Separacja kulek i komórek w wielokanałowych urządzeniach mikroprzepływowych z wykorzystaniem dielektroforezy i przepływu laminarnego

Podsumowanie

Dielektroforeza (DEP) jest skuteczną metodą manipulowania komórkami. Płytki drukowane (PCB) mogą stanowić niedrogie, wielokrotnego użytku i wydajne elektrody do bezkontaktowego manipulowania komórkami w urządzeniach mikroprzepływowych. Poprzez połączenie kanałów mikroprzepływowych opartych na PDMS z szkiełkami nakrywowymi na płytkach PCB, demonstrujemy manipulację i separację kulek oraz komórek w wielokanałowych urządzeniach mikroprzepływowych.

Streszczenie

Urządzenia mikroprzepływowe usprawniły badania nad komórkami, zapewniając dynamiczne środowisko płynowe w skali komórkowej, co pozwala na badanie, manipulowanie, sortowanie i liczenie komórek. Jednak manipulowanie komórkami wewnątrz domeny płynowej wciąż stanowi wyzwanie i wymaga skomplikowanych protokołów wykonawczych w celu formowania zaworów i elektrod lub wymaga specjalistycznego sprzętu, takiego jak pęsety optyczne. W niniejszej pracy wykazujemy, że konwencjonalne płytki drukowane (PCB) mogą być wykorzystane do bezkontaktowego manipulowania komórkami poprzez zastosowanie dielektroforezy (DEP) do manipulowania koralikami i komórkami w laminarnych polach przepływu w celu bioaktywacji, a także do separacji komórek i koralików w wielokanałowych urządzeniach mikroprzepływowych. Po pierwsze, przedstawiamy protokół montażu elektrod DEP i urządzeń mikroprzepływowych oraz przygotowania komórek do DEP. Następnie charakteryzujemy działanie DEP za pomocą koralików polistyrenowych. Na koniec prezentujemy reprezentatywne wyniki separacji koralików i komórek w wielokanałowym urządzeniu mikroprzepływowym. Podsumowując, DEP jest skuteczną metodą manipulowania cząsteczkami (koralikami lub komórkami) wewnątrz urządzeń mikroprzepływowych.

Protokół

Ogólny schemat konfiguracji sprzętowej przedstawiono na Rycynie 1A. Szczegóły zestawu próbka-PCB ukazano na schemacie przekroju poprzecznego na Rycynie 1B.

1. Przygotowanie elektrod PCB:

1. Zaprojektuj elektrody PCB o pożądanej geometrii, aby wytworzyć niejednorodne pole elektryczne. Spersonalizowane układy elektrod PCB można zamówić w komercyjnych zakładach produkcyjnych (Rycina 1C).
2. Przygotuj prefabrykowane elektrody PCB, przylutowując przewód o rozmiarze 16-gauge do końca każdej drukowanej elektrody metalowej (Rycina 1D).
   1. Przyłóż przewód do końca elektrody. Przytrzymaj przewód w miejscu na metalowym obszarze PCB za pomocą gorącej lutownicy, aby go rozgrzać.
   2. Podaj niewielką ilość spoiwa do rozgrzanego przewodu, aby wypełnić go lutem.
   3. Po wypełnieniu przewodu lutem usuń lutownicę, przytrzymując przewód w miejscu do czasu ostygnięcia spoiwa.
3. Powtórz proces lutowania dla każdego połączenia elektrycznego na PCB (Rycina 1D).

2. Przygotowanie kanałów mikroprzepływowych:

1. Kanały mikrofluidyczne na bazie polydymetylosiloksanu (PDMS) przygotowuje się przy użyciu elastomeru PDMS Sylgard 184 firmy Dow Corning. Matryca definiująca kanały jest zazwyczaj tworzona standardowymi procesami mikrofabrykacji z wykorzystaniem wafla krzemowego i fotorezystu SU-8.
2. Mieszaj bazę z utwardzaczem w stosunku 10:1 przez 5 minut.
3. Wlej ciekawy PDMS na prefabrykowaną matrycę SU-8 i usuń pęcherzyki powietrza, poddając ciekły PDMS działaniu próżni przez kilka minut. W razie potrzeby powtórz proces próżniowy, aby całkowicie usunąć wszystkie pęcherzyki.
4. Utwardzaj PDMS w temperaturze 70 °C przez 2 godziny.
5. Oddziel płytkę PDMS z kanałami mikrofluidycznymi od wafla za pomocą żyletki, uważając, aby nie rozbić wafla.
6. Wykonaj otwory do wprowadzania płynów i komórek do urządzenia mikrofluidycznego. (Uwaga: W przypadku DEP można stosować pompowanie strzykawką, przepływ grawitacyjny lub przepływ oparty na napięciu powierzchniowym).
7. Obejrzyj urządzenie mikrofluidyczne, aby upewnić się, że jest wolne od kurzu i zanieczyszczeń. Czyszczenie PDMS można łatwo przeprowadzić za pomocą taśmy 3M Scotch Magic Tape.
8. Połącz kanały mikrofluidyczne PDMS z czystym szkiełkiem nakrywkowym o grubości nr 0 (80-130 μm) za pomocą plazmy. Podgrzewaj zespół szkiełko-mikrofluidyka w temperaturze 10 °C przez co najmniej 15 min.

3. Przygotowanie pożywki o niskiej przewodności:

1. Pożywka o niskiej przewodności jest przygotowywana poprzez zmieszanie 8,5% sacharozy + 0,3% glukozy (m/v) w wodzie dejonizowanej (DI).¹
   Uwaga: Wykazaliśmy wcześniej, że komórki mogą być hodowane przez wiele dni w konwencjonalnych pożywkach do hodowli komórkowej po krótkotrwałej ekspozycji (około 30 min) na niską przewodność.¹¹

4. Montaż kanałów mikroprzepływowych na elektrodach PCB:

1. Nanieś niewielką ilość (około 10 μL) oleju mineralnego na PCB, aby zapewnić szczelny kontakt między PCB a szkiełkiem nakrywkowym.
   Uwaga: Opcjonalnym krokiem w celu ograniczenia widoczności elektrod jest pokrycie powierzchni PCB bardzo cienką warstwą czarnego markera permanentnego lub farby.
2. Umieść zespół szkiełka nakrywkowego i kanału mikrofluidycznego na naoliwionym PCB w taki sposób, aby szkiełko stykało się z olejem (szkiełkiem do dołu). Delikatnie dociśnij zespół szkiełka nakrywkowego i mikrofluidyki, aby zapewnić dobry kontakt i zminimalizować pęcherzyki powietrza, które mogą utrudniać wizualizację komórek i kulek. Przykład gotowego urządzenia przedstawiono na Ryc. 1D.

5. Sortowanie i zagęszczanie kulek oraz komórek przy użyciu DEP:

1. Wypełnij kanały mikrofluidyczne wodą dejonizowaną (DI) lub medium o niskiej przewodności; proces wiązania plazmowego ułatwia wprowadzanie roztworów wodnych do kanałów mikrofluidycznych poprzez tymczasową zmianę zwykle hydrofobowej powierzchni PDMS na hydrofilową.
2. Wprowadź komórki i/lub kulek polistyrenowych do zbiornika kanału (Rysunek 1C). W tej procedurze zastosowano komórki ludzkiego gruczolaka jelita grubego (HT-29).
3. Podłącz wyjście generatora funkcji do wejścia wzmacniacza mocy prądu przemiennego (AC), a następnie podłącz wyjście wzmacniacza do przewodów elektrod. Osłoń wszystkie przewody elektryczne i powierzchnie układu taśmą izolacyjną, aby chronić użytkowników przed potencjalnym porażeniem prądem. Schematyczny rysunek konfiguracji sprzętu przedstawiono na Rysunku 1A.
4. Ustaw generator funkcji tak, aby generował sygnał sinusoidalny o częstotliwości 1,0-1,5 MHz. Amplitudę sygnału wyjściowego należy dostosować tak, aby wzmacniacz mocy RF generował napięcie wyjściowe od 80-10V na PCB. Wzmacniacz mocy RF użyty w tej pracy wymaga napięcia wejściowego około 20-30 mV. Aby oddzielić komórki od kulek, szybkość przepływu laminarnego musi być zgodna z siłą DEP, aby przemieścić komórki i kulki wewnątrz głównego kanału (szerokość w = 100 μm, wysokość h = 27 μm) do kanałów docelowych (szerokość w = 10 μm, wysokość h = 27 μm).
   Uwaga: Skonsultuj się z producentem PCB w celu ustalenia maksymalnych napięć roboczych, aby uniknąć problemów takich jak przegrzanie lub stopienie PCB. Sprawdź specyfikacje producentów generatora funkcji i wzmacniacza mocy, aby ustalić bezpieczne ustawienia eksploatacyjne.
5. Uruchom DEP w celu sortowania komórek i kulek. Komórki ulegają dodatniej DEP (positive-DEP), natomiast kulki polistyrenowe ulegają ujemnej DEP (negative-DEP) w niejednorodnym polu elektrycznym w określonych częstotliwościach. Umożliwia to aktywowane siłą DEP bioaktuowanie i separację komórek oraz innych cząsteczek w urządzeniach mikrofluidycznych przy użyciu przystępnych cenowo i wielokrotnego użytku płytek PCB jako elektrod.

6. Reprezentatywne wyniki:

Gdy DEP skutecznie oddziałuje na komórki lub cząstki, w kąpielach statycznych lub przy niskich prędkościach przepływu cieczy obserwuje się wyraźne ustawienie wzdłuż niejednorodnych pól elektrycznych. W warunkach wyższych prędkości przepływu cieczy zachowanie komórek lub cząstek zależy od orientacji przepływu osiowego względem pola elektrycznego oraz od prędkości przepływu. Ponadto zachowanie komórek i cząstek zależy również od natężenia pola elektrycznego oraz stopnia jego niejednorodności. Typowe zachowania komórek lub cząstek obejmują tworzenie tzw. „łańcuchów pereł”, cykliczność, zatrzymywanie się lub obracanie.

Czynniki, które osłabiają lub znoszą DEP, obejmują obecność soli lub innych cząsteczek jonowych w cieczy, słabą natężenie pola elektrycznego, nadmierne prędkości przepływu, zbyt grube szkiełka nakładkowe lub obecność roztworów przewodzących między szkiełkiem nakładkowym a elektrodami PCB (np. pęknięte szkiełko nakładkowe może doprowadzić do zmieszania wody z olejem mineralnym).

W tym przypadku, przy zastosowaniu szkiełek podstawowych o grubości nr 0 (80-130 μm) i odstępie między elektrodami wynoszącym (231 μm), gradient kwadratu natężenia pola elektrycznego przyłożonego do komórek HT-29 i kulek szacuje się na wartość od 2^-8 do 6^-8 V²/μm³.¹

Siłę DEP można oszacować, mierząc prędkość cząsteczki manipulowanej za pomocą DEP w statycznym płynie (Rysunek 2A-B). Ze względu na niewielką bezwładność cząsteczki oraz wysoką lepkość środowiska w kanale mikroprzepływowym, siła oporu hydrodynamicznego będzie równa sile DEP, lecz skierowana w przeciwnym kierunku. Średnia prędkość kulek w mediach o niskiej przewodności wynosi 34,5 μm/s przy napięciu DEP 93 Vpp i częstotliwości 1,5 MHz. Siłę oporu hydrodynamicznego można obliczyć za pomocą następującego równania.¹

F_drag = 6πηRv

Średnia lepkość η mediów o niskiej przewodności w temperaturze 20 °C wynosi 1,27 mPa•s, a promień kulek R wynosi 7,5 μm. Siłę oporu hydrodynamicznego dla polistyrenowych mikrokulek oszacowano na 6,19 pN. Aby zademonstrować możliwość sterowania kuleczkami wewnątrz kanałów mikroprzepływowych (Rysunek 2C-F), zainicjowano przepływ mediów o niskiej przewodności, wykorzystując przepływ sterowany napięciem powierzchniowym. Średnia prędkość kulek w pojedynczym kanale wlotowym wynosiła 1540 μm/sec, natomiast średnia prędkość w poszczególnych kanałach została zredukowana do 565 μm/sec (Rysunek 2C). Poprzez zainicjowanie DEP, kulki zostały zatrzymane w kanale centralnym zamiast zostać wypchnięte do kanału bocznego. Zatem w tych warunkach siły DEP były wystarczające, aby przełamać siłę oporu płynu prowadzącą do dwóch kanałów bocznych.

Tę samą zasadę zastosowano w celu przekierowania kulek z kanału centralnego do pojedynczego kanału bocznego poprzez prostą zmianę orientacji kanałów i przepływu kulek względem elektrod DEP (Rysunek 2E-F). Dzięki ustawieniu metalowej elektrody pod kątem po stronie pojedynczego kanału wlotowego, po zainicjowaniu DEP kulki były kierowane w stronę ścianki kanału w miarę zbliżania się do punktu trifurkacji. W tym miejscu siły DEP były wystarczające, aby wciągnąć kulki do jednego z kanałów bocznych, w którym przepływ laminarny nadal pchał je w dół kanału (Rysunek 2F).

Ponieważ komórki i kulki polistyrenowe wykazują wyraźne różnice w zdolności do polaryzacji i przemieszczania się w niejednorodnych polach elektrycznych, wykorzystaliśmy DEP do zademonstrowania możliwości jednoczesnej separacji komórek i kulek na chipie. Zastosowano tę samą strukturę kanału mikrofluidycznego i elektrody PCB, co w konfiguracji przedstawionej na Rysunku 2E-F, wprowadzając zawiesinę komórek HT-29 i kulek w medium o niskiej przewodności do pojedynczego kanału wlotowego (Rysunek 3). Po zastosowaniu DEP, w tych warunkach, komórki HT-29 zostały zatrzymane w dwóch lewych kanałach wylotowych, podczas gdy kulki zostały zatrzymane w pojedynczym kanale wylotowym po prawej stronie. W tym przypadku komórki wykazują charakterystyczne zachowanie tworzenia „łańcuchów pereł” podczas zbierania ich w lewym kanale wylotowym. Okazyjnie kulka i komórka łączą się ze sobą, w wyniku czego są zbierane wspólnie, często w kanałach wylotowych dla komórek. Na podstawie tych danych eksperymentalnych określiliśmy szybkość sortowania na poziomie 713 cząsteczek (komórek i kulek) na minutę, co odpowiada 14 260 komórkom i kulkom w ciągu 20 minut. Liczba odzyskanych komórek i kulek jest istotna i użyteczna w zastosowaniach biologii molekularnej, obrazowania, biochemii oraz w systemach lab-on-a-chip.

Rysunek 1. DEP komórek i cząstek w kanałach mikroprzepływowych z wykorzystaniem PCB. (A) Konfiguracja aparatury do aktywacji opartej na DEP rozpoczyna się od generatora funkcji służącego do zdefiniowania częstotliwości i amplitudy sygnału elektrycznego, a następnie wzmacniacza mocy, który zwiększa natężenie sygnału pola elektrycznego generowanego na płytce PCB. (B) Zespół urządzenia mikroprzepływowego do aktywacji próbek składa się z mikroprzepływowych kanałów z PDMS nieodwracalnie związanych z szkiełkiem nakrywkowym o grubości nr 0 (80-130 μm) za pomocą plazmy tlenowej, media nieprzewodzące do kąpieli komórek i/lub kulek. (C) Zastosowane tutaj elektrody PCB składają się z dwóch obszarów z elektrodami grzebieniowymi, co pozwala na wytworzenie silnego niejednorodnego pola elektrycznego. (D) Gotowe urządzenie: PCB z rozgałęzionym urządzeniem mikroprzepływowym na pojedynczej szkiełku nakrywkowym; wstawka przedstawia całe urządzenie z przewodami elektrod. (C-D) W celu określenia skali: wymiary PCB wynoszą 8,4 cm (długość), 2,1 cm (szerokość), a szerokość elektrod wynosi 5 mm.

Rysunek 2. Reprezentatywne obrazy komórek i kulek w kanałach przed i w trakcie aktywacji DEP. (A) 15 μm fluorescencyjne kulek polistyrenowe w roztworze medium o niskiej przewodności w mikroprzepływowym kanale PDMS, bez przepływu laminarnego (upływ czasu, 1,23 s). (B) Po zainicjowaniu DEP kulki migrują w stronę wzorów elektrod PCB (czarne paski), a nie pomiędzy elektrody (upływ czasu, 8,18 s). (C) Kulki w tych samych kanałach w warunkach przepływu laminarnego rozdzielają się pomiędzy trzy oddzielne kanały (upływ czasu, 5,3 s); po zainicjowaniu DEP (D) kulki zostają skierowane do przepływu wyłącznie w kanale środkowym (upływ czasu, 4,3 s). (E) Poprzez zmianę orientacji kanałów względem elektrod PCB, kulki mogą być różnie kierowane do kanałów bocznych (F) przy użyciu DEP, a nie do kanału środkowego, jak pokazano w (D). (E-F) Upływ czasu wynosi odpowiednio 8,23 s i 5,16 s. Wszystkie paski skali = 100 μm.

Rysunek 3. Reprezentatywne obrazy komórek i kulek w kanałach przed i w trakcie aktywacji DEP. (A-B) Przed zainicjowaniem DEP mieszanina komórek ludzkiego gruczolaka jelita grubego (HT-29) oraz kulek przepływa z jednego kanału do 3 oddzielnych kanałów wyjściowych. Otwarta strzałka wskazuje kierunek przepływu laminarnego, a kanały zostały obrysowane przerywanymi liniami w celu orientacji i wyjaśnienia. (C-D) Poprzez indukcję DEP kuleczki i komórki są selektywnie kierowane do oddzielnych kanałów, zgodnie z oznaczeniami. Komórki HT-29 opuszczają kanał środkowy i lewy, natomiast kuleczki opuszczają kanał prawy. Podczas aktywacji DEP obserwuje się charakterystyczne tworzenie łańcuchów kuleczek i komórek. (A, C) Obrazowanie komórek i kuleczek w mikrokanałach przy użyciu kontrastu interferencyjnego (DIC) sprawia, że kuleczki są łatwo widoczne. Obrazy o skali intensywności Glow (B, D) wykonane na podstawie tych samych obrazów DIC (A, C) poprawiają wizualizację komórek w kanałach. Odblaskowe elektrody metalowe ((A, C) jasny pasek oraz (B, D) kolor żółty i zielony) stanowią wyraźny punkt orientacyjny do dopasowania mikrokanałów do elektrod w celu skutecznej aktywacji opartej na DEP. Paski skali = 100 μm.

Dyskusja

Manipulacja komórkami w urządzeniach mikrofluidycznych jest pożądana w celu sortowania lub selektywnego rozmieszczania pojedynczych komórek bądź do badań populacyjnych.² Przepływ laminarny jest wykorzystywany wraz z zaworami i pompami do manipulowania komórkami w obrębie urządzeń mikrofluidycznych. Jednakże same te metody są problematyczne i wymagają szczegółowych procesów oraz umiejętności w zakresie wytwarzania.³ Wirowanie może uprościć wymagania dotyczące rozmieszczania komórek, ale wyzwaniem pozostaje jednoczesne obrazowanie; ponadto architektura kanałów do wirowania musi być starannie przemyślana podczas projektowania pożądanych manipulacji oraz przy uwzględnieniu efektów sił dośrodkowych.⁴ Pęsety laserowe mogą być stosowane do rozmieszczania komórek, lecz metoda ta jest kosztowna i nie nadaje się do wysokoprzepustowego sortowania komórek.⁵ Niemniej jednak DEP okazało się skutecznym systemem „pęset elektrycznych” do efektywnego rozmieszczania, charakterystyki i manipulowania komórkami.^6,7

W szczególności DEP była wykorzystywana do selektywnego wychwytywania i sortowania komórek w celu przetwarzania na chipie komórek żywych i martwych,^7-10 or do zbierania komórek na sensorach rezonansowych w celu pomiaru masy komórek.¹¹ Wcześniej wykazaliśmy, że poprzez zwiększenie siły DEP działającej na bakterie lub kuleczki powyżej siły oporu hydrodynamicznego, możliwe jest zagęszczanie i pułapkowanie na chipie kuleczek polistyrenowych oraz Listeria monocytogenes V7 może zostać osiągnięte.¹² Mieszane populacje E. coli i *L. monocytogenes* Bakterie mogą być również kierowane i uwalniane za pomocą impulsów DEP. Ponadto większe cząstki mogą być różnicowo wychwytywane i koncentrowane na elektrodach w zależności od ich rozmiaru, podczas gdy mniejsze cząstki nie są wychwytywane, lecz usuwane wraz z przepływem cieczy.¹³ Gdy siły DEP nie pokonują sił oporu hydrodynamicznego działających na cząstki, koralik lub komórka nie zostaje przechwycona, lecz przemieszcza się wraz ze strumieniem cieczy. Jak pokazano na Rysunku 2C, koraliki mogą zostać skupione w centralnym obszarze strumienia cieczy w stopniu wystarczającym do ich utrzymania w kanale centralnym. Może to wynikać z połączonego efektu oddziaływań międzycząsteczkowych w polu elektrycznym, prędkości przepływu przewyższających siły przeciągania DEP, kombinacji tych czynników lub innego, niezdefiniowanego efektu.

Nowsze osiągnięcia w dziedzinie bezkontaktowej dielektroforezy (DEP) pozwalają na maksymalizację wychwytu i manipulacji komórkami przy minimalnym wymaganym polu, co w najwyższym możliwym stopniu chroni typy komórek podczas manipulacji DEP.^1,9 Bezkontaktowa dielektroforeza (DEP) daje duże możliwości społeczności zajmującej się mikroprzepływami w zakresie sortowania, zbierania i pozycjonowania komórek w urządzeniach mikroprzepływowych. Przewidujemy, że wraz ze wzrostem zapotrzebowania na DEP oraz jej wdrażaniem w celu manipulacji w urządzeniach mikroprzepływowych, dalsze odkrycia i innowacje rozszerzą zrozumienie i wpływ sił DEP.

PCB mogą być produkowane w procesach wielkoseryjnych w przystępnej cenie i z krótkim czasem realizacji, co czyni je dobrymi platformami do komercjalizacji. Ponadto PCB są łatwe w obsłudze i dostępne dla naukowców z różnych dyscyplin w celu manipulacji i sortowania komórek na chipie.

Projektując układ elektrod na płytce PCB, należy wziąć pod uwagę pożądaną trajektorię cząstki/komórki. Kluczowe czynniki, które należy rozważyć, to rozmiar i rodzaj cząstki (kuleczka i/lub komórka), typ komórki, rozmiar mikrokanału, prędkość przepływu, rozstaw elektrod (który determinuje natężenie pola elektrycznego), grubość szkiełka zakrywowego oraz przewodność cieczy. Czynniki te wpływają na siłę wymaganą i dostępną do manipulowania cząstką lub komórką, a w konsekwencji na wydajność rozdzielania. Przedstawiony tutaj protokół demonstruje efektywną konfigurację do inicjowania DEP w celu rozdzielania mikrosfer i komórek. W potencjalnych zastosowaniach użytkownicy powinni dopasować architekturę projektu kanału mikrofluidycznego do pożądanych ścieżek przepływu komórek i kuleczek, a także wzorce elektrod, aby zoptymalizować wydajność dla każdego zastosowania. Rozstaw elektrod i grubość szkiełka zakrywowego można dobrać zgodnie z wcześniej opisanymi wytycznymi podczas projektowania układu kanału mikrofluidycznego.¹

Przewodność i przenikalność elektryczna komórki/cząstki oraz otaczającego medium muszą być wystarczająco różne, aby umożliwić pozytywną lub negatywną DEP, przy jednoczesnym zachowaniu nienaruszonego stanu komórek. Polarność DEP dla cząstki sferycznej można określić na podstawie części rzeczywistej złożonej wartości następującego czynnika Clausiusa-Mosottiego przy częstotliwości ω napięcia DEP.

Równanie 1

W tym równaniu ε to przenikalność, σ to przewodność, a ε* to przenikalność zespolona. Indeksy p i m oznaczają odpowiednio cząstkę i ośrodek. Gdy komórka ma wyższą przenikalność niż ośrodek lub gdy część rzeczywista czynnika Clausiusa-Mosottiego staje się dodatnia, cząstka ulega silniejszej polaryzacji niż otaczający ją ośrodek. Ze względu na niejednorodne pole elektryczne, polaryzacja cząstki staje się niejednorodna, co wytwarza dodatnią siłę DEP (+DEP), która przyciąga komórkę w stronę obszaru o wyższym natężeniu pola elektrycznego. Jeśli komórka ma niższą przenikalność niż otaczający ją ośrodek lub gdy część rzeczywista czynnika Clausiusa-Mosottiego staje się ujemna, występuje ujemna DEP (-DEP), a komórka jest wypychana w stronę obszaru o minimalnym natężeniu pola. Jeśli komórka i ośrodek mają zbliżoną przenikalność zespoloną, nie powstaje siła umożliwiająca manipulację komórką. Z tego powodu czysta woda jest preferowanym ośrodkiem do manipulacji cząstkami za pomocą DEP. Jednak aby uniknąć stresu osmotycznego komórek wywołanego czystą wodą, opracowano ośrodki o niskiej przewodności, aby zachować niezmienioną przewodność, ale zwiększyć osmolarność w celu zmniejszenia stresu osmotycznego komórek. Konwencjonalne pożywki do hodowli komórkowych lub bufory fizjologiczne, takie jak DMEM lub PBS, charakteryzują się wysoką przewodnością, co nie jest odpowiednie do manipulacji DEP.

Wcześniej wykazaliśmy również, że komórki mogą być przechwytywane na czujnikach za pomocą DEP z wykorzystaniem mediów o niskiej przewodności. Po krótkim okresie adhezji komórek, media o niskiej przewodności można zastąpić wymaganym medium do hodowli komórkowej, aby wspierać wzrost komórek przez kilka dni.¹

Z naszego doświadczenia wynika, że kulek fluorescencyjnych są bardzo jasne w stosunku do fluorescencji żywych komórek, dlatego dopasowanie intensywności sygnału z kulek do intensywności żywej i fluorescencyjnej komórki może być wyzwaniem. Aby poprawić wizualizację zarówno komórek, jak i kulek, do obrazowania obu tych elementów wykorzystaliśmy mikroskopię DIC w mikroskopie odwróconym. W celu wyświetlenia komórek i kulek przedstawiliśmy dane na obrazie z intensywnością w skali poświaty (glow-scale), która zachowuje dane w szerokim spektrum kolorystycznym dla łatwiejszej obserwacji. Zatem podczas projektowania interesującego nas badania należy uwzględnić parametry obrazowania oraz dostępne zasoby.

Podsumowując, wykazaliśmy możliwość selektywnego kierowania kulek i komórek do oddzielnych kanałów przy użyciu DEP. Wraz z rosnącą użytecznością kanałów mikroprzepływowych w zastosowaniach biologii komórki, biochemia i bioinżynierii, DEP stanowi pożądany sposób zbierania, rozmieszczania i sortowania komórek. Wytwarzanie elektrod z PCB jest niedrogie i wygodne, elektrody są łatwe w użyciu, a krótki czas ich wykonania jest idealny do wdrażania DEP.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw Sylgard 184 (PDMS)	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Dow Corning Sylgard
Przewód połączeniowy 16 awg	Belden	8521	(Typ MW) Mil-W-76C-PVC
Pokrywkowe szkiełko Gold seal	Ted Pella, Inc.	260320	Grubość nr 0, 24 x 60 mm
Wycinak do biopsji Miltex	VWR international	95039-104	Miltex, różne rozmiary
Niestandardowe elektrody PCB	Bay Area Circuits	Części niestandardowe
Olej mineralny	Fisher Scientific	O121-1
Woda dejonizowana	Wewnętrzne źródło wody DI	Brak	Należy używać filtrowanej wody DI
D-glukoza bezwodna granulowana AR	Mallinckrodt Baker Inc.	4912-06
Sacharoza, krystaliczna	Mallinckrodt Baker Inc.	8360-06
Fluorescencyjne polimerowe mikrosfery	Bangs Laboratories	FS07F/9277	Mikrosfery Dragon green 15μm
Linia komórkowa HT-29	ATCC	HTB-38D	Ludzki gruczolakowirak jelita grubego
Trypsyna 0.05% EDTA	Invitrogen	25300054
Mikroskop pionowy Eclipse E600FN	Nikon Instruments	Eclipse E600FN
Kamera do obrazowania wysokiej prędkości Phantom V310	Phantom	V310
Badawczy mikroskop pionowy BX51	Olympus Corporation	BX51
Kolorowa kamera o wysokiej rozdzielczości SpotFlex	Diagnostic Instruments	FX1520
Generator funkcji	Agilent Technologies	3325A
Wzmacniacz mocy RF	EIN	2100L