Sposób, w jaki nisze i komórki macierzyste tworzą się podczas rozwoju, jest istotnym zagadnieniem o praktycznym znaczeniu. W jajniku Drosophila komórki macierzyste linii zarodkowej oraz ich nisze somatyczne powstają podczas rozwoju larwalnego. Niniejszy film prezentuje sposób preparowania, barwienia i montowania gonad samic larw Drosophila w późnym trzecim stadium larwalnym (LL3).
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Disekcja i barwienie jajników larw Drosophila
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wiele narządów zależy od komórek macierzystych w procesie rozwoju podczas embriogenezy oraz w procesach utrzymania lub naprawy w życiu dorosłym. Zrozumienie sposobu formowania się komórek macierzystych oraz ich interakcji z otoczeniem jest zatem kluczowe dla zrozumienia rozwoju, homeostazy i chorób. Jajnik muszki owocówki Drosophila melanogaster służy jako wpływowy model interakcji komórek macierzystych linii zarodkowej (GSCs) z ich somatycznymi komórkami wspierającymi (niszą) 1, 2. Znana lokalizacja niszy i GSCs, w połączeniu z możliwością ich manipulacji genetycznej, pozwoliła badaczom wyjaśnić szereg interakcji między komórkami macierzystymi a ich niszami 3-12.
Mimo bogactwa informacji na temat mechanizmów kontrolujących utrzymanie i różnicowanie GSC, stosunkowo niewiele wiadomo o tym, jak GSC i ich nisze somatyczne formują się podczas rozwoju. Około 18 nisz somatycznych, których skład komórkowy obejmuje włókno końcowe oraz komórki czepne (Rysunek 1), powstaje podczas trzeciego stadium larwalnego 13-17. GSC pochodzą z pierwotnych komórek płciowych (PGCs). PGCs proliferują we wczesnych stadiach larwalnych, jednak po sformowaniu niszy podgrupa PGCs przekształca się w GSCs 7, 16, 18, 19. Razem komórki niszy somatycznej i GSCs tworzą jednostkę funkcjonalną, która produkuje jaja przez cały okres życia organizmu.
Wiele pytań dotyczących formowania się jednostki GSC pozostaje bez odpowiedzi. Procesy takie jak koordynacja między komórkami prekursorowymi nisz a prekursorami komórek macierzystych lub generowanie asymetrii w PGC w momencie przekształcania się w GSC, można najlepiej badać w larwie. Jednak systematyczne badanie rozwoju jajników larwalnych jest trudne pod względem technicznym. Po pierwsze, jajniki larwalne są małe. Nawet w późnych stadiach larwalnych ich średnica wynosi zaledwie 100μm. Dodatkowo jajniki są przezroczyste i zatopione w białym ciele tłuszczowym. W niniejszym opracowaniu opisujemy szczegółowy protokół izolacji jajników z larw Drosophila w późnym trzecim stadium (LL3), a następnie ich barwienia przeciwciałami fluorescencyjnymi. Proponujemy rozwiązania techniczne dla takich problemów jak lokalizacja jajników, barwienie i przemywanie tkanek, które nie opadają na dno, oraz zapewnienie penetracji przeciwciał do wnętrza tkanki. Protokół ten można zastosować również do wcześniejszych stadiów larwalnych oraz do jąder larwalnych.
Protokół
1. Składanie jaj
- Pięć dni przed sekcją: należy pozwolić zapłodnionym samicom na składanie jaj przez 2-4 godziny na świeżej pożywce wzbogaconej drożdżami. Aby uzyskać zsynchronizowane i dobrze rozwinięte larwy, ważne jest, aby nie dopuścić do przeludnienia hodowli (około 30 jaj na fiolkę 25 mm). Zazwyczaj do jednej fiolki używa się od 7 do 16 samic, w zależności od ich wydajności w składaniu jaj.
2. Wybór larw
- Przygotować szklaną szalkę sekcyjną z 9 dołkami wypełnioną roztworem Ringera (128mM NaCl, 2mM Kcl, 1.8mM CaCl2, 4mM MgCl2, 35.5mM sacharozy, 5mM Hepes pH 6.9).
- Przygoto....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W niniejszym filmie zaprezentowano protokół izolacji i barwienia jajników larw w późnym trzecim stadium rozwojowym. Aby rutynowo i rzetelnie przeprowadzać ten protokół, należy zwrócić uwagę na następujące kwestie:
- W przypadku larw zsynchronizowanych i dobrze rozwiniętych należy unikać przepełnienia naczyń.
- Aby zapobiec utracie małych, przezroczystych jajników, należy upewnić się, że ciało tłuszczowe zostało wypreparowane w całości. Ułatwi to również lokalizację jajników na etapie montowania, szcz.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono konfliktów interesów.
Podziękowania
IM jest wspierany przez grant reintegracyjny Marii Skłodowskiej-Curie. Praca ta została sfinansowana z grantu nr 1146/08 Israel Science Fund, przez Helen and Martin Kimmel Institute for Stem Cell Research w Weizmann Institute of Science oraz Leir Charitable Foundation.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| NaCl | JT Baker | ||
| Kcl | Merck & Co., Inc. | ||
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | ||
| MgCl2 | Merck & Co., Inc. | ||
| Sacharoza | JT Baker | ||
| Hepes | Sigma-Aldrich | ||
| PBS | Sigma-Aldrich | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | ||
| Albumina wołowa frakcja V | MP Biomedicals | 160069 | |
| Pęseta biologiczna Dumont 5 dumstar polerowana | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Niklowany uchwyt do szpilek | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| Szpilki s.s minutien średnica 0,1 mm, długość 10 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Płytki 9-dołkowe 85X100 mm, śr. zew. 22 mm x głębokość 7 mm | Corning | 7220-85 | |
| Stereomikroskop MZ 16.5 ze standardową podstawą do oświetlenia przechodzącego TL ST | Leica Microsystems | ||
| Płytki 6-dołkowe | Costar | 3516 | |
| Lamelki | Menzel-Glaser | 798 | |
| Osłonki szkieł poglądowych | Corning | 2940-223 | |
| Medium montażowe | Vectashield | H-1200 | |
| Sito do komórek | Falcon BD | FAL352350 | |
| Przeciwciało 1B1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Anti-Traffic Jam | Laboratory of Dr. Dorothea Godt | ||
| Anti-Vasa | Laboratory of Dr. Ruth Lehmann | ||
| Anti β-Galaktozydaza | Cappel | ||
| Przeciwciała wtórne | Jackson ImmunoResearch |
Bibliografia
- Fuller, M. T., Spradling, A. C. Male and female Drosophila germline stem cells: two versions of immortality. Science. 316, 402-404 (2007).
- Li, L., Xie, T. Stem cell niche: structure and function. Annual review of cell and developmental biology. 21<....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
