Strategia identyfikacji mutacji de novo w powszechnych zaburzeniach, takich jak autyzm i schizofrenia

Podsumowanie

Strategia genetyki molekularnej w celu znalezienia mutacji de novo powodujących powszechne zaburzenia, takie jak autyzm i schizofrenia.

Streszczenie

Istnieje kilka linii dowodów wspierających rolę mutacji de novo jako mechanizmu powstawania powszechnych zaburzeń, takich jak autyzm i schizofrenia. Po pierwsze, stopień występowania mutacji de novo u ludzi jest stosunkowo wysoki, przez co w populacji z wysoką częstotliwością powstają nowe mutacje. Jednakże w większości powszechnych chorób nie raportowano mutacji de novo. Mutacje w genach prowadzące do ciężkich chorób, w których występuje silna selekcja negatywna przeciwko fenotypowi – np. letalność w stadiach embrionalnych lub obniżona sprawność rozrodcza – nie będą przekazywane wielu członkom rodziny, a zatem nie zostaną wykryte za pomocą mapowania genów przez sprzężenie lub badań asocjacyjnych. Obserwacja bardzo wysokiej zgodności u bliźniąt jednojajowych i bardzo niskiej zgodności u bliźniąt dwujajowych również silnie wspiera hipotezę, że znaczna część przypadków może wynikać z nowych mutacji. Jest to przypadek chorób takich jak autyzm i schizofrenia. Po drugie, pomimo obniżonej sprawności rozrodczej¹ i niezwykle zmiennych czynników środowiskowych, zapadalność na niektóre choroby utrzymuje się na całym świecie na stosunkowo wysokim i stałym poziomie. Dotyczy to autyzmu i schizofrenii, których zapadalność wynosi około 1% na całym świecie. Obciążenie mutacyjne można rozumieć jako równowagę między selekcją za lub przeciwko szkodliwej mutacji a jej powstawaniem poprzez mutację de novo. Niższy poziom reprodukcji stanowi czynnik selekcji negatywnej, który powinien redukować liczbę alleli mutantów w populacji, co ostatecznie prowadziłoby do zmniejszenia rozpowszechnienia choroby. Presje selekcyjne te mają tendencję do różnej intensywności w różnych środowiskach. Niemniej jednak, te ciężkie zaburzenia psychiczne utrzymują się na stałym, stosunkowo wysokim poziomie rozpowszechnienia w populacji światowej, w szerokim zakresie kultur i krajów, pomimo silnej selekcji negatywnej przeciwko nim². Nie jest to wynik, którego należałoby oczekiwać w chorobach z obniżoną sprawnością rozrodczą, chyba że istniałby wysoki stopień nowych mutacji. Wreszcie, wpływ wieku ojca: istnieje znacząco zwiększone ryzyko choroby wraz ze wzrostem wieku ojca, co może wynikać z zależnego od wieku wzrostu liczby paternalnych mutacji de novo. Ma to miejsce w przypadku autyzmu i schizofrenii³. Stosunek tempa mutacji u mężczyzn do kobiet szacuje się na około 4–6:1, co prawdopodobnie wynika z większej liczby podziałów komórek linii zarodkowej wraz z wiekiem u mężczyzn. Można zatem przewidzieć, że mutacje de novo częściej będą pochodzić od mężczyzn, szczególnie tych starszych⁴. Wysoki stopień nowych mutacji może częściowo wyjaśniać, dlaczego badaniom genetycznym nie udało się dotąd zidentyfikować wielu genów predysponujących do złożonych chorób genetycznych, takich jak autyzm i schizofrenia, oraz dlaczego zidentyfikowano choroby dla zaledwie 3% genów w ludzkim genomie. Identyfikacja mutacji de novo jako przyczyny choroby wymaga ukierunkowanego podejścia molekularnego, obejmującego badanie rodziców i osób chorych. Proces ustalania, czy podłoże genetyczne choroby może w części wynikać z mutacji de novo, oraz podejście molekularne służące do ustalenia tego związku zostaną przedstawione na przykładach autyzmu i schizofrenii.

Protokół

1. Wybór choroby, która może być spowodowana mutacjami de novo

Choroba spełniająca następujące kryteria może być zgodna z hipotezą mutacji de novo:

1. Sprawność rozrodcza jest obniżona.
2. Częstość występowania choroby jest stosunkowo wysoka i stała, mimo znacznych różnic w środowisku.
3. Choroba jest powiązana z wyższym wiekiem ojca.
4. Klasyczne badania sprzężeń i asocjacji nie pozwoliły wyjaśnić znaczącej części dziedziczności choroby.
5. Dane dotyczące zgodności u bliźniąt wspierają model mutacji de novo.

Kluczowym pierwszym krokiem jest analiza prawdopodobieństwa, że w przypadku powszechnej choroby mutacje de novo mogą w części wyjaśniać jej podłoże genetyczne.

2. Wybór przypadków i próbek DNA

Wybór odpowiednich próbek ma krytyczne znaczenie dla sukcesu identyfikacji mutacji de novo. Aby zmaksymalizować szansę na znalezienie mutacji de novo, zalecamy następujące działania:

1. Należy wybrać przypadki z wczesnym wiekiem wystąpienia objawów, ciężkim fenotypem, z nieobciążonymi rodzicami, starszymi ojcami oraz brakiem rodzinnego wywiadu w kierunku choroby.
2. Należy wybrać pacjentów, dla których dostępne ilości DNA są wystarczające do przeprowadzenia badania. Szczególnie istotna jest dostępność DNA z pierwotnego źródła komórkowego, które nie było poddawane hodowli (np. DNA z krwi lub DNA ze śliny).
3. Dostępność DNA obojga rodziców jest kluczowa dla określenia statusu przekazywania mutacji (dziedziczna vs. de novo). Dostępność dodatkowych kohort osób chorych oraz prawidłowych kontroli jest niezbędna do badań walidacji genetycznej po zidentyfikowaniu genów kandydackich.
4. Oszacuj wielkość próby na podstawie częstości mutacji, liczby genów poddawanych badaniom oraz szacowanej frakcji przypadków, które mogą wynikać z de novo mutacja

3. Resekwencjonowanie genów; dwa główne podejścia

1. Wysokojakościowe sekwencjonowanie o niskiej przepustowości
   Podejście to opiera się na metodzie genów kandydatów.
   1. Wybór genu (genów) kandydata
      Wybrano najlepsze geny kandydatów w oparciu o system punktacji zbudowany na 6 głównych kryteriach. Następnie obliczono sumę wszystkich punktów przypisanych przy użyciu sześciu kryteriów wymienionych w Tabeli 1. Przykład z naszego projektu, przedstawiający rozkład genów wybranych i niewybranych, znajduje się na rysunku 1.
      
      Tabela 1. Kryteria stosowane do wyboru genów kandydatów
      
      
      Rysunek 1. Wykres przedstawiający rozkład genów wybranych i niewybranych do sekwencjonowania w naszym projekcie. Uzyskano rozkład genów uszeregowanych według właściwości kandydujących poprzez sortowanie genów zgodnie z ich wartością punktową. Na przykład geny SHANK3 i NRXN1, w których znaleźliśmy mutację de novo, otrzymały odpowiednio 7 i 6 punktów (maksimum to 12).
   2. Zaprojektowanie starterów przy użyciu oprogramowania Primers3 za pośrednictwem Exonprimer. Należy objąć jedynie region kodujący i miejsce połączenia eksonów (splice junction), uwzględniając dodatkowe 50 par zasad po każdej stronie eksonu.
   3. Optymalizacja warunków PCR pod kątem wyboru polimerazy Taq, objętości reakcji itp.
   4. Optymalizacja wszystkich fragmentów PCR
   5. Amplifikacja 5 ng genomowego DNA wyekstrahowanego z próbek krwi zgodnie ze standardowymi procedurami
   6. Przed wysłaniem do sekwencjonowania należy przeprowadzić kontrolę jakości produktów PCR, nanosząc je na żel agarozowy 2%. Próbki wybrano losowo.
   7. Sekwencjonowanie produktów PCR na analizatorze DNA w jednej nici. Fragment uznaje się za pomyślnie zsekwencjonowany, jeśli możliwa jest analiza ponad 90% śladów. Metoda ta jest stosowalna w badaniach przesiewowych na dużą skalę.
   8. Wykrywanie wariantów
      1. Użycie narzędzi do wykrywania i genotypowania wariacji genomicznych, takich jak PolyPhred, Polyscan i Mutation Surveyor. Idealna jest kombinacja więcej niż dwóch narzędzi detekcyjnych. Na przykład PolyPhred v.5 i PolyPhred v.6 przy domyślnych ustawieniach nie wykrywają tych samych wariacji. Polyscan v.3 wykazuje wyższy odsetek fałszywie dodatnich mutacji dla SNP (96%) i niższy dla INDELi (93%). PolyPhred v.6 nie wykrył większości prawdziwych INDELi, ale ogólny odsetek fałszywie dodatnich mutacji (dla INDELi) był niższy niż w Polyscan v.3 (90%). Należy wyłączyć opcję wykrywania SNP w Polyscan v.3 i zachować zarówno PolyPhred v.5, jak i PolyPhred v.6 do wykrywania wariantów. Mutation Surveyor i Polyscan lepiej nadają się do wykrywania indeli. Uwaga: Opcja wykrywania SNP nie powinna być stosowana podczas korzystania z Polyscan. Powinna być włączona jedynie opcja „indel”. Polyscan generował zbyt wiele wyników fałszywie dodatnich przy wykrywaniu SNP.
      2. W przypadku każdego wykrytego unikalnego nowego wariantu eksonowego należy potwierdzić go ręcznie poprzez ponowną amplifikację fragmentu i ponowne sekwencjonowanie probanda oraz obojga rodziców przy użyciu starterów rewersyjnych i forward, aby wyeliminować wszelkie artefakty techniczne.
2. Sekwencjonowanie całego eksomu
   Podejście to stanowi sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości, ukierunkowane na większość regionów kodujących genomu ludzkiego. Obecnie stosujemy tę nową metodę w naszym laboratorium, co przyspiesza wykrywanie potencjalnych genów kandydatów.
   1. Zamówienie zestawu „SureSelect Human All Exon” ukierunkowanego na regiony kodujące ponad 16 000 genów (50 MB genomu) zaprojektowanego przez Agilent lub innego podobnego produktu od innych producentów, np. Roche. Przed zamówieniem zestawu do wychwytu należy określić platformy sekwencjonowania (Illumina vs SOLiD).
   2. Przeprowadzenie wychwytu zgodnie z protokołem Agilent
   3. Sekwencjonowanie produktu na dostępnej, odpowiedniej platformie nowej generacji
   4. Wykrywanie wariantów z sekwencjonowania całego eksomu: Dostępnych jest kilka narzędzi bioinformatycznych do wykrywania i genotypowania wariacji genomicznych z platformy sekwencjonowania nowej generacji, takich jak BWA, Bfast, Bioscope, które służą do wyrównywania sekwencji (alignment). Następnie potrzebne będą dodatkowe, bezpłatnie dostępne narzędzia do analizy końcowej (np. SAM tools, Varscan, Annovar), aby zidentyfikować (call) i adnotować warianty. Dostępne jest również komercyjne oprogramowanie integrujące wyrównywanie sekwencji, identyfikację i adnotację wariantów, takie jak NextGEN (Softgenetics), CLC Bio i inne

4. Priorytetyzacja wariantów genomicznych

Zidentyfikowane warianty są następnie priorytetyzowane do dalszych analiz w zależności od prawdopodobieństwa, że są one wariantami de novo i mają szkodliwy wpływ na funkcję i/lub strukturę białka lub mRNA. Priorytety analizy wariantów w celu wykrycia wariantów de novo powinny być następujące:

1. Warianty unikalne (zaobserwowane raz w jednym przypadku)
2. Warianty nieobecne u rodziców
3. Warianty prowadzące do skrócenia białka: nonsensowne, indels prowadzące do przesunięcia ramki odczytu oraz mutacje splicingowe.
4. Warianty missense i ciche, których przewiduje się, że zaburzają funkcję (np. wpływają na splicing mRNA). Do przewidywania wpływu funkcjonalnego na białko należy wykorzystać Polyphen, SIFT oraz PANTHER.

W przypadku zastosowania sekwencjonowania całego eksomu, wybór genów kandydackich może służyć jako strategia priorytetyzacji wariantów do dalszych badań.

5. Walidacja genetyczna

1. Przeprowadź ponowne sekwencjonowanie całego genu w dodatkowych przypadkach pacjentów (w celu zidentyfikowania innych mutacji sprawczych) oraz w grupach kontrolnych. Próbki kontrolne zostaną wykorzystane do oceny częstości allelicznej priorytetowych wariantów. Każdy gen zawierający co najmniej dwie różne szkodliwe mutacje de novo (nonsensowne, splicingowe, przesunięcia ramki odczytu oraz przewidywane szkodliwe mutacje missense) znalezione u różnych pacjentów (ale nie w próbkach kontrolnych ani publicznych bazach danych) powinien zostać uznany za wysokopriorytetowy do dalszych badań walidacyjnych. Obejmuje to: 1) badanie potencjalnego defektu splicingu w liniach limfoblastoidalnych pochodzących od pacjenta. Z naszego doświadczenia wynika, że większość genów pozwala na uzyskanie produktów RT-PCR z linii limfoblastoidalnych; 2) zbadanie zmienionych poziomów ekspresji białek za pomocą ilościowej analizy Western blot ekstraktów białkowych z linii limfoblastoidalnych oraz 3) dalsze testowanie mutacji/genu na poziomie funkcjonalnym w modelach zwierzęcych (c elegans, Zebrafish) i liniach komórkowych, zgodnie z wcześniejszą praktyką naszej grupy (np. 5,6).

6. Reprezentatywne wyniki:

Postępując zgodnie z tym protokołem, udało nam się zidentyfikować nowe geny związane z schizofrenią i autyzmem. Przykładem jest nasze niedawne odkrycie dotyczące genu SHANK3 (Ryc. 2). Wykryto dwie różne mutacje de novo w genie SHANK3: jedną mutację nonsensowną u trzech dotkniętych chorobą braci oraz jedną mutację missense u jednej dotkniętej chorobą kobiety.

Rysunek 2. (A) Segregacja nonsensownej mutacji R1117X u trzech dotkniętych braci z rodziny PED 419. Probanda zaznaczono strzałką. (B) Segregacja mutacji missense R536W u probandki, która nie wystąpiła u jej zdrowego brata w rodzinie PED 56.

Dyskusja

Procedura opisana w niniejszym dokumencie ma na celu identyfikację określonych powszechnych chorób, które prawdopodobnie wynikają częściowo z mutacji de novo, oraz udowodnienie tej hipotezy. Mutacje de novo są dobrze udokumentowanym mechanizmem rozwoju wielu chorób, na przykład dziedzicznych zespołów nowotworowych, lecz były słabo badane w przypadku chorób powszechnych. Wynika to częściowo z wyzwań technicznych związanych z identyfikacją mutacji de novo, co wymaga sekwencjonowania dużych ilości DNA, które stało się opłacalne dopiero niedawno wraz z pojawieniem się sekwencjonowania nowej generacji (Next Generation Sequencing). Ponadto stopa mutacji de novo u ludzi do niedawna była jedynie szacunkiem. Dopiero w ostatnim czasie pojawiły się doniesienia bezpośrednio określające stopę mutacji u ludzi. Przed przeprowadzeniem tych pomiarów trudno było przewidzieć wielkość próby niezbędną do tego rodzaju badań oraz ustalić, czy obserwowana stopa mutacji de novo jest wyższa od stopy bazowej. Sekwencjonowanie genów kandydackich czy całego genomu? Ponieważ większość zgłoszonych mutacji chorobowych to mutacje missense/nonsense oraz mutacje w obrębie miejsc splicingowych (według strony internetowej HGMD), nasza strategia przesiewowa pozwoliłaby zidentyfikować ponad 68% znanych mutacji. Istnieje również wyraźna zależność między stopniem drastyczności zamiany aminokwasu a prawdopodobieństwem wystąpienia fenotypu klinicznego. W porównaniu z konserwatywną substytucją aminokwasu, zmiana nonsense jest 9,0 razy bardziej prawdopodobna pod kątem przejawiania się klinicznie 7. Zatem obecnie sekwencjonowanie genów kandydackich jest najbardziej efektywną kosztowo strategią.

Sukces opisanego postępowania zależy od kilku krytycznych etapów, które zostały szczegółowo omówione i zilustrowane na dwóch przykładach: autyzmu oraz schizofrenii. Istnieje wiele pułapek, których należy unikać, takich jak wybór odpowiedniej choroby, dobór pacjentów do badań, źródło DNA oraz szczegóły dotyczące efektywnej identyfikacji mutacji de novo. Przedstawiamy metodę najefektywniejszego określania frakcji przypadków dowolnej choroby, które są wynikiem takich mutacji spontanicznych.