Disekcja i barwienie jajników larw Drosophila

Podsumowanie

Sposób, w jaki nisze i komórki macierzyste tworzą się podczas rozwoju, jest istotnym zagadnieniem o praktycznym znaczeniu. W jajniku Drosophila komórki macierzyste linii zarodkowej oraz ich nisze somatyczne powstają podczas rozwoju larwalnego. Niniejszy film prezentuje sposób preparowania, barwienia i montowania gonad samic larw Drosophila w późnym trzecim stadium larwalnym (LL3).

Streszczenie

Wiele narządów zależy od komórek macierzystych w procesie rozwoju podczas embriogenezy oraz w procesach utrzymania lub naprawy w życiu dorosłym. Zrozumienie sposobu formowania się komórek macierzystych oraz ich interakcji z otoczeniem jest zatem kluczowe dla zrozumienia rozwoju, homeostazy i chorób. Jajnik muszki owocówki Drosophila melanogaster służy jako wpływowy model interakcji komórek macierzystych linii zarodkowej (GSCs) z ich somatycznymi komórkami wspierającymi (niszą) ^{1, 2}. Znana lokalizacja niszy i GSCs, w połączeniu z możliwością ich manipulacji genetycznej, pozwoliła badaczom wyjaśnić szereg interakcji między komórkami macierzystymi a ich niszami ^3-12.

Mimo bogactwa informacji na temat mechanizmów kontrolujących utrzymanie i różnicowanie GSC, stosunkowo niewiele wiadomo o tym, jak GSC i ich nisze somatyczne formują się podczas rozwoju. Około 18 nisz somatycznych, których skład komórkowy obejmuje włókno końcowe oraz komórki czepne (Rysunek 1), powstaje podczas trzeciego stadium larwalnego ^13-17. GSC pochodzą z pierwotnych komórek płciowych (PGCs). PGCs proliferują we wczesnych stadiach larwalnych, jednak po sformowaniu niszy podgrupa PGCs przekształca się w GSCs ^{7, 16, 18, 19}. Razem komórki niszy somatycznej i GSCs tworzą jednostkę funkcjonalną, która produkuje jaja przez cały okres życia organizmu.

Wiele pytań dotyczących formowania się jednostki GSC pozostaje bez odpowiedzi. Procesy takie jak koordynacja między komórkami prekursorowymi nisz a prekursorami komórek macierzystych lub generowanie asymetrii w PGC w momencie przekształcania się w GSC, można najlepiej badać w larwie. Jednak systematyczne badanie rozwoju jajników larwalnych jest trudne pod względem technicznym. Po pierwsze, jajniki larwalne są małe. Nawet w późnych stadiach larwalnych ich średnica wynosi zaledwie 100μm. Dodatkowo jajniki są przezroczyste i zatopione w białym ciele tłuszczowym. W niniejszym opracowaniu opisujemy szczegółowy protokół izolacji jajników z larw Drosophila w późnym trzecim stadium (LL3), a następnie ich barwienia przeciwciałami fluorescencyjnymi. Proponujemy rozwiązania techniczne dla takich problemów jak lokalizacja jajników, barwienie i przemywanie tkanek, które nie opadają na dno, oraz zapewnienie penetracji przeciwciał do wnętrza tkanki. Protokół ten można zastosować również do wcześniejszych stadiów larwalnych oraz do jąder larwalnych.

Protokół

1. Składanie jaj

1. Pięć dni przed sekcją: należy pozwolić zapłodnionym samicom na składanie jaj przez 2-4 godziny na świeżej pożywce wzbogaconej drożdżami. Aby uzyskać zsynchronizowane i dobrze rozwinięte larwy, ważne jest, aby nie dopuścić do przeludnienia hodowli (około 30 jaj na fiolkę 25 mm). Zazwyczaj do jednej fiolki używa się od 7 do 16 samic, w zależności od ich wydajności w składaniu jaj.

2. Wybór larw

1. Przygotować szklaną szalkę sekcyjną z 9 dołkami wypełnioną roztworem Ringera (128mM NaCl, 2mM Kcl, 1.8mM CaCl₂, 4mM MgCl₂, 35.5mM sacharozy, 5mM Hepes pH 6.9).
2. Przygotować sitka do komórek w płytce sześciodołkowej zawierającej roztwór Ringera i umieścić ją w lodzie. Alternatywnie można zastosować specjalnie wykonane formy z nylonową siatką.
3. Pobrać larwy o określonym wieku ze ścianek fiolek za pomocą precyzyjnych pęset biologicznych i umieścić je w szalce sekcyjnej z roztworem Ringera.
4. Przenieść larwę żeńską do czystego dołka. Samice odróżniamy od samców po gonadach. Jajnika samców są łatwo rozpoznawalne jako duże, przeźroczyste owale osadzone w tylnej jednej trzeciej ciała tłuszczowego. Jajniki samic, znajdujące się w tej samej części ciała tłuszczowego, można zidentyfikować jako znacznie mniejsze, przeźroczyste, okrągłe sfery.

3. Disekcja larwy

1. Przytrzymaj larwę pęsetą tuż za mózgiem i usuń głowę za pomocą drugiej pęsety.
2. Umieść pozostałą tylną część na stronie grzbietowej, tak aby tchawica była skierowana w dół.
3. Przytrzymaj larwę za przetchawnikami tylnymi jedną pęsetą i powoli pchaj ją do wewnątrz, podczas gdy drugą pęsetą przesuwaj kutykulę ku tyłowi, aż wyłoni się około połowy ciała tłuszczowego larwy.
4. Mocno przytrzymaj koniec tylny i użyj drugiej pęsety, aby luźno chwycić kutykulę. Delikatnie i powoli odciągnij koniec tylny tak, aby kutykula wraz z przymocowanym jelitem wysunęły się przez szczelinę. Po zakończeniu tego procesu ciało tłuszczowe powinno zostać całkowicie oddzielone od jelita i kutykuli. Oddziel jelito od przedniej części ciała tłuszczowego. Aby ułatwić barwienie i montowanie preparatu, ważne jest, aby ciało tłuszczowe pozostało nienaruszone.
5. Dokładnie zwilż pipetę Pasteura roztworem Ringera, najlepiej z naczynia zawierającego zdyssekowane larwy. Pomaga to pokryć pipetę i zapobiega przywieraniu ciała tłuszczowego. Użyj pipety Pasteura, aby przenieść ciało tłuszczowe do lodowatego roztworu Ringera w sitku komórkowym.

4. Fixacja i barwienie

Wszystkie etapy są przeprowadzane w temperaturze pokojowej, z wyjątkiem inkubacji z pierwszym przeciwciałem, która odbywa się w 4 °C.

1. Inkubować ciało tłuste w 5% formaldehydzie w roztworze Ringera przez 20 minut przy łagodnym mieszaniu.
2. Przemywać przez 5 minut 1% roztworem PBT (1% Triton x-100 w PBS). Powtórzyć ten krok przez 10 minut, a następnie po raz trzeci przez 45 minut. 1% Triton X-100 jest niezbędny do perforacji jajnika larwy w celu umożliwienia penetracji przeciwciał.
3. Inkubować w bloku z 0,3% PBTB (0,3% Triton x-100 i 1% BSA w PBS) przez 1 godzinę przy delikatnym mieszaniu
4. Inkubować z pożądanym 1^st przeciwciało rozcieńczone w 0,3% PBTB przez noc w temperaturze 4°C przy łagodnym mieszaniu. Krok ten wykonuje się zazwyczaj w probówkach 0,2 ml na mieszalniku obrotowym.
5. Przenieść ciałka tłuszczowe z powrotem do sitek komórkowych.
6. Przemyć 3 razy, po 30 minut każde pranie, w 0,3% PBTB przy łagodnym mieszaniu.
7. Blokować w 0,3% PBTB z dodatkiem 5% normalnego surowicy osła przez 1 godzinę przy łagodnym mieszaniu.
8. Inkubować z odpowiednim przeciwciałem wtórnym rozcieńczonym (zgodnie ze specyfikacją producenta) w roztworze blokującym (0,3% PBTB z dodatkiem 5% normalnego surowicy osła w 0,3% PBT) przez 2 godziny przy delikatnym mieszaniu. Jeśli przeciwciało jest fluorescencyjne, od tego momentu inkubację należy prowadzić w ciemności. Krok ten wykonuje się zazwyczaj w probówkach o pojemności 0,2 ml na rotatorze.
9. Przemyć 3 razy przez 30 minut każdy z użyciem 0,3% PBT przy łagodnym mieszaniu.

5. Montowanie preparatu

1. Przenieś ciało tłuszczowe do czystej probówki typu Eppendorf. Bardzo ostrożnie usuń wszystkie ciecze i natychmiast przykryj próbkę medium montażowym Vectashield. Stosujemy Vectashield rutynowo, ponieważ nie twardnieje on podczas oddzielania jajników od ciała tłuszczowego.
   Próbki można przechowywać w medium montażowym w temperaturze 4°C do tygodnia.
2. Odetnij koniec końcówki pipety i użyj jej do ostrożnego przeniesienia ciała tłuszczowego wraz z minimalną objętością medium montażowego (około 30 μl dla szkiełka nakrywkowego o średnicy 30 mm) na szkiełko mikroskopowe.
3. Użyj dwóch niklowanych uchwytów do szpilek z igłami o średnicy 0,1 mm, aby rozłożyć ciało tłuszczowe. Jajniki znajdują się w tylnej jednej trzeciej ciała tłuszczowego. Ciało tłuszczowe je otaczające ma zazwyczaj kształt „kwiatu”, co ułatwia zlokalizowanie jajników. Wypreparuj „kwiaty” z pozostałej części ciała tłuszczowego, a tę drugą odrzuć.
4. Usuń ciało tłuszczowe otaczające gonadę, ostrożnie krzyżując nad nią dwie szpilki. Umieść wyizolowaną gonadę na szkiełku w pewnej odległości od pozostałości ciała tłuszczowego.
5. Przykryj szkiełkiem nakrywkowym i zabezpiecz lakierem do paznokci.
6. Wykonaj wizualizację bezpośrednio przy użyciu mikroskopu konfokalnego. Próbki można przechowywać w temperaturze 4°C do trzech tygodni.

6. Reprezentatywne wyniki

Powyższy protokół został przez nas wykorzystany do śledzenia powstawania kilku linii komórkowych w obrębie somatycznej tkanki jajnika, w tym GSCs oraz ich nisz somatycznych. W tym celu stosujemy specyficzne przeciwciała i markery, aby odróżnić poszczególne typy komórek w rozwijającym się gonadzie. Poniżej przedstawiamy przykład dwóch jajników LL3 barwionych różnymi kombinacjami przeciwciał. Rycina 1A uwypukla komórki filamentu terminalnego oraz komórki czepka (zielone), które wspólnie tworzą somatyczne komórki niszy. Rycina 1B przedstawia komórki przeplatające (ICs, magenta), które bezpośrednio kontaktują się z komórkami linii zarodkowej (niebieskie).

Rysunek 1. jajniki LL3. (A) przeciwciało monoklonalne 1B1 (magenta) obrysowuje komórki somatyczne i barwi fusom, wewnątrzkomórkowy organellum w PGC (strzałki). Pułapka wzmacniacza hh-lacZ (anty-β-galaktozydaza, zielony) jest wyrażana w filamentach terminalnych. U podstawy filamentu można zaobserwować somatyczne komórki czepne (groty strzałek). (B) przeciwciało 1B1 (zielony) obrysowuje wszystkie komórki somatyczne w jajniku. Anti-Vasa (niebieski) znakuje wszystkie PGC. PGC pozostają w bezpośrednim kontakcie z komórkami Intermingled (ICs, anti-traffic jam, magenta). Pasek skali (dla A i B) wynosi 20 μm.

Dyskusja

W niniejszym filmie zaprezentowano protokół izolacji i barwienia jajników larw w późnym trzecim stadium rozwojowym. Aby rutynowo i rzetelnie przeprowadzać ten protokół, należy zwrócić uwagę na następujące kwestie:

1. W przypadku larw zsynchronizowanych i dobrze rozwiniętych należy unikać przepełnienia naczyń.
2. Aby zapobiec utracie małych, przezroczystych jajników, należy upewnić się, że ciało tłuszczowe zostało wypreparowane w całości. Ułatwi to również lokalizację jajników na etapie montowania, szcz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
NaCl	JT Baker
Kcl	Merck & Co., Inc.
CaCl2	Sigma-Aldrich
MgCl2	Merck & Co., Inc.
Sacharoza	JT Baker
Hepes	Sigma-Aldrich
PBS	Sigma-Aldrich
Triton X-100	Sigma-Aldrich
Albumina wołowa frakcja V	MP Biomedicals	160069
Pęseta biologiczna Dumont 5 dumstar polerowana	Fine Science Tools	11295-10
Niklowany uchwyt do szpilek	Fine Science Tools	26018-17
Szpilki s.s minutien średnica 0,1 mm, długość 10 mm	Fine Science Tools	26002-10
Płytki 9-dołkowe 85X100 mm, śr. zew. 22 mm x głębokość 7 mm	Corning	7220-85
Stereomikroskop MZ 16.5 ze standardową podstawą do oświetlenia przechodzącego TL ST	Leica Microsystems
Płytki 6-dołkowe	Costar	3516
Lamelki	Menzel-Glaser	798
Osłonki szkieł poglądowych	Corning	2940-223
Medium montażowe	Vectashield	H-1200
Sito do komórek	Falcon BD	FAL352350
Przeciwciało 1B1	Developmental Studies Hybridoma Bank
Anti-Traffic Jam	Laboratory of Dr. Dorothea Godt
Anti-Vasa	Laboratory of Dr. Ruth Lehmann
Anti β-Galaktozydaza	Cappel
Przeciwciała wtórne	Jackson ImmunoResearch