Zastosowanie systemu obciążeń wiszących do izolowanej okluzji tętnicy nerkowej

Podsumowanie

Precyzyjny mysi model ostrego uszkodzenia nerek (AKI) wywołanego niedokrwieniem jest ważnym narzędziem do badania ostrego uszkodzenia nerek i potencjalnego poszukiwania środków terapeutycznych do leczenia uszkodzeń nerek. System obciążników wiszących zapewnia narzędzie do natychmiastowej i niezawodnej okluzji oraz reperfuzji tętnicy nerkowej bez powodowania zastoju nerkowego.

Streszczenie

U pacjentów hospitalizowanych ponad 50% przypadków ostrego uszkodzenia nerek (AKI) jest spowodowanych niedokrwieniem nerek ^1-3. Niedawne badanie pacjentów hospitalizowanych wykazało, że nawet niewielki wzrost poziomu kreatyniny w surowicy (z 0,3 do 0,4 mg/dl) wiąże się z 70-procentowo wyższym ryzykiem zgonu w porównaniu z osobami bez żadnego wzrostu ¹. W związku z tym zabiegi chirurgiczne wymagające zacisków na aorcie i naczyniach nerkowych wiążą się z częstością występowania niewydolności nerek sięgającą 30% ⁴. Podobnie AKI po operacjach kardiochirurgicznych występuje u ponad 10% pacjentów w normalnych warunkach i wiąże się z gwałtownym wzrostem śmiertelności. AKI są również częstymi powikłaniami po transplantacji wątroby. Co najmniej 8-17% pacjentów wymaga w efekcie terapii nerkozastępczej ⁵. Ponadto opóźnione funkcjonowanie przeszczepu z powodu uszkodzenia komórek kanalikowych podczas transplantacji nerki jest często powiązane z AKI indukowanym niedokrwieniem ⁶. Co więcej, AKI występuje u około 20% pacjentów cierpiących na sepsę ⁶. Występowanie AKI wiąże się z drastycznym wzrostem zachorowalności i śmiertelności ¹. Podejścia terapeutyczne są bardzo ograniczone, a większość badań interwencyjnych w AKI u ludzi zakończyła się niepowodzeniem. Dlatego pilnie potrzebne są dodatkowe metody terapeutyczne w celu zapobiegania uszkodzeniu nerek w wyniku niedokrwienia ^{3, 7-9}.

W celu wyjaśnienia mechanizmów uszkodzenia nerek spowodowanego niedokrwieniem oraz możliwych strategii terapeutycznych, intensywnie potrzebne są modele mysie ^7-13. Modele mysie umożliwiają wykorzystanie różnych modeli genetycznych, w tym myszy z ukierunkowaną modyfikacją genów oraz myszy z tkankowo specyficzną modyfikacją genów (system cre-flox). Jednakże indukowanie niedokrwienia nerek u myszy jest trudne technicznie, a szczegóły eksperymentalne znacząco wpływają na wyniki. Przeprowadziliśmy systematyczną ocenę nowego modelu izolowanego zamknięcia tętnicy nerkowej u myszy, który specjalnie pozwala uniknąć stosowania zacisków lub szycia pieńków nerkowych ¹⁴. Model ten wymaga nefrektomii prawej nerki, ponieważ ze względu na ustawienie eksperymentalne niedokrwienie może być wywołane tylko w jednej nerce. W rzeczywistości, dzięki zastosowaniu systemu z obciążeniem zwisającym, tętnica nerkowa jest poddawana manipulacji instrumentalnej tylko raz podczas całej procedury chirurgicznej. Ponadto, przy zastosowaniu tej techniki nie dochodzi do niedrożności żylnej ani cewki moczowej. Wykazaliśmy zależne od czasu i dawki oraz wysoce powtarzalne uszkodzenie nerek w wyniku niedokrwienia, mierząc poziom kreatyniny w surowicy. Co więcej, w porównaniu tego nowego modelu z konwencjonalnym zaciskaniem całego pieńka, ochrona nerek poprzez prekondycjonowanie niedokrwienne jest bardziej wyraźna i wiarygodna. W związku z tym ta nowa technika może być użyteczna dla innych badaczy pracujących w dziedzinie ostrego uszkodzenia nerek.

Protokół

Uwagi ogólne. Wszystkie czynności powinny być wykonywane pod stereomikroskopem (Leica) przy użyciu koagulatora chirurgicznego. Myszy w grupach doświadczalnych powinny być dobrane pod względem wieku i masy ciała, aby zapewnić porównywalność wyników. Temperatura, ciśnienie krwi, znieczulenie oraz podawanie płynów powinny być stabilne i monitorowane podczas eksperymentu.

1. Znieczulenie i operacja

1. Eksperymenty nad niedokrwieniem nerek można przeprowadzić albo poprzez jednoczesne zastosowanie niedokrwienia i reperfuzji w obu nerkach, albo po nefrektomii jednostronnej w połączeniu z leczeniem niedokrwiennym pozostałej nerki. Ponieważ obustronne niedokrwienie obu nerek wiąże się z większymi trudnościami technicznymi, bardziej złożonym ustawieniem eksperymentalnym i dłuższą operacją, przeprowadzimy nefrektomię prawą, a następnie zastosujemy leczenie niedokrwienne pozostałej lewej nerki, wykorzystując system obciążników wiszących. System ten wykorzystano również do zamknięcia tętnicy wieńcowej w sercu. Procedura ta jest jednak inna, ponieważ tętnicę nerkową można wyizolować z otaczających tkanek, podczas gdy tętnica wieńcowa znajduje się wewnątrz mięśnia sercowego.
2. Myszy (w wieku 8-14 tygodni, obu płci) zostaną poddane znieczuleniu pentobarbitalem w dawce 70 mg/kg. Znieczulenie będziemy podtrzymywać dawką ok. 10 mg/kg/h pentobarbitalu sodowego. Przedawkowanie może znacznie obniżyć ciśnienie krwi, a tym samym zmienić wyniki. W naszych wstępnych badaniach stosowaliśmy również ketaminę i ksylazynę. Związki te wywołały jednak silną bradykardię (150 /min). Poza zaobserwowaną bradykardią istnieją dowody na to, że oba związki biorą udział w mechanizmach ochronnych podczas niedokrwienia. Środki znieczulające lotne również nie mogą być stosowane ze względu na ich zdolność do wywoływania ochrony nerek oraz niskie ciśnienie krwi. Dlatego naszym ostatecznym wyborem środka znieczulającego był pentobarbital. Dodatkowo ketamina i ksylazyna są wydalane głównie przez nerki. Nefrektomia i niedokrwienie mogą przedłużyć działanie znieczulenia ketaminą.
3. Po ustąpieniu odruchów bólowych (sprawdzanych poprzez ściskanie palców u stóp pęsetą) myszy zostaną umieszczone na stole grzewczym z kontrolą temperatury (RT, Effenberg, Monachium, Niemcy, aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37,0°C) w pozycji bocznej lewej.
4. Przymocować kończyny dolne i górne do stołu za pomocą taśmy.
5. W przypadku operacji bez przeżycia, takich jak pokazane na demonstracji wideo, należy pokryć obszar nacięcia olejem mineralnym, aby zapobiec wdychaniu sierści myszy podczas nacinania skóry, a tym samym uniknąć ryzyka wystąpienia alergii na sierść mysią. W przypadku eksperymentów z przeżyciem wymagane jest stosowanie odpowiednich technik aseptycznych, w tym strzyżenia sierści, dezynfekcji skóry jodoforami (np. Betadine), sterylnego obchodzenia się z autoklawowanymi instrumentami oraz stosowania masek i sterylnych rękawiczek przez chirurga. Oleju mineralnego nie stosuje się w operacjach z przeżyciem. W operacjach z przeżyciem stosuje się sterylny NaCl
6. Nacięcie prawego boku zostanie wykonane nożyczkami i elektrodą koagulacyjną (Erbe, ICC50, Niemcy), aby zapobiec krwawieniu z naczyń mięśniowych i skórnych. W przeciwieństwie do dostępu do nerek poprzez laparotomię pośrodkową, technika ta nie wymaga dostępu do jamy otrzewnej.
7. Pień nerkowy, obejmujący tętnicę nerkową i żyłę nerkową, zostaje podwiązany jedwabną nicią 4/0, a prawą nerkę wycina się nożyczkami, nie naruszając naczyń nadnerczowych.
8. Ranę operacyjną zamyka się szwem ciągłym (dwa ściegi) ściany mięśniowej i skóry nicią 4/0.
9. Zwierzęta zostają następnie ułożone w pozycji bocznej prawej i wykonuje się nacięcie lewego boku.
10. Lewą nerkę ostrożnie oddziela się od tkanek łącznych, unikając uszkodzenia nadnerczy i naczyń.
11. Następnie nerkę obraca się stroną brzuszną dołu do kubka z lucytu. Kubek z lucytu powinien być wysterylizowany w przypadku operacji z przeżyciem. Biegun nerki jest ostrożnie wpychany do kubka z lucytu poprzez przytrzymanie otaczającej tkanki pęsetą. Następnie biegun jest ostrożnie wpychany do kubka z lucytu pęsetą. Nerkę należy utrzymywać w wilgoci i cieple za pomocą mokrego tamponu nasączonego wodą o temperaturze 37,0°C.
12. Po odsłonięciu lewej nerki i umieszczeniu jej w kubku z lucytu, uchwyt nerki jest unieruchomiony od strony brzusznej, aby uzyskać napięcie naczyń nerkowych. Odpowiednie unieruchomienie jest ważne dla pomyślnego umieszczenia nici pod tętnicą nerkową. Następnie uchwyt nerki zostaje zamocowany i można łatwo zidentyfikować tętnicę nerkową, ponieważ przebiega ona nad żyłą nerkową.
13. Tętnicę nerkową oddziela się od sąsiednich tkanek za pomocą cienkiej pęsety w pobliżu jej odejścia od aorty brzusznej. Tętnicę oddziela się od leżącej pod nią żyły za pomocą zakrzywionej pęsety w najwyższym punkcie.
14. Jedwabną nić 8/0 (Ethicon, Norderstedt, Niemcy) umieszcza się pod tętnicą nerkową, używając jednej pęsety jako prowadnicy. Technika ta pozwala na przerwanie tylko przepływu krwi tętniczej do nerki bez uciskania żyły nerkowej, w przeciwieństwie do zaciskania pnia nerkowego.
15. Nić zostaje nałożona na mały trzpień (może to być przygotowana szpilka angielska), a do każdego z końców przyczepia się obciążenie o masie ok. 1g (probówka eppendorfowska). Obciążenie można dostosować do wielkości nerki, wyjmując lub dodając wodę do probówek eppendorfowskich. Tętnica powinna być lekko odciągnięta do góry, tak aby krew nie przepływała przez tętnicę, ale bez nadmiernego rozciągania naczynia. Silne naprężenie tętnicy może spowodować uszkodzenie ściany naczyniowej z pogrubieniem ściany tętnicy i zmniejszoną reperfuzją.
16. Gdy obciążniki wiszą swobodnie, tętnica nerkowa zostaje natychmiast zamknięta. Przeciwnie, gdy obciążniki są podparte, przepływ krwi do narządu zostaje natychmiast przywrócony. Skuteczność zamknięcia potwierdza zmiana koloru z czerwonego na biały.
17. Można zastosować różne czasy niedokrwienia, zgodnie z wymogami eksperymentu. Pełna reperfuzja nastąpi w zależności od czasu trwania niedokrwienia. Czasy niedokrwienia do 45 minut pozwalają na odwracalne uszkodzenie nerek. W naszych ustawieniach eksperymentalnych stosowaliśmy niedokrwienie od 20 do 30 minut, co powoduje umiarkowane uszkodzenie nerek, pozwalając nam zaobserwować zarówno poprawę, jak i pogorszenie uszkodzenia nerek w zależności od szczepu myszy i zastosowanego leczenia.
18. Po pełnej reperfuzji nerkę można wyjąć z kubka z lucytu. W tym celu uchwyt nerki zostaje zwolniony i napięcie nerki zostaje zniesione. Biegun szyjny zostaje delikatnie usunięty z kubka tępą pęsetą, a następnie natychmiast następuje biegun ogonowy.
19. Mocowania (taśmy) myszy można zdjąć, a mysz można ułożyć w pozycji na plecach, np. w celu oznaczenia klirensu inuliną FITC.
20. W wybranych zestawach eksperymentów ciśnienie krwi i tętno mogą być rejestrowane przez cały czas trwania procedury chirurgicznej. Pomiary ciśnienia krwi są uzyskiwane w sposób ciągły za pomocą cewnika w tętnicy szyjnej. W skrócie, tętnica szyjna zostaje odsłonięta poprzez tępą dyssekcję mięśni przytętniczych. Po dalszym odsłonięciu i uważnym unikaniu urazów tkanek (szczególnie nerwu błędnego), cewnik zostaje wprowadzony do naczynia przy użyciu dwóch szwów i małego zacisku. Ciśnienie krwi jest mierzone za pomocą elementu Statham (WK 280, WKK, Kaltbrunn, Szwajcaria).
21. W celu oznaczenia klirensu inuliny znakowanej FITC, do lewej żyły szyjnej należy wprowadzić cewnik do infuzji chlorku sodu i inuliny znakowanej FITC. Ponadto należy wprowadzić cewnik pęcherzowy do czasowo zależnego zbierania moczu, co wyjaśniono szczegółowo poniżej.

2. Pomiar uszkodzenia nerek

1. Ogólnie: W celu określenia stopnia uszkodzenia nerek po niedokrwieniu nerek zaleca się następujące parametry wynikowe:
   Należy przeprowadzić pomiar klirensu inuliny znakowanej FITC w celu oceny współczynnika filtracji kłębuszkowej (GFR). Alternatywnie można oznaczyć klirens kreatyniny oraz stężenie kreatyniny w surowicy podczas badania w klatkach metabolicznych 24 godziny po uszkodzeniu nerek. Należy wykonać barwienie nerek H&E oraz test ELISA dla mieloperoksydazy (MPO) w celu oceny uszkodzeń nerek i stanu zapalnego 24 godziny po niedokrwieniu nerek.
2. Badania w klatkach metabolicznych:
   1. Po niedokrwieniu lewa nerka jest przywracana do pozycji zaotrzewnowej, a ranę zamyka się zgodnie z powyższym opisem.
   2. Na koniec zabiegu myszy otrzymują 0,3 ml soli fizjologicznej drogą IP i regenerują się przez 2 godziny pod lampą grzewczą.
   3. Następnie myszy umieszcza się w klatkach metabolicznych (Tecniplast Deutschland, Hohenpeissenberg, Niemcy) w celu oznaczenia parametrów czynności nerek w dwóch 24-godzinnych odstępach czasu.
   4. Pobór wody przez każdą mysz należy określić poprzez zważenie pustej i pełnej butelki z wodą przed podaniem myszy, a następnie po 24 godzinach ponownie ważąc pełną butelkę. Należy również określić masę ciała myszy.
   5. Po 24 godzinach pobiera się około 75μl krwi z splotu żylnego za gałką oczną za pomocą rurki kapilarnej pod krótkotrwałym znieczuleniem izofluranem.
   6. Funkcję nerek ocenia się poprzez pomiar stężenia kreatyniny w osoczu i moczu 24 godziny po niedokrwieniu nerek, stosując dostępną komercyjnie metodę kolorymetryczną zgodnie z protokołem producenta (LT-SYS, Labor + Technik, Berlin, Niemcy). Stężenia Na⁺ i K⁺ w osoczu i moczu oznacza się fotometrem emisyjnym z płomieniem (ELEX 6361, Eppendorf AG, Hamburg, Niemcy). Wartości wydalnicze i hemodynamiczne nerek oblicza się według standardowych wzorów^15-17.
3. Klirens inuliny: Doświadczenia z klirensem FITC-inuliny przeprowadza się po niedokrwieniu nerek.
   1. W lewej żyle szyjnej umieszcza się kaniulę do ciągłej infuzji. Po odseparowaniu żyły od sąsiadujących tkanek nożyczkami preparacyjnymi (Dumont, WPI) zawiązuje się dwa szwy (4/0) wokół żyły. Przed szwem proksymalnym na żyłę nakłada się zacisk, aby zatrzymać przepływ krwi. Następnie zawiązuje się węzeł dystalny i do jednego z końców szwu dystalnego przyczepia się obciążnik, aby napiąć żyłę. Jest to bardzo ważne dla prawidłowego wprowadzenia cewnika do żyły. Za pomocą mikronożyczek wykonuje się niewielki otwór w żyle. Otwór przytrzymuje się cienką pęsetą (Dumont, WPI) i wprowadza cewnik do żyły. Aby przesunąć cewnik, należy zdjąć zacisk. Należy upewnić się, że cewnik nie jest napięty, tak aby można go było ułożyć bez podtrzymywania. Następnie zamyka się drugi szew proksymalny nad żyłą i cewnikiem.
   2. W pęcherzu moczowym umieszcza się cewnik do czasowego zbierania moczu. W tym celu wykonuje się krótkie nacięcie skóry nad pęcherzem. Ostrożnie wypreparowuje się pęcherz przez otwór w skórze. Pęcherz stabilizuje się wilgotną chusteczką. Nad pęcherzem umieszcza się przygotowany szew (4/0).
   3. Odcina się krótki fragment cewnika (1,5cm) i podgrzewa jeden koniec, aby utworzyć pierścień wokół cewnika, co ułatwia jego mocowanie w pęcherzu.
   4. Wykonuje się otwór w górnej części pęcherza. Nacięcie należy wykonać pomiędzy naczyniami, aby zapobiec krwawieniu. Szeroki koniec cewnika wprowadza się do pęcherza, a następnie zaciska szew nad cewnikiem i pęcherzem.
   5. Wszystkie myszy otrzymują bolus 0,85% roztworu chlorku sodu w ilości odpowiadającej 20% masy ciała. Ciągłą infuzję prowadzi się w tempie 80ul/h/25g masy ciała, a do infuzji dodaje się FITC-inulinę w celu oceny współczynnika filtracji kłębuszkowej (GFR) całej nerki. Po 20-minutowej stabilizacji zwierząt wykonuje się 20-minutowe okresy zbierania moczu (cztery razy) w celu oznaczenia tempa przepływu moczu i poziomu FITC-inuliny. Krew pobiera się w połowie każdego okresu w celu pomiaru FITC-inuliny.
   6. Podczas rozpoczynania 20-minutowych okresów zbierania należy używać czasomierza. Mocz zbiera się, umieszczając koniec cewnika pęcherzowego w małej probówce Eppendorf. Waży się probówkę przed i po zbieraniu moczu, aby określić jego ilość. Próbki krwi pobiera się drogą retroorbitalną z splotu żylnego za pomocą rurek kapilarnych w połowie każdego okresu zbierania.
4. Krew i nerki można pobrać po każdej procedurze do dalszych analiz, np. testu ELISA dla MPO, testu ELISA dla cytokin, badania histologicznego.

3. Reprezentatywne wyniki:

Rycina 1. Model systemu z obciążeniem zwisającym do wywoływania niedokrwienia nerek: Opracowano system z obciążeniem zwisającym w celu wywołania niedokrwienia lewej nerki. W tym celu pod tętnicę nerkową wprowadzono szew nylonowy 8.0, a do końca każdego szwu przymocowano niewielkie obciążenie (1 g). Taki projekt eksperymentalny umożliwia odwracalne zamknięcie tętnicy nerkowej poprzez nakładanie i zdejmowanie obciążenia.

Dyskusja

Podsumowując, niniejsze badanie opisuje nową technikę wywoływania niedokrwienia nerek w modelu mysim z wykorzystaniem systemu obciążenia wiszącego do zamknięcia tętnicy nerkowej. Badanie to wykazuje wysoką powtarzalność urazu, co pozwala zminimalizować zmienność związaną z zaciskaniem pieńka nerkowego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pentobarbital sodowy	Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd	V.P.L. 9372	4mg/mL w soli fizjologicznej
Nici chirurgiczne, jedwab 4.0	Harvard Apparatus	517698
Nici chirurgiczne, Prolene 8.0	Ethicon Inc.	M8739	wielorazowe
Mikroskop stereoskopowy	Leica Microsystems	n/a	uwzględnić dużą odległość roboczą
Stół grzejny	Rt, Effenberger, Germany	n/a	wyłączny i jedyny dostawca
Instrumenty chirurgiczne	World Precision Instruments, Inc.		precyzyjne nożyczki do mikrotnaciń