Opracowaliśmy nowy mysi model systemu obciążnika wiszącego do zamykania zatoki wrotnej. Technika ta może być użyteczna w przyszłych badaniach nad niedokrwieniem w mysich modelach wątroby.
Artykuł metodologiczny
Zastosowanie systemu z obciążnikiem wiszącym do indukowania niedokrwienia wątroby u myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ostre uszkodzenie wątroby spowodowane niedokrwieniem może wystąpić podczas wielu procedur klinicznych, np. podczas transplantacji wątroby, resekcji guza wątroby lub naprawy urazów, i może prowadzić do niewydolności wątroby, która charakteryzuje się wysokim wskaźnikiem śmiertelności1-2. W związku z tym badania nad niedokrwieniem wątroby u myszy stały się ważną dziedziną badań, dając możliwość wykorzystania metod farmakologicznych i genetycznych3-9. W szczególności myszy warunkowe z tkankowo specyficzną delecją genu (system cre, flox) pozwalają na zgłębienie roli białek w konkretnych tkankach10-13. Ze względu na trudności techniczne związane z ręcznym zaciskaniem triad portalnych u myszy, przeprowadziliśmy systematyczną ocenę z wykorzystaniem systemu obciążników zawieszonych do okluzji triady portalnej, który został opisany wcześniej3. Stosując system obciążników zawieszonych, zakładamy szew wokół lewej gałęzi triady portalnej bez powodowania uszkodzeń płatów wątroby, ponieważ nawet najmniejsze dostępne kleszczyki mogą uszkodzić tkankę wątroby ze względu na bliskość tkanki wątrobowej względem naczyń. Ponadto prawa gałąź triady wątrobowej pozostaje przerywna, dzięki czemu przy zastosowaniu tej techniki nie dochodzi do zastoju w jelitach, ponieważ zachowany jest przepływ krwi do prawych płatów wątroby. Co więcej, triada portalna jest manipulowana tylko raz podczas całej procedury chirurgicznej. W rezultacie można łatwo przeprowadzać procedury takie jak wstępne kondycjonowanie z krótkimi okresami niedokrwienia i reperfuzji. Systematyczna ocena tego modelu poprzez zastosowanie różnych czasów niedokrwienia i reperfuzji wykazała ścisłą korelację czasu niedokrwienia wątroby z uszkodzeniem wątroby, mierzonym poziomicami aminotransferazy alaninowej (ALT) i asparaginianowej (AST) w surowicy3,9. Podsumowując, badania te potwierdzają wysoką powtarzalność uszkodzenia wątroby przy użyciu systemu obciążników zawieszonych do wywoływania niedokrwienia wątroby i przerywanej reperfuzji. Zatem technika ta może być przydatna dla innych badaczy zainteresowanych badaniami nad niedokrwieniem wątroby u myszy. W związku z tym materiał wideo przedstawia szczegółowy, krok po kroku opis tej techniki.
Protokół
Uwagi ogólne. Wszystkie czynności powinny być wykonywane pod stereomikroskopem (Leica) przy użyciu koagulatora chirurgicznego. Myszy w grupach eksperymentalnej i pozorowanej powinny być dobrane pod względem wieku i masy ciała, aby zapewnić porównywalność wyników. Temperatura, ciśnienie krwi, znieczulenie oraz podawanie płynów powinny być stabilne i monitorowane przez cały czas trwania eksperymentu.
1. Znieczulenie i operacja
- Myszy C57BL/6 powinny znajdować się w przedziale wiekowym od 10 do 16 tygodni i powinny być dopasowane pod względem płci w poszczególnych grupach.
- Zanurzyć myszy w anestezji za pomocą pentobarbitalu sodu (70 mg/kg masy ciała i.p.) i podtrzymać znieczulenie dawką ok. 10 mg/kg/h pentobarbitalu sodu. Przedawkowanie może znacząco obniżyć ciśnienie krwi, a tym samym zmienić wyniki.
- Umieścić myszy na stole grzewczym z kontrolą temperatury (RT, Effenberg, Monachium, Niemcy) z termometrem rektalnym podłączonym do regulatora sprzężenia zwrotnego w celu utrzymania temperatury ciała na poziomie 37 °C.
- Umieścić myszy w pozycji grzbietnej na stole operacyjnym, mocując kończyny górne i dolne do stołu za pomocą usuwalnej taśmy.
- W przypadku eksperymentów z przeżyciem wymagane jest stosowanie odpowiednich technik aseptycznych, w tym wygolenia sierści, dezynfekcji skóry jodoforami (np. Betadine), sterylnej obsługi autoklawowanych narzędzi oraz używania masek i sterylnych rękawiczek przez operatora.
2. Zator sieci wrotnej
- Przykryj obszar nacięcia olejem mineralnym, aby zapobiec wdychaniu włosów myszy podczas przecinania skóry, co eliminuje ryzyko wystąpienia alergii na włosy mysie. Wykonaj laparotomię pośrodkową oraz nacięcie linea alba do górnej krawędzi, aby umożliwić łatwe odsłonięcie wątroby. Jeśli to możliwe, nacięcie wykonaj za pomocą elektrody koagulacyjnej (Erbe, ICC50, Tuebingen, Niemcy), aby zapobiec krwawieniu.
- Ustaw stół grzewczy z myszą w taki sposób, aby ogon był skierowany w stronę chirurga. Taka pozycja zapewnia optymalne warunki do zlokalizowania triady i założenia szwu.
- Przesuń jelito na prawą stronę za pomocą zwilżonego patyczka bawełnianego, aby odsłonić triadę wrotną.
- Lekko przesuń płat środkowy i lewy w stronę przepony, a płat prawy w stronę jelita. Zapewni to wyraźny widok na triadę wrotną powyżej rozgałęzienia płatów prawego, środkowego i lewego.
- Uważnie obejrzyj triadę wrotną i delikatnie przytrzymaj płat prawy pęsetą anatomiczną. Umożliwi to dobry wgląd w lewą triadę wrotną.
- Po wizualnej identyfikacji, za pomocą igłotrzymacza, wprowadź igłę z nicią (szew nylonowy 7/0; Ethicon, Norderstedt, Niemcy) pod lewą triadę wrotną, obejmując tętnicę wątrobową, żyłę wątrobową i przewód żółciowy, od lewej do prawej strony myszy.
- Szew musi znajdować się bezpośrednio pod triadą. Zbyt głębokie wprowadzenie igły może uszkodzić żyłę główną dolną (vena cava inferior), która znajduje się pod triadą. Dlatego przed założeniem szwu przytrzymaj prawy płat wątroby pęsetą, aby zidentyfikować żyłę główną.
- Chwyć końcówkę igły po prawej stronie pęsetą i ostrożnie wyciągnij ją z obszaru wątroby, nie powodując jej uszkodzenia.
- Do każdego końca nici przymocuj probówkę Eppendorf (około 3 g, wypełnioną wodą) i umieść oba końce nici na uchwytach do szwów. Umieść uchwyty dystalnie od szwu, tak aby nić nie kolidowała z prawą triadą.
- Zastosowanie obciążników spowoduje natychmiastowe zamknięcie triady, co doprowadzi do przerwania dopływu krwi do płatów lewego i środkowego wątroby. Poprawność zamknięcia można łatwo potwierdzić poprzez wizualną ocenę bladości niedokrwionych płatów. W przeciwieństwie do tego, zmiana koloru natychmiast znika po zdjęciu obciążników i reperfuzji wątroby. Ten model częściowego niedokrwienia wątroby zapobiega zastojowi krezkowemu poprzez zachowanie przepływu krwi do prawych płatów wątroby.
- Wprowadź jelito z powrotem do jamy brzusznej. Utrzymuj wątrobę i jelito w cieple, używając zwilżonego tamponu nasączonego wodą o temperaturze 37.0 °C. Aby utrzymać stabilną temperaturę ciała, po zakończeniu operacji owiń myszy dostępną w handlu folią spożywczą.
- Wykonaj niedokrwienie zgodnie z protokołem eksperymentalnym. Po określonym czasie niedokrwienia zdejmij obciążniki, co spowoduje natychmiastowe rozpoczęcie reperfuzji płatów środkowego i lewego wątroby. Technika ta pozwala na wywołanie odwracalnego niedokrwienia u myszy. Jeśli nie są planowane kolejne okresy niedokrwienia, ostrożnie usuń szew.
- Podaj około 40 μl chlorku sodu do jamy brzusznej na 15 minut przed oraz bezpośrednio po reperfuzji. Kontynuuj podawanie płynów co 30 minut w ilości 10 μl, aby zrekompensować utratę płynów w czasie reperfuzji.
- W przypadku eksperymentów przeżywalności ranę chirurgiczną zamyka się szwem ciągłym ściany mięśniowej i skóry, używając nici 4/0.
3. Zmiany w ukrwieniu wątroby
W celu oceny uszkodzenia wątroby po niedokrwieniu wątrobowym zaleca się wyznaczenie następujących parametrów wynikowych:
Oznacz stężenie enzymów wątrobowych (np. ALT, AST) oraz przeprowadź badanie histologiczne wątroby (barwienie H&E) po niedokrwieniu i reperfuzji wątroby3,9.
Rysunek 1. Model systemu z obciążeniem wiszącym do indukowania niedokrwienia wątroby: Opracowano system z obciążeniem wiszącym w celu indukowania niedokrwienia płata lewego i środkowego wątroby3(A) W związku z tym jądro oraz płat prawy zostały delikatnie oddzielone od płata lewego. Następnie płat prawy lekko przesunięto, aby uzyskać wyraźny widok na triadę wrotną powyżej rozgałęzienia na płaty prawy, środkowy i lewy. Pod triadą wątrobową lewą umieszczono szew nylonowy 8.0. (B) Na końcu każdego szwu przymocowano i zawieszono niewielki ciężarek (probówki Eppendorf 3 g wypełnione wodą). Niedokrwienie wątroby jest widoczne poprzez zmianę koloru płata lewego i środkowego z czerwonego na blady. Taki projekt eksperymentalny umożliwia precyzyjne zamknięcie i reperfuzję triady wątrobowej lewej poprzez nakładanie i zwalnianie obciążenia ciężarkiem.
Rysunek 2. Wpływ różnych czasów niedokrwienia wątroby na poziom aminotransferazy alaninowej (ALT) i asparaginianowej (AST) u myszy. Częściowe niedokrwienie trójkąta wrotnego indukowano zgodnie z opisem (niedokrwienie trwające od 0 do 60 min). Po 2 h reperfuzji zmierzono poziomy ALT (A) i AST (B). Wyniki przedstawiono jako średnie ± SE dla 6–7 myszy w grupie. *P < 0,05 w porównaniu z 0 min niedokrwienia (kontrola pozorowana).
Dyskusja
Niniejsze badanie opisuje technikę wywoływania niedokrwienia w modelu mysim z wykorzystaniem systemu obciążników wiszących do okluzji lewej triady wrotnej wątroby. Choć metoda ta jest łatwa do opanowania, należy wziąć pod uwagę następujące pułapki. Bardzo częstym błędem na początku jest zbyt głęboki szew, który obejmuje triadę wrotną oraz żyłę główną dolną. Częstość oddechów i tętno zwolnią w ciągu 15 minut z powodu zwiększonego oporu i zmniejszenia powrotu krwi do serca, co doprowadzi do przedwczesnej śmierci myszy. Najlepszym sposobem na uniknięcie objęcia żyły głównej dolnej jest zlokalizowanie jej przed założeniem szwu poprzez odciągnięcie prawych płatów pęsetą. Inną istotną kwestią jest to, aby obciążniki nie były zbyt ciężkie, co mogłoby spowodować nadmierny nacisk na lewą i prawą triadę wrotną, co również zatrzyma przepływ krwi do prawych płatów. Dlatego ilość wody w probówkach Eppendorf powinna być dostosowana do masy myszy, a uchwyty do nici chirurgicznych powinny być umieszczone dystalnie od miejsca szwu. I odwrotnie, jeśli obciążniki będą zbyt lekkie, ciśnienie krwi nie zostanie całkowicie zatrzymane. Oba błędy są łatwo wykrywalne poprzez dodatkową zmianę koloru prawego płata na blady lub niewystarczającą zmianę koloru płata środkowego i lewego, odpowiednio. W związku z tym zmianę koloru wątroby po zastosowaniu obciążników należy kontrolować co 10 minut. Inną częstą komplikacją chirurgiczną jest uszkodzenie wątroby igłą. Dlatego prawe płaty powinny być odciągnięte tępą pęsetą, aby czubek igły był łatwo widoczny i mógł zostać chwycony igłotrzymaczem. Jeśli na początku uwzględni się te pułapki, system obciążników wiszących do niedokrwienia wątroby zapewnia wysoką reprodukowalność uszkodzenia niedokrwiennego poprzez minimalizację zmienności uszkodzeń wątroby związanych z zaciskaniem triady wrotnej. Dzięki zastosowaniu systemu obciążników wiszących triada wrotna jest manipulowana tylko raz podczas całej procedury chirurgicznej, co powoduje znacznie mniejsze uszkodzenia płatów wątroby. Ponadto przy tej technice nie występuje zastój w wątrobie ani w jelitach. Większe urazy tkanek występują podczas zdejmowania i ponownego zakładania zacisków naczyniowych, zwłaszcza przy ponownym aplikacji zacisku podczas wielu cykli niedokrwienia, np. podczas warunkowania niedokrwiennego. Stosowanie obciążników wiszących, które znajdują się w pewnej odległości od tkanki wątroby, według naszych obserwacji, daje korzyść w postaci niezawodnej okluzji przy jednoczesnym zapobieganiu urazom tkanek wynikającym z manipulacji płatami wątroby podczas ponownego zakładania zacisku. Podsumowując, niniejsze badanie wykazuje wykonalność systemu obciążników wiszących do okluzji triady wrotnej podczas niedokrwienia, minimalizując zmienność i ograniczenia związane z zaciskaniem. Tym samym technika ta może być interesująca dla innych badaczy rozważających badanie niedokrwienia wątroby.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano konfliktów interesów.
Podziękowania
Niniejsze badania były wspierane przez granty Narodowych Instytutów Zdrowia Stanów Zjednoczonych (National Institutes of Health) R01-HL092188, R01-DK083385 i R01HL098294, granty Foundation for Anesthesia Education and Research (FAER) przyznane HKE, a także stypendium badawcze DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) (GR2121/1-1) i grant American Heart Association przyznany AG.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Pentobarbital sodu (Fatal Plus) | Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd | V.P.L. 9372 | 4 mg/mL w soli fizjologicznej |
| Szew, Prolene 8.0 | Ethicon, USA | M8739 | wielorazowy |
| mikroskop stereoskopowy | Leica | Brak danych | należy uwzględnić odpowiednio dużą odległość roboczą |
| Stół grzejny | Rt, Effenberger, Niemcy | Nie dotyczy | wyłączny i jedyny dostawca |
| Instrumenty chirurgiczne | WPI, Dumont | Pinceta, igłotrzymacz | |
| Koagulator | Erbe, ICC50, Tuebingen, Niemcy | Nie dotyczy | Różni dostawcy koagulantów |
Tabela 1. Specyficzne odczynniki i sprzęt. |
Bibliografia
- Rook, M., Rand, E. Predictors of long-term outcome after liver transplant. Curr. Opin. Organ. Transplant. 16, 499-504 (2011).
- Henrion, J. Ischemia/reperfusion injury of the liver: pathophysiologic hypotheses and potential relevance to human hypoxic hepatitis. Acta. Gastroenterol. Belg. 63, 336-347 (2000).
- Hart, M. L., Much, C., Kohler, D. Use of a hanging-weight system for liver ischemic preconditioning in mice. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 294, 1431-1440 (2008).
- Schneider, M., Geyte, K., Fraisl, P. Loss or silencing of the PHD1 prolyl hydroxylase protects livers of mice against ischemia/reperfusion injury. Gastroenterology. 138, 1143-1154 (2010).
- Coriat, R., Leconte, M., Kavian, N. Mangafodipir Protects against Hepatic Ischemia-Reperfusion Injury in Mice. PLoS One. 6, e27005(2011).
- Sakai, N., Van Sweringen, H. L., Schuster, R. Receptor activator of NF-kappaB ligand (RANKL) protects against hepatic ischemia/reperfusion injury in mice. Hepatology. , (2011).
- Zhang, J., Hu, W., Xing, W. The Protective Role of CD59 and Pathogenic Role of Complement in Hepatic Ischemia and Reperfusion Injury. Am. J. Pathol. 179, 2876-2884 (2011).
- Beldi, G., Banz, Y., Kroemer, A. Deletion of CD39 on natural killer cells attenuates hepatic ischemia/reperfusion injury in mice. Hepatology. 51, 1702-1711 (2010).
- Hart, M. L., Much, C., Gorzolla, I. C. Extracellular adenosine production by ecto-5'-nucleotidase protects during murine hepatic ischemic preconditioning. Gastroenterology. 135, 1739-1750 (2008).
- Beraza, N., Ludde, T., Assmus, U., Roskams, T., Vander Borght, S., Trautwein, C. Hepatocyte-specific IKK gamma/NEMO expression determines the degree of liver injury. Gastroenterology. 132, 2504-2517 (2007).
- Lentsch, A. B. Activation and function of hepatocyte NF-kappaB in postischemic liver injury. Hepatology. 42, 216-218 (2005).
- Luedde, T., Assmus, U., Wustefeld, T. Deletion of IKK2 in hepatocytes does not sensitize these cells to TNF-induced apoptosis but protects from ischemia/reperfusion injury. J. Clin. Invest. 115, 849-859 (2005).
- Kapitsinou, P. P., Liu, Q., Unger, T. L. Hepatic HIF-2 regulates erythropoietic responses to hypoxia in renal anemia. Blood. , (2010).
Przedruki i uprawnienia
