Prosty sposób pomiaru wrażliwości much na etanol

Podsumowanie

Opisano prosty test służący do pomiaru działania sedatywnego etanolu na muszki Drosophila, oparty na utracie odruchu prostowania.

Streszczenie

Niskie dawki etanolu powodują nadaktywność u much, podczas gdy wysokie dawki działają uspokajająco. Wrażliwość danej linii much na sedację indukowaną etanolem koreluje z preferencją tej linii do etanolu, w związku z czym sedacja jest wysoce istotnym miernikiem w badaniu genetyki reakcji na alkohol oraz nawyków picia. Prezentujemy prosty sposób narażania much na etanol i pomiaru jego efektów odurzających. Opisany przez nas test pozwala określić zarówno wrażliwość ostrą, jak i tolerancję na etanol indukowaną powtarzalną ekspozycją. Nie wymaga on skomplikowanej aparatury i może być zatem zastosowany w każdym laboratorium wyposażonym w podstawowe narzędzia do hodowli much.

Protokół

1. Tworzenie komory ekspozycyjnej

1. Przetnij korek do fiolki na pół za pomocą żyletki. Alternatywnie można użyć kulek waty.
2. Wciśnij połowę korka lub kulkę waty na dno fiolki z pożywką, aby stworzyć gładką powierzchnię, w której muchy nie będą utykać.
3. W przypadku przygotowywania wielu komór ekspozycyjnych należy upewnić się, że korek i pożywka zajmują tę samą objętość w każdej komorze. Można to ułatwić, wykonując oznaczenie na ściance fiolki.

2. Ekspozycja much

1. Dzień przed ekspozycją zebrać 8 much jednej płci w wieku 1-5 dni do zwykłych fiolek z pożywką bez drożdży.
2. Oznaczyć je kodem w taki sposób, aby osoba przeprowadzająca eksperyment nie znała faktycznego genotypu/szczepu.
3. Przenieść osiem much do komór ekspozycyjnych poprzez delikatne wystukanie. Nie stosować znieczulenia.
4. Do 20-procentowego etanolu dodać niewielką ilość barwnika spożywczego, np. acid blue 9, aby uczynić go łatwo widocznym.
5. Nasączyć spód korka do fiolki lub kulkę waty 0,5 ml etanolu.
6. Włożyć korek z etanolem do fiolki ekspozycyjnej. Upewnić się, że alkohol jest skierowany do wnętrza fiolki, a nie w stronę jej ścianek.
7. Uruchomić stoper.

3. Rejestracja upośledzenia funkcji wywołanego etanolem

1. W każdej minucie po uruchomieniu minutnika lekko uderz w komorę ekspozycyjną leżącą na blacie, aby pobudzić muchy, a następnie obserwuj je przez dziesięć sekund.
2. Zapisz liczbę nieruchomych much dla każdej minuty. Muchy uznaje się za nieruchome, jeśli nie potrafią podnieść się z grzbietu, pozostają w jednym miejscu lub gwałtownie drgają skrzydłami przez cały dziesięciosekundowy okres obserwacji. Muchy wykazujące te ostatnie zachowanie uznaje się za nieruchome, ponieważ zdecydowana większość z nich pozostaje w bezruchu pomiędzy okresami gwałtownego poruszania skrzydłami. Muchy NIE są nieruchome, jeśli potrafią podnieść się z grzbietu i odejść i/lub wejść na ściankę fiolki.
3. Próbę ekspozycyjną kończy się w momencie, gdy odnotowano 4 lub więcej nieruchomych much.
4. Wyrzuć muchy i pozostaw komorę ekspozycyjną do przewietrzenia przed ponownym użyciem.

4. Wyznaczenie czasu do 50% sedacji

Czas do 50% sedacji (ST50) to czas po rozpoczęciu ekspozycji na etanol, w którym cztery z ośmiu much pozostają w bezruchu. Jest on wyznaczany w następujący sposób:
Albo: pierwsza minuta pomiaru, w której dokładnie cztery muchy są w bezruchu.
Albo: jeśli w jednym punkcie pomiarowym (minuta X) w bezruchu jest mniej niż cztery muchy (Y1), a w kolejnym punkcie pomiarowym (minuta X+1) więcej niż cztery (Y2), wówczas ST50 wyznacza się poprzez interpolację liniową według wzoru:
ST50 = (4 - Y1)/(Y2 - Y1) + X

5. Powtórna ekspozycja w celu określenia tolerancji

Naświetlanie much

1. Wyznacz ST50(wt) dla szczepu kontrolnego typu dzikiego użytego w eksperymencie.
2. Poddaj grupy eksperymentalne much działaniu etanolu zgodnie z powyższym opisem.
3. Zmierz ich ST50(1), ale kontynuuj ekspozycję aż do osiągnięcia czasu 2x ST50(wt).
4. Przenieś muchy z powrotem do pustej probówki z pożywką i utrzymuj w niej przez 4 godziny.
5. Ponownie poddaj muchy działaniu etanolu i wyznacz ST50(2) dla drugiej ekspozycji.

Wyznacz tolerancję

Oblicz tolerancję w % jako (ST50(2)/ ST50(1) - 1)x10.

6. Reprezentatywne wyniki:

Przedstawione tutaj są reprezentatywne wyniki uzyskane przy użyciu 6-8 fiolek z muchami na genotyp i dawkę. Jeśli błąd standardowy jest znacznie większy, prawdopodobnie wystąpił problem systematyczny. Należy upewnić się, że etanol jest skierowany do komór ekspozycyjnych i że komory mają taką samą objętość.

Rysunek 1. Krzywa dawka-odpowiedź much typu dzikiego eksponowanych na rosnące stężenia etanolu. Dla każdej dawki i płci zastosowano osiem fiolek z muchami. Samce i samice wykazują tę samą wartość ST50 dla każdej dawki (p>0,2, dwuczynnikowa analiza wariancji ANOVA), podczas gdy ST50 dla wszystkich dawek istotnie spada wraz ze wzrostem dawki etanolu (p<0,01). Należy zauważyć, że muchy z przepełnionych butelek mogą być znacznie mniejsze od tych z butelek o prawidłowej populacji, a ta różnica w wielkości może wpływać na ST50. Do każdej butelki należy wprowadzić 15–20 samic składających jaja przez 1–2 dni, aby uzyskać optymalną gęstość larw w butelce.

Rycina 2. Narażenie much na etanol o stężeniu 90% lub 10% odtwarza opisaną wcześniej odporność na etanol wywołaną przez mutację white rabbit1 (p<0,01, dwuczynnikowa analiza wariancji (ANOVA)).

Rysunek 3. Powtarzalna ekspozycja na 10% etanol, z zachowaniem 4-godzinnego odstępu na regenerację, powoduje istotny wzrost ST50 po drugiej ekspozycji (p<0,01, parzysty test t). Należy zauważyć, że podczas pierwszej ekspozycji muchy były poddane działaniu bodźca przez 24 minuty (co odpowiada dwukrotności ich naiwnego ST50). Ekspozycja przez krótszy czas (12 minut) nie spowodowała istotnego wzrostu ST50 przy ponownej ekspozycji (dane nie zostały przedstawione).

Dyskusja

W niniejszej prezentacji przedstawiliśmy prosty sposób określania upojenia indukowanego etanolem, oparty na wcześniejszych testach opisanych przez Baintona i wsp. 2000¹ oraz Rothenfluha i wsp. 2006². Ponieważ sedacja wywołana alkoholem jest skorelowana z preferencją spożywania alkoholu³, badanie to jest istotne dla analizy zaburzeń związanych z używaniem alkoholu. Opisany test opiera się na negatywnej geotaksji indukowanej bodźcem stresowym oraz na tym, w jaki sposób ekspozycja na alkohol zakłóca tę wrodzoną reakcję. Przed rozpoczęciem ekspozycji należy upewnić się, że wszystkie muchy wykazują prawidłową reakcję na taki bodziec, tzn. po ostrym uderzeniu w fiolkę z pożywieniem, w której znajdują się muchy, wszystkie powinny przemieścić się z dna ku górze w ciągu 10 sekund czasu obserwacji. Przykładami much o zredukowanej negatywnej geotaksji są mutanty z drgawkami wrażliwymi na wstrząs (bang-sensitive seizure mutants)⁵ oraz muchy z deficytami lokomocyjnymi spowodowanymi degeneracją neuronów dopaminergicznych⁶.

Mimo że opisany test jest stosunkowo prosty, dwie zmienne wymagają szczególnej uwagi w celu zapewnienia powtarzalnych wyników. Po pierwsze, wszystkie fiolki ekspozycyjne powinny mieć tę samą objętość. Obejmuje to upewnienie się, że dno fiolki zawiera taką samą objętość pożywki + zatyczki do fiolki/kuli bawełnianej, a także wkładanie zatyczki zawierającej etanol na tę samą głębokość w każdej fiolce. W teście można zastosować całkowicie pustą fiolkę, ale prowadzi to do dłuższych wartości ST50, co zmniejsza przepustowość analizy.

Niniejszy test nadaje się również do określenia stopnia tolerancji wypracowanej przez muchy w wyniku powtarzalnej ekspozycji na etanol. Przy przeprowadzaniu powtórnych ekspozycji należy wziąć pod uwagę szereg zmiennych. Po pierwsze, odstęp między ekspozycjami opisany jest tutaj jako 4 godziny. Zmienna ta może ulec zmianie, jednak zalecamy, aby nie była ona krótsza niż 2 godziny, aby zapewnić usunięcie etanolu po pierwszej ekspozycji. Kinetykę rozwoju i zaniku tolerancji na etanol opisano w pracy Scholz et al. 2000⁴. Drugą zmienną, którą należy rozważyć, jest czas trwania pierwszej ekspozycji. Musi on być oczywiście taki sam dla much kontrolnych i doświadczalnych. Może to jednak nie skutkować dostarczeniem tej samej ilości etanolu obu tym szczepom much. Muchy uspokojone wchłaniają więcej etanolu niż muchy aktywne², zatem szczep, który szybciej ulega sedacji, może otrzymać wyższą dawkę niż szczep sedowany później, a w konsekwencji rozwinąć większą tolerancję ze względu na wyższą dawkę początkową. Silnie ostrzegamy czytelnika przed porównywaniem rozwoju tolerancji u szczepów wykazujących różnice w początkowym ST50(1).

Opisany tutaj test jest użytecznym narzędziem do łatwego i powtarzalnego określania reakcji behawioralnych much na alkohol.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Fiolki do ekspozycji	www.flystuff.com	32-116
Zatyczki	www.flystuff.com	49-102
Acid Blue 9	Sigma-Aldrich	861146