity in zebrafish embryos. Cell. 75, 1431-1444 (1993).
- Oates, A. C., Mueller, C., Ho, R. K. Cooperative function of deltaC and her7 in anterior segment formation. Dev. Biol. 280, 133-149 (2005).
- Pizard, A., Haramis, A., Carrasco, A. E., Franco, P., López, S., Paganelli, A. Whole-mount in situ hybridization and detection of RNAs in vertebrate embryos and isolated organs. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 14, (2004).
- Reifers, F., Bohli, H., Walsh, E. C., Crossley, P. H., Stainier, D. Y., Brand, M. Fgf8 is mutated in zebrafish acerebellar (ace) mutants and is required for maintenance of midbrain-hindbrain boundary development and somitogenesis. Development. 125, 2381-2395 (1998).
- Schmoldt, A., Forecki, J., Hammond, D. R., Udvadia, A. J. Exploring differential gene expression in zebrafish to teach basic molecular biology skills. Zebrafish. 6, 187-199 (2009).
- Schoenwolf, G. C. Laboratory Studies of Vertebrate and Invertebrate Embryos: Guide and Atlas of Descriptive and Experimental Development. , 9th Edition, Pearson Education- Benjamin Cummings. Upper Saddle River, NJ. (2008).
- Stickney, H. L., Barresi, M. J., Devoto, S. H. Somite development in zebrafish. Dev Dyn. 219, 287-303 (2000).
- Weinberg, E. S., Allende, M. L., Kelly, C. S., Abdelhamid, A., Murakami, T., Andermann, P., Doerre, O. G., Grunwald, D. J., Riggleman, B. Developmental regulation of zebrafish MyoD in wild-type, no tail and spadetail embryos. Development. 122, 271-280 (1996).
- Yelon, D., Horne, S. A., Stainier, D. Y. Restricted expression of cardiac myosin genes reveals regulated aspects of heart tube assembly in zebrafish. Dev. Biol. 214, 23-37 (1999).
Przedruki i uprawnienia
