Opisano metody obrazowania bioluminescencyjnego infekcji bakteryjnych u żywych zwierząt. Patogeny są modyfikowane w celu ekspresji lucyferazy, co umożliwia optyczne obrazowanie całego ciała w celu wykrycia infekcji u żywych zwierząt. Modele zwierzęce mogą zostać zainfekowane patogenami wykazującymi ekspresję lucyferazy, a wynikający z tego przebieg choroby może być wizualizowany w czasie rzeczywistym za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wykorzystanie lucyferazy do obrazowania infekcji bakteryjnych u myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Obrazowanie jest cenną techniką, która może być wykorzystywana do monitorowania procesów biologicznych. W szczególności obecność komórek nowotworowych, komórek macierzystych, specyficznych typów komórek odpornościowych, patogenów wirusowych, pasożytów i bakterii może być śledzona w czasie rzeczywistym w żywych zwierzętach 1-2. Zastosowanie obrazowania bioluminescencyjnego w badaniu patogenów wykazuje przewagi w porównaniu do konwencjonalnych strategii analizy infekcji w modelach zwierzęcych3-4. Infekcje mogą być wizualizowane u poszczególnych zwierząt w czasie, bez konieczności przeprowadzania eutanazji w celu określenia lokalizacji i ilości patogenu. Obrazowanie optyczne umożliwia kompleksowe badanie wszystkich tkanek i organów, zamiast pobierania próbek z miejsc wcześniej uznanych za zainfekowane. Ponadto dokładność inokulacji w konkretnych tkankach może być bezpośrednio określona przed włączeniem do całego eksperymentu zwierząt, u których inokulacja nie powiodła się. Zmienność między zwierzętami może być kontrolowana, ponieważ obrazowanie pozwala na indywidualne śledzenie każdego osobnika. Obrazowanie ma potencjał do znacznego zmniejszenia liczby potrzebnych zwierząt dzięki możliwości uzyskania danych z wielu punktów czasowych bez konieczności pobierania próbek tkanek w celu określenia ładunku patogenu3-4.
Niniejszy protokół opisuje metody wizualizacji infekcji u żywych zwierząt z wykorzystaniem obrazowania bioluminescencyjnego dla rekombinowanych szczepów bakterii wykazujących ekspresję lucyferazy. Lucyferazy z chrząszcza klikowego (CBRLuc) oraz świetlika (FFluc) wykorzystują lucyferynę jako substrat5-6. Światło emitowane zarówno przez CBRluc, jak i FFluc ma szeroki zakres długości fali od 500 nm do 700 nm, co czyni te lucyferazy doskonałymi reporterami do obrazowania optycznego w żywych modelach zwierzęcych7-9. Wynika to przede wszystkim z faktu, że długości fal świetlnych powyżej 600 nm są niezbędne, aby uniknąć absorpcji przez hemoglobinę i w ten sposób efektywnie przenikać przez tkanki ssaków. Lucyferaza jest wprowadzana do bakterii drogą genetyczną w celu wytworzenia sygnału świetlnego10. Myszy są inokulowane płucnie bakteriami bioluminescencyjnymi poprzez podanie intratrachealne, co umożliwia monitorowanie infekcji w czasie rzeczywistym. Po wstrzyknięciu lucyferyny obrazy są pozyskiwane przy użyciu systemu obrazowania IVIS. Podczas obrazowania myszy są znieczulane izofluranem za pomocą systemu znieczulenia gazowego XGI-8. Obrazy mogą być analizowane w celu lokalizacji i kwantyfikacji źródła sygnału, co odpowiada odpowiednio miejscu(om) oraz liczbie bakterii w miejscu infekcji. Po obrazowaniu przeprowadza się oznaczanie CFU w homogenizatach tkanek, aby potwierdzić obecność bakterii. Stosuje się kilka dawek bakterii w celu skorelowania ich liczby z luminescencją. Obrazowanie może być wykorzystywane do badania patogenezy oraz oceny skuteczności związków przeciwbakteryjnych i szczepionek.
Protokół
1. Zakażenie płuc poprzez intubację wewnątrz tchawiczną
- Zważyć myszy i opcjonalnie oznaczyć uszy w celu łatwej identyfikacji.
- Zanurzyć myszy w narkozie, podając ketaminę (10 μg na g masy ciała myszy) oraz ksylazynę (10 μg na g masy ciała myszy) drogą dosytroniczną.
- Umieścić myszy w klatkach do czasu pełnego znieczulenia. Ścisnąć opuszki łap w celu sprawdzenia odruchu stopowego. Myszy powinny wykazywać osłabioną lub brak reakcji odruchowej.
- Umieścić mysz na plecach na statywie do intubacji.
- Przymocować gumkę do statywu do intubacji, a następnie umieścić ją pod górnymi siekaczami myszy. Użyć taśmy do przymocowania kończyn do statywu do intubacji.
- Delikatnie wysunąć język z pyska za pomocą pincety.
- Wprowadzić wziernik z otoskopem do pyska i oglądać gardło aż do momentu uwidocznienia otworu krtani.
- Wprowadzić drut prowadzący z założonym cewnikiem do tchawicy, aż nasada cewnika znajdzie się na wysokości siekaczy. Usunąć drut prowadzący. Wprowadzić powietrze do cewnika, aby zaobserwować rozszerzenie klatki piersiowej i potwierdzić prawidłową intubację.
- Wstrzyknąć 50 μL roztworu bakterii (na załączonych obrazach użyto Bacillus Calmette Guérin (BCG) wykazującego ekspresję lucyferazy z czerwonego żukaczka (CBRLuc), skonstruowanego w naszym laboratorium, lecz można zastosować dowolny luminescencyjny szczep bakteryjny) przez cewnik przy użyciu strzykawki 1 mL.
- Umieścić mysz w klatce i obserwować ją podczas wybudzania z narkozy.
2. Znieczulenie zwierząt i przygotowanie do obrazowania bioluminescencyjnego
Myszy są znieczulane izofluranem przy użyciu systemu do znieczulenia gazowego XGI-8.
- Przed uruchomieniem systemu anestezjologicznego XGI-8 zważ każdy kanister filtra z węglem aktywnym, a następnie zapisz na nim wagę oraz datę. Jeśli waga przekracza wagę początkową o 50 gram, wymień kanister na nowy.
- Sprawdź poziom izofluranu w waporyzatorze i w razie potrzeby go uzupełnij.
- Włącz pompę ewakuacyjną z przodu systemu anestezjologicznego XGI-8 i ustaw ją na 8 lpm (litrów na minutę).
- Włącz dopływ tlenu z butli wysokociśnieniowej i ustaw go na 5 psig.
- Włącz przełącznik tlenu (zielony) z przodu systemu anestezjologicznego XGI-8.
- Włącz przepływ gazu do komory obrazowania, aby ustawić poziom przepływu. Ustaw wartość na 0,25 lpm, a następnie wyłącz przepływ gazu.
- Włącz przepływ gazu do komory indukcji anestezji, aby ustawić poziom przepływu. Ustaw wartość na 1,5 lpm, a następnie wyłącz przepływ gazu.
- Włącz izofluran za pomocą waporyzatora i ustaw stężenie na 2-2,5 procent. Poziom izofluranu można dostosować w zależności od liczby zwierząt oraz ich masy ciała.
- Umieść myszy w komorze indukcyjnej i zamknij pokrywę. Włącz przepływ gazu do komory indukcyjnej. Pozostaw myszy w komorze przez 5-10 minut, aż zostaną całkowicie zanestezjowane.
- Nałóż maść okulistyczną na oczy, aby chronić oczy myszy podczas obrazowania, a następnie umieść myszy w komorze obrazowania w jednym z stożków nosowych na rozdzielaczu anestezjologicznym. Pomiędzy myszami zastosuj przesłony świetlne, aby zapobiec odbiciu światła na sąsiednie zwierzęta.
- Wstrzyknij lucyferynę (150 μg/gram masy ciała) drogą domięśniową.
3. Obrazowanie bioluminescencyjne
- Uruchom oprogramowanie Living Imaging Software.
- Jeśli system nie został zainicjowany, zainicjuj system obrazowania IVIS.
- Ustaw parametry obrazowania, klikając sequence setup w panelu sterowania akwizycją IVIS.
W trybie Imaging Mode wybierz luminescencję oraz fotografię. Jeśli planowana jest rekonstrukcja 3D DLIT, w sekwencji obrazów wybierz obrazy fotograficzne, luminescencyjne oraz światła strukturalnego.
Ustaw czas ekspozycji od 0,5 sec do 10 minut.
Ustaw Binning oraz przysłonę (F/stop) w zależności od oczekiwanej jasności próbki.
Ustaw filtr wzbudzenia na block (zablokowany), a filtr emisji na open (otwarty), chyba że planowane jest obrazowanie tylko specyficznych długości fal świetlnych. W przypadku konstrukcji 3D DLIT ustaw wiele filtrów emisji o różnych długościach fal, aby umożliwić dokładną lokalizację źródła.
Ustaw pole widzenia (FOV) od A do D w zależności od liczby myszy lub obszaru zwierzęcia poddanego obrazowaniu. Wybierz A i B dla 1 myszy, C dla 2-3 myszy oraz D dla 4-5 myszy. - Kliknij add w Image Wizard w panelu sterowania akwizycją, aby dodać ustawienia sekwencji.
- Rozpocznij sekwencję obrazowania, klikając acquire.
W przypadku konstrukcji 3D DLIT obrazy luminescencyjne zostaną pozyskane dla wielu filtrów emisji o różnych długościach fal. Pozyskane zostaną również obrazy fotograficzne i światła strukturalnego. - Podczas akwizycji widoczne będą panele image oraz edit image levels. W sekcji edit image wprowadź jak najdokładniejsze informacje dla każdego eksperymentu, aby zapewnić łatwe śledzenie obrazów w przyszłości, a następnie zapisz obrazy.
- Usuń myszy z komory obrazowania IVIS i przenieś je z powrotem do klatek. Obserwuj wybudzanie z anestezji, aby upewnić się, że procedura nie wpłynęła znacząco na stan myszy. Zwierzęta powinny być stale monitorowane do czasu pełnego wybudzenia z anestezji (zwykle 1-2 min).
4. Obrazowanie ex vivo i analiza CFU w celu ilościowego oznaczenia bakterii w płucach
- Wstrzyknij myszom lucyferynę doprzewnęcznie w taki sam sposób jak podczas obrazowania, bezpośrednio przed uśmierceniem zwierząt.
- Uśmierć myszy poprzez doprzewnęczne wstrzyknięcie 10 mg/kg pentobarbitalu 5 min po podaniu lucyferyny.
- Pobierz płuca z organizmów myszy i umieść je w sterylnych szalkach Petriego, używając sterylnej pęsety i nożyczek.
- Umieść szalkę Petriego z pobranym organem w komorze obrazującej i wykonaj obrazy bioluminescencyjne w taki sam sposób, jak w przypadku całych myszy.
- Po obrazowaniu wyjmij pobrany organ z szalki Petriego za pomocą sterylnej pęsety i zhomogenizuj go w 1 mL PBS.
- Przygotuj rozcieńczenia i wysiej tkankę na odpowiednie podłoża selekcyjne. Zhomogenizowaną tkankę można przechowywać w temperaturze -80°C w celu ponownego wysiewu, jeśli będzie to konieczne. Alternatywnie, zhomogenizowaną tkankę można wykorzystać do ekstrakcji RNA lub DNA w celu ilościowego oznaczenia liczby bakterii za pomocą qPCR.
5. Analiza obrazowania luminescencyjnego
- Uruchom oprogramowanie „Living Imaging Software” i przejrzyj pliki obrazów.
- Użyj palety narzędzi „Tool Palette” do dostosowania obrazów. Kliknij „Image Adjust”, aby zmodyfikować ustawienia korekcji/filtrowania oraz wartości min/max dla poszczególnych skal kolorów.
- Do kwantyfikacji natężenia światła użyj narzędzi ROI z listy rozwijanej. Wybierz kształt, liczbę i rozmiar ROI. Przeciągnij ramkę ROI na interesujący obszar obrazu. Upewnij się, że wszystkie ROI mają ten sam rozmiar i kształt. Kliknij „ROI measurement”, a następnie zapisz, skopiuj i/lub wyeksportuj dane ilościowe.
- W przypadku rekonstrukcji 3D DLIT załaduj sekwencję obrazów, w tym obraz światła strukturowanego. W palecie „Tool Platte” kliknij „Surface topography”. Z listy rozwijanej wybierz kartę „Reconstruct”, aby wygenerować topografię powierzchni. W oknie pojawi się siatka powierzchni.
- W palecie „Tool Platte” wybierz „DLIT 3D reconstruction”. Z listy rozwijanej przejdź do karty „Properties”, aby ustawić właściwości tkanki i widmo źródłowe. W większości przypadków zaleca się wybór tkanki mięśniowej („Muscle”). Z listy rozwijanej wybierz kartę „Analyze”, aby określić długość fali do analizy. Kliknij kartę „Parameter” i zatwierdź wartości domyślne lub w razie potrzeby dostosuj parametry DLIT. Kliknij kartę „Reconstruct”, aby rozpocząć analizę 3D.
- Po zakończeniu rekonstrukcji 3D w widoku 3D zostaną wyświetlone wyniki. Kliknij kartę „results”, aby zapoznać się z danymi analizy dotyczącymi gęstości fotonów, wokseli oraz parametrów algorytmu DLIT.
- Zapisz i/lub wyeksportuj wyniki analiz rekonstrukcji 3D w formie rycin i plików danych.
6. Reprezentatywne wyniki:
Obrazy bioluminescencyjne myszy zainfekowanych bioluminescencyjnymi bakteriami wraz z kontrolną myszą niezinfekowaną przedstawiono na Rysunku 1. Myszy z infekcją płucną wywołaną przez bioluminescencyjne bakterie wykazują znaczny sygnał pochodzący z płuc (Rysunek 1). Intensywność luminescencji jest ilościowo określana jako całkowity strumień w obrębie ROI (obszaru zainteresowania) (Rysunek 2). Ilościowe dane dotyczące natężenia światła są normalizowane względem jednostek tworzących kolonie (CFU) bakterii uzyskanych z płuc, aby potwierdzić, że sygnał jest generowany przez bioluminescencyjne bakterie, co umożliwia porównanie z kontrolą negatywną. Lokalizację i intensywność sygnału można dodatkowo analizować za pomocą rekonstrukcji 3D DLIT źródła luminescencji na podstawie tomografii powierzchni myszy1. Analizy te pozwalają na ilościowe określenie i lokalizację generowanego sygnału bioluminescencyjnego. Wyniki rekonstrukcji 3D źródła luminescencji u zainfekowanych myszy wykazują, że światło jest emitowane z płuc myszy (Rysunek 3). Obrazy ex vivo uzyskanych płuc myszy potwierdzają, że luminescencja emitowana jest z płuc, a nie z jakiejkolwiek innej przyległej tkanki lub narządu (Rysunek 2C).
Rycina 1. Obrazowanie luminescencyjne myszy z infekcją płucną wywołaną bakteriami bioluminescencyjnymi znakowanymi CBRluc. Po lewej stronie znajduje się niezinfekowana mysz kontrolna, a po prawej dwie myszy zinfekowane. Myszy zostały zinfekowane bakteriami wykazującymi ekspresję CBRluc (n=2) drogą wewnątrzoskrzelną. 10 minut po wstrzyknięciu lucyferyny wykonano obrazowanie luminescencyjne przez 10 minut w 4 pozycjach: grzbietowej, brzusznej, lewej oraz prawej stronie.
Rycina 2. Ilościowa intensywność światła z myszy zainfekowanych bakteriami wykazującymi ekspresję CBRluc. (A, B) Obrazy luminescencyjne analizy ROI oraz ilościowy całkowity strumień światła z ROI odpowiednio w pozycjach grzbietowej i brzusznej. Myszy niezakażone znajdują się po lewej stronie, a dwie myszy zakażone po prawej. Obrazy luminescencyjne pozyskano z płuc myszy niezakażonych oraz zakażonych szczepem CBRlux (n=2). Intensywność światła wokół płuc określono za pomocą analizy ROI. C) ex vivo obrazy płuc myszy niezakażonych (góra) oraz zakażonych (dwa dolne zestawy płuc). Lucyferyna została wstrzyknięta na 5 minut przed eutanazją, a następnie wykonano obrazowanie. Wartości ilościowe zostały znormalizowane względem CFU.
Rysunek 3. Rekonstrukcja 3D źródła (źródeł) bioluminescencji z myszy z infekcją płuc. Myszy zainfekowano bakteriami wykazującymi ekspresję CBRluc poprzez wstrzyknięcie do tchawicy. Sekwencję obrazów pozyskano przy użyciu filtrów emisyjnych o różnych długościach fal w zakresie od 540 nm do 70 nm. Do rekonstrukcji 3D źródła luminescencji u zwierząt, zawierającej ustrukturyzowany obraz, wykorzystano sekwencję obrazów. A) Tomografia myszy przedstawiona jest w różnych pozycjach: z przodu, z tyłu, z lewej i z prawej strony. Źródła światła przedstawiono jako woksele (czerwone sześciany wewnątrz 3D myszy), które na podstawie rekonstrukcji znajdują się w płucach. B) Mapa gęstości fotonów dla danych pomiarowych i symulowanych. Porównanie krzywych gęstości fotonów z pomiarów i symulacji dostarcza informacji o jakości rekonstrukcji. Rekonstrukcje wysokiej jakości skutkują zbliżonymi wartościami pomiarowej i symulowanej gęstości fotonów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Chociaż przestrzeganie tych protokołów zazwyczaj pozwala na uzyskanie obrazów wysokiej jakości, w celu otrzymania dokładnych i spójnych danych z badań obrazowych należy wziąć pod uwagę kilka kluczowych kwestii. Obrazy luminescencyjne powinny być pozyskiwane tak, aby liczba zliczeń mieściła się w zakresie od 600 do 60 000, co zapewni, że sygnał znajduje się powyżej tła, a kamera nie jest nasycona. Jeśli uzyskany sygnał jest mniejszy niż 600, należy dostosować warunki ekspozycji w celu zwiększenia liczby zliczeń. Jeśli uzy...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i przepisami ustalonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committee) Uniwersytetu Texas A&M.
Podziękowania
Autorzy dziękują członkom laboratorium Cirillo za wartościowe dyskusje i pomoc podczas realizacji niniejszego badania. Dziękujemy dr. Joshuowi Hillowi oraz laboratorium dr. Jamesa Samuela za pomoc podczas nagrywania niniejszego protokołu. Praca ta została sfinansowana z grantu 48523 z Bill & Melinda Gates Foundation oraz grantu AI47866 z National Institutes of Health.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Izofluran | VETONE | 501027 | |
| Ketamina | Butler Animal Health Supply | ||
| Ksylazyna | MP Biomedicals | 158307 | |
| Lucyferyna | GMT | LUCK-100 | |
| Roztwór Fetal plus | Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd | ||
| Kaniula (22G x 1”) | Terumo Medical Corp. | OX2225CA | |
| Drut prowadzący | Hallowell EMC | 210A3491 | |
| Oktopod ze wziernikiem | Hallowell EMC | 000A3748 | |
| System Xenogen IVIS | Caliper Life Sciences | ||
| System anestezjologiczny XGI-8-gas | Caliper Life Sciences | ||
| Oprogramowanie Living Imaging | Caliper Life Sciences | ||
| Przezroczyste stożki nosowe | Caliper Life Sciences | ||
| Przegroda z osłoną świetlną | Caliper Life Sciences |
Bibliografia
- Wilson, T., Hastings, J. W. Bioluminescence. Annu Rev Cell Dev Biol. 14, 197-230 (1998).
- Contag, C. H., Bachmann, M. H. Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression. Annu Rev Biomed Eng. 4, 235-260 (2002).
- Hutchens, M., Luker, G. D. Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases. Cell Microbiol. 9, 2315-2322 (2007).
- Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection. Cell Microbiol. 6, 303-317 (2004).
- Wood, K. V., Lam, Y. A., Seliger, H. H., McElroy, W. D. Complementary DNA coding click beetle luciferases can elicit bioluminescence of different colors. Science. 244, 700-702 (1989).
- Wet, J. R. de, Wood, K. V., Helinski, D. R., DeLuca, M. Cloning of firefly luciferase cDNA and the expression of active luciferase in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 7870-7873 (1985).
- Hastings, J. W. Chemistries and colors of bioluminescent reactions: a review. Gene. 173, 5-11 (1996).
- Zhao, H. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. J Biomed Opt. 10, 41210-41210 (2005).
- Rice, B. W., Cable, M. D., Nelson, M. B. In vivo imaging of light-emitting probes. J Biomed Opt. 6, 432-440 (2001).
- Contag, C. H. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol Microbiol. 18, 593-603 (1995).
- Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging. J Biomed Opt. 12, 024007-024007 (2007).
- Weissleder, R. A clearer vision for in vivo imaging. Nat Biotechnol. 19, 316-317 (2001).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
