W niniejszej pracy opisujemy zoptymalizowany protokół multipleksowej ilościowej reakcji polimerazy w odwrotnej transkrypcji (qRT-PCR) w połączeniu z platformą mikroprzepływową, stanowiący efektywne pod względem kosztów i czasu narzędzie do wysokoprzepustowego przesiewowania poziomów ekspresji mikroRNA (miRNA), szczególnie w przypadku pracy z ograniczoną ilością materiału próbnego.
Artykuł metodologiczny
Wysokoprzepustowe profilowanie mikroRNA: zoptymalizowana wielokanałowa qRT-PCR w skali nanolitrowej na IFC Fluidigm Dynamic ArrayTM
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Szeroki udział cząsteczek miRNA w kluczowych procesach leżących u podstaw rozwoju, homeostazy tkankowej i chorób wywołał ogromne zainteresowanie w środowisku badawczym i farmaceutycznym. Aby badać miRNA, niezbędne jest dokładne i wiarygodne ilościowe oznaczenie ich poziomów. Porównując embrionalne komórki macierzyste myszy (mESC) typu dzikiego z komórkami deficientnymi w zakresie małych RNA, wykazaliśmy brak dokładności i wiarygodności w wcześniej opublikowanych technikach multipleksowej qRT-PCR. W niniejszej pracy opisujemy zoptymalizowaną metodę, obejmującą oczyszczanie z nadmiaru starterów po poprzednich etapach multipleksowych przed detekcją w czasie rzeczywistym w trybie singleks, co znacząco zwiększa dokładność i wiarygodność tej techniki. Ponadto wyjaśniamy, w jaki sposób przeprowadzenie tej techniki na chipie mikroprzepływowym przy objętościach nanolitrowych znacząco redukuje koszty odczynników i umożliwia efektywne czasowo, wysokoprzepustowe profilowanie ekspresji miRNA.
Protokół
1. Izolacja RNA: komórki hodowane w monowarstwie
(Zgodnie z protokołem producenta z użyciem TRIzol.)
| Nazwa odczynnika | Firma | Nr produktu/katalogowy |
| TRIzol Solution | Invitrogen | 15596-018 |
| Alkohol izopropylowy | Sigma-Aldrich | 1907-64 |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C 2432 |
| Etanol | ||
| Woda wolna od RNaz |
Homogenizacja
- Zhomogenizować komórki bezpośrednio na naczyniu hodowlanym, dodając 1 ml odczynnika Trizol na każde 10 cm2 powierzchni naczynia; wymieszać odczynnik Trizol i pipetować go wielokrotnie w górę i w dół, aby zapewnić całkowite pokrycie płytki.
Rozdział faz
- Próbkę po homogenizacji inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Przenieść do oznakowanej probówki, dodać 0,2 ml chloroformu na każdy 1 ml TrizolSolution i energicznie wstrząsać probówką ręcznie przez 15 sekund.
- Inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 minuty.
- Wirować próbkę przy 12 0 x g przez 15 minut w temperaturze 2 °C. Po wirowaniu mieszanina rozdziela się na dolną fazę czerwoną, interfazę oraz bezbarwną górną fazę wodną, która zawiera RNA i powinna stanowić 60% całkowitej objętości Trizol Solution.
Wytrącanie RNA
- Przenieś wodną fazę zawierającą RNA do nowej, opisanej probówki.
- Wytrąc parametr RNA, dodając 0,5 ml izopropanolu na każdy 1 ml roztworu Trizol.
- Inkubuj próbki w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
- Wiruj przy 12 0 x g przez 10 minut w temperaturze 2 °C.
Przemywanie RNA
- Po wirowaniu odlej nadsącz z probówek.
- Przemyj osad RNA (znajdujący się na ściance i dnie probówki), dodając co najmniej 1 ml 75% etanolu na każdy 1 ml roztworu Trizol, a następnie wymieszaj na wortexie.
- Wiruj przy 750 x g przez 5 minut w temperaturze 2 °C.
Elucja RNA
- Odlać supernatant i ponownie odwirować przez 1 minutę. Usunąć nadmiar cieczy.
- Suszyć osad na powietrzu przez 5-10 minut.
Uwaga: nadmiernie wysuszone RNA jest trudne do rozpuszczenia. - Ponownie rozpuścić osad w wodzie wolnej od RNaz, pipetując roztwór w górę i w dół, a następnie inkubować przez 10 minut w temperaturze 5 °C.
- Zmierzyć stężenie RNA (stosunek A260/280) za pomocą spektrofotometru Nanodrop™.
- Przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
2. Ekstrakcja RNA: surowica
(Zgodnie z protokołem producenta zestawu mirVana PARIS Kit, zmodyfikowanym przez Mitchell i współpracowników1)
| Nazwa odczynnika | Firma | Nr produktu/katalogowy | Uwagi |
| mirVana PARIS Kit 2X Roztwór denaturujący Kwas-fenol:chloroform Roztwór do płukania miRNA 1 Roztwór do płukania miRNA 2/3 | Ambion | AM156 | Zmodyfikowany protokół |
| 2-merkaptoetanol | Sigma-Aldrich | M752 | |
| Etanol | |||
| Woda traktowana DEPC |
Przygotowanie odczynników:
- Do 2X Denaturing Solution dodać 375 μl 2-merkaptoetanolu i dokładnie wymieszać.
- Do miRNA wash Solution 1 dodać 21 ml 10% etanolu.
- Do miRNA wash Solution 2/3 dodać 40 ml 10% etanolu.
Przygotowanie próbek:
- Rozmrozić próbkę surowicy na lodzie.
Homogenizacja
- Zmieszać 30 μl próbki z równą objętością (30 μl) 2X Denaturing Solution (roztwór powinien mieć temperaturę pokojową) i wymieszać w wstrząsarku vortex.
- Inkubować mieszaninę na lodzie przez 5 minut.
- Dodać objętość Acid-Phenol:Chloroform równą całkowitej objętości lizatu próbki oraz 2X Denaturing Solution (60 μl).
Ważne: NIE należy używać wodnego buforu znajdującego się na powierzchni Acid-Phenol:Chloroform. - Wymieszać mieszaninę w wstrząsarku vortex przez 60 sekund.
- Odwirować w temperaturze pokojowej przez 15 minut przy maksymalnej prędkości (>10,00 x g). Po odwirowaniu mieszanina rozdzieli się na górną fazę wodną, interfazę oraz dolną fazę organiczną.
- Usunąć górną warstwę wodną (objętość powinna wynosić od 300 do 500 μl, wliczając w to ewentualną białkową warstwę „mętną”).
- Ponownie przeprowadzić ekstrakcję warstwy wodnej w ten sam sposób, dodając chloroform.
Ważne: Warstwa wodna z drugiej ekstrakcji jest rutynowo mniejsza pod względem objętości (250 μl). Należy odnotować odzyskaną objętość.
Przygotowanie końcowej izolacji RNA (całkowite RNA)
- Podgrzać (95 °C) wodę wolną od nukleaz.
- 10% etanol musi być w temperaturze pokojowej.
Końcowa izolacja RNA (całkowite RNA)
- Do odzyskanej fazy wodnej dodać 1,25 objętości 10% etanolu (np. jeśli odzyskano 30 μl, dodać 375 μl etanolu) i dokładnie wymieszać.
- Dla każdej próbki umieścić wkład filtracyjny w jednej z probówek zbiorczych.
- Nanieść lizat pipetą na filtr.
- Wirować (10,0 x g) przez 30 sekund, odrzucić przefiltrowaną ciecz, wirować ponownie przez 30 sekund, a następnie umieścić wkład filtracyjny z powrotem w tej samej probówce zbiorczej.
Przemywanie RNA
- Nanieś 70 μl miRNA Wash Solution 1 na wkład filtrujący i wiruj przez 15 sekund, wylej filtrat z probówki zbiorczej, a następnie umieść wkład filtrujący z powrotem w tej samej probówce zbiorczej.
- Nanieś 50 μl miRNA Wash Solution 2/3, wiruj przez 15 sekund, wylej filtrat i powtórz czynność, używając kolejnych 50 μl Wash Solution 2/3. >
- Wylej filtrat i wykonaj wirowanie osuszające przez 1-2 minuty. >
- Umieść wkład filtrujący w nowej probówce zbiorczej, nanieś 10 μl wody wolnej od RNaz (95 °C), zamknij nakrętkę i inkubuj przez 2 minuty.
- Wiruj przez ok. 2 minuty w celu odzyskania RNA. >
- Przechowuj w temperaturze -80 °C do czasu użycia. >
3. Stężenie roztworu RNA (5X)
(Zgodnie z protokołem producenta)
| Nazwa odczynnika | Firma | Nr produktu/katalogowy |
| MICROCON Centrifugal Filter Devices, Ultracell YM-3 | Millipore | 42404 |
| Woda traktowana DEPC |
Urządzenie: Microcon Ultracell YM-3, próg odcięcia SS i DS Nukleotydy: 10
Objętość: Pożądana objętość zagęszczonego roztworu RNA zależy od projektu eksperymentalnego i powinna obejmować doświadczenia kontrolne.
- Wstaw zbiornik na próbkę Microcon do probówki i pipetuj roztwór do zbiornika.
Uwaga: Nie dotykać membrany. - Wiruj przez 185 minut w temperaturze 4 °C przy maksymalnej wartości 14 0 x g.
Uwaga: Ustaw probówkę pasmem pęknięcia w stronę rotora. - Pipetuj pożądaną objętość wody wolnej od RNazy (np. 20 μl) na zbiornik, umieść zbiornik odwrócony w nowej probówce i wiruj przez 3 minuty w temperaturze 4 °C przy maksymalnej wartości 30 x g.
- Przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
4. Odwrotna transkrypcja
(Zgodnie z protokołem Tang i wsp.2 z wprowadzonymi modyfikacjami.)
| Nazwa odczynnika | Firma | Nr kat./prod. | Komentarze |
| Zestaw do tworzenia archiwum cDNA o wysokiej pojemności Bufor do archiwizacji cDNA 10x dNTP (10 mM) wirusem białaczki mysiej Moloneya (MMLV) odwrotna transkryptaza (50 j./μl) | Applied Biosystems | 4368814 | zmodyfikowany protokół |
| RNaseOUT (40 U/μl) | Invitrogen | 10777019 | |
| mieszanina starterów do odwrotnej transkrypcji z pętlą stem-loop x-plex (40 nM) * | Integrated DNA Technologies | Niestandardowy | Sekwencje |
| Woda traktowana DEPC |
Objętość reakcji: 5.5 μl
Uwaga: końcowe stężenie starterów typu stem-loop powinno wynosić 1-5 nM (w tym przypadku 2 nM).
Przygotuj Master-Mix (objętości na jedną reakcję) w następujący sposób:
| 1. Woda DEPC | 1.959 μl |
| 2. Bufor RT 10x | 0.55 μl |
| 3. Inhibitor RNazy (40 U/μl) | 0.0715 μl |
| 4. dNTP (10 mM ) | 0.275 μl |
| 5. mieszanka starterów odwrotnych w pętli stem-loop x-plex (40 nM)* | 0.275 μl |
| 6. MMLV-RT (50 U/μl) | 0.369 μl |
- Wymieszać i krótko odwirować.
- Dodać 3,5 μl Master-Mix do 2 μl próbki.
- Przeprowadzić następującą reakcję RT:
16 °C przez 30 minut, następnie 60 cykli: 20 °C przez 30 sekund, 42 °C przez 30 sekund, 50 °C przez 1 sekundę i na koniec 85 °C przez 5 minut w celu inaktywacji MMLV-RT, 4 °C ∞. - Przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
*Listę starterów do pętli odwróconej można znaleźć pod adresem http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm
5. Preamplifikacja (Pre-PCR)
(Zgodnie z protokołem Tang i wsp.2 z wprowadzonymi modyfikacjami.)
| Nazwa odczynnika | Firma | Nr kat./prod. | Komentarze |
| dNTP (10 mM) | Applied Biosystems | 4368814 | Zestaw do archiwizacji cDNA o wysokiej wydajności. |
| 2x Uniwersalna Mieszanina PCR Master Mix z NoAmpErase UNG | Applied Biosystems | 4324018 | |
| mieszanina starterów prawych x-plex (450 nM)* | Integrated DNA Technologies | Niestandardowy | Sekwencje |
| Uniwersalny starter odwrotny (100 μM) | Integrated DNA Technologies | Niestandardowy | Sekwencja2 |
| polimeraza AmpliTaqGold (5 U/μl) | Applied Biosystems | 4311806 | |
| MgCl22 (10 mM) | |||
| Woda traktowana DEPC |
Objętość reakcji: 27.5μl (2μl MM + 5.5μl RT-Product)
Uwaga: Preamplifikacja jest niezbędna do zwiększenia siły sygnału, szczególnie gdy początkowe stężenie RNA jest ograniczone. Poziom RNA wejściowego określa optymalną liczbę cykli przed PCR. Przy tej samej względnej wydajności każdy cykl PCR powinien podwoić stężenie produktu końcowego. Ponieważ niektóre miRNA będą wykazywać wyższą ekspresję, należy unikać zbyt dużej liczby cykli. Jednak niedostateczna amplifikacja może prowadzić do utraty czułości detekcji, zwłaszcza w przypadku mikroRNA o niskim poziomie ekspresji. W naszych badaniach 12 cykli preamplifikacji przy użyciu 10ng całkowitego RNA okazało się wystarczające. W przypadku zastosowania surowicy jako materiału wyjściowego 12 cykli pozwala na wykrycie poziomów miRNA, lecz 15 cykli wydawało się lepszym rozwiązaniem. Wreszcie, rozpoczynając od 3 oocytów (w przybliżeniu 40 pg całkowitego RNA na oocyt3), 16 cykli preamplifikacji pozwoliło nam skutecznie przeprowadzić analizę poziomów ekspresji mikroRNA4.
* Listę starterów forward można znaleźć pod adresem http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm
Przygotuj Master-Mix (objętości na jedną reakcję) w następujący sposób:
| 1. 2x uniwersalna pożywka MM | 13.75 μl |
| 2. Woda z DEPC | 0.792 μl |
| 3. MgCl₂2 (10 mM) | 0.55 μl |
| 4. dNTP (10 mM) | 1.1 μl |
| 5. mieszanina starterów forward x-plex (450 nM) | 3.06 μl |
| 6. Uniwersalny RP (100 μM) | 1.375 μl |
| 7. polimeraza AmpliTaqGold (5 U/μl) | 1.375 μl |
- Wymieszać i krótko odwirować.
- Do każdego 5,5 μl produktu RT dodać 2 μl Master-Mixu.
- Przeprowadzić następującą reakcję Pre-PCR:
95 °C przez 10 min, 5 °C przez 2 min, a następnie 10 - 18 cykli: 95 °C przez 1 s i 65 °C przez 1 min, 4 °C ∞.
6. Oczyszczanie produktu przed PCR
Oczyszczanie poprzez selekcję wielkości na natywnym żelu poliakrylamidowym 10%
| Nazwa odczynnika | Firma | Nr produktu/kat. |
| 40% roztwór akrylamidu/bis-akrylamidu | Bio-Rad | 161-0144 |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0801 |
| drabina DNA 10 bp | Invitrogen | 10821-015 |
| barwnik do żeli kwasów nukleinowych SYBR Gold koncentrat 10 0X w DMSO | Invitrogen | S1494 |
| Glikogen (20 mg/ml) | Roche | 10 901 393 01 |
| Bufor EB | ||
| 10% wersenian amonu (APS) | ||
| Bufor TEN | ||
| 6x Orange G | ||
| Woda traktowana DEPC | ||
| ddH2O |
a. Przygotowanie żelu
Aby przygotować 10 ml 10% mieszaniny poliakryloamidu, należy dodać
| 1. ddH2O | 6.5 ml |
| 2. 10x TBE | 1 ml |
| 3. Poliakrylamid (40% ) | 2.5 ml |
| 4. APS (10%) | 80 μl |
| 5. TEMED | 4 μl |
- Przygotuj drabinę DNA:
- 0,5 μl drabiny DNA 10 bp
- 4,5 μl buforu (EB)
- 1 μl 6x Orange G
- Dodaj 5,5 μl 6x Orange G do każdych 27,5 μl produktu przed-PCR.
b. Przeprowadzenie elektroforezy żelowej
- Prowadzić elektroforezę żelu przy napięciu 150V przez 55-60 minut.
Uwaga: Błękit bromofenolowy służący jako wskaźnik przemieszcza się wraz z regionem 20bp.
c. Barwienie żelu
- Barw żel barwnikiem SYBR-Gold przez 25 minut na wytrząsarce.
Uwaga: SYBR-Gold jest światłoczuły.
d. Wycięcie żelu
- Wytnij prążek produktu Pre-PCR o wielkości 60-80 bp i przenieś go do opisanej probówki.
Uwaga: W przypadku produktów Pre-PCR z niskim wkładem RNA prążek może nie być widoczny. - Rozdrobnij prążek żelu (np. poprzez centryfugację probówki w probówce).
e. Ponowna ekstrakcja cDNA
- Dodać 30 μl buforu TEN i inkubować w temperaturze 37 °C przez 4 godziny na rotatorze.
- Przenieść ciecz do oznakowanej probówki zbiorczej, dodać kolejne 300 μl buforu TEN do probówki zawierającej żel i inkubować całość w temperaturze 4 °C przez noc na rotatorze.
- Odssać pozostałą ciecz, przenieść do oznakowanej probówki zbiorczej w ten sam sposób co wcześniej i zapisać całkowitą objętość odzyskanego płynu.
f. Wytrącanie etanolem
- Dodaj 3 objętości 10% etanolu w temperaturze pokojowej.
- Dodaj 0,5 μl glikogenu (20 mg/ml).
- Wymieszaj na wierzchołku (vortex).
- Inkubuj na suchem lodzie przez co najmniej 2 godziny lub w temperaturze -80 °C przez noc.
- Wiruj w mikrocentry fudze w temperaturze 4 °C przez 30 minut, aby wytrącić cDNA w formie osadu.
- Odlej ciecz, dodaj 70 μl 75% etanolu w temperaturze pokojowej i wiruj przez 10 minut.
- Odlej ciecz i ponownie wiruj przez 5 minut.
- Odsuń nadsącz pipetą, uważając, aby nie poruszyć osadu, i pozostaw do wysuszenia na powietrzu przez 10 minut.
- Rozpuść osad w czystej wodzie.
Uwaga: Pożądana objętość skoncentrowanego roztworu cDNA zależy od projektu eksperymentalnego i powinna obejmować doświadczenia kontrolne.
7. Oczyszczanie produktu przed PCR
Oczyszczanie poprzez trawienie enzymatyczne starterów z następującym po nim użyciem kolumny wirówkowej (zgodnie z protokołami producenta)
| Nazwa odczynnika | Firma | Nr produktu/katalogowy |
| ExoSAP-IT | USB-Affymetrix | 78250 |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 2804 |
Uwaga: W naszych doświadczeniach wyłączne oczyszczanie enzymatyczne skutecznie usunęło primery, ale doprowadziło również do częściowej degradacji produktu preamplifikowanego, co prawdopodobnie wynikało z częściowej denaturacji krótkich produktów podczas wzrostu temperatury do 80 °C w kroku inaktywacji enzymu. Uniknięcie inaktywacji termicznej i bezpośrednie oczyszczanie produktów PCR z reakcji enzymatycznej przy użyciu kolumienek wirowych pozwala na usunięcie wszystkich primerów bez degradacji produktu.
- Wymieszać 5 μl produktu po PCR z 2 μl ExoSAP-IT.
- Inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut w celu degradacji pozostałych starterów i nukleotydów.
- Do 1 objętości reakcji PCR dodać 5 objętości Buforu PB i wymieszać; jeśli do Buforu PB dodano wskaźnik pH I, należy sprawdzić, czy mieszanina ma kolor żółty.
- Umieścić kolumnę MinElute w dołączonej probówce zbierającej o pojemności 2 ml w odpowiednim statywie.
- Nanieść próbkę na kolumnę MinElute i wirować przez 1 minutę.
- Odlać filtrat, ponownie umieścić kolumnę MinElute w tej samej probówce, dodać 750 μl Buforu PE do kolumny MinElute w celu przemycia i wirować przez 1 minutę.
- Odlać filtrat i ponownie umieścić kolumnę MinElute w tej samej probówce. Wirować kolumnę przez dodatkową 1 minutę z maksymalną prędkością.
- Przenieść kolumnę MinElute do czystej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml.
- Aby eluować DNA, dodać 10 μl wody traktowanej DEPC na środek membrany, odstawić kolumnę na 1 minutę, a następnie wirować przez 1 minutę.
8. Profilowanie qRT-PCR Fludigim 96.96
| Nazwa odczynnika | Firma | Nr produktu/kat. | Uwagi |
| Fluidigm 96.96 Dynamic Array Kit 96.96 dynamic array 96.96 control line fluid 20x Loading Reagent | Fluidigm Corporation | ||
| Mieszanina: Universal Reverse Primer (1 μM) Forward Primer (1 μM) TaqMan Probe (0.2 μM) | Integrated DNA Technologies | Custom | Sekwencja (1) |
| 2x Universal PCR Master Mix z NoAmpErase UNG | Applied Biosystems | 4324018 | |
| Tween |
1. Przygotowanie (priming) IFC Dynamic Array 96.96
- Wstrzyknąć płyn do linii sterujących (150 μl) do każdego z akumulatorów na chipie.
- Umieścić chip w kontrolerze IFC (zintegrowanego obwodu płynowego) i uruchomić skrypt Prime (136x), aby wprowadzić płyn do linii sterujących do chipu.
Uwaga: Chip należy wykorzystać w ciągu 24 godzin od otwarcia opakowania. Należy uważać, aby nie rozlać płynu linii kontrolnej, ponieważ obecność tego płynu na chipie lub w wlotach sprawia, że chip staje się niezdatny do użytku. Chip musi zostać załadowany w ciągu 60 minut od przygotowania (primingu).
2. Przygotowanie próbek
2.1 Przygotowanie wstępne próbki
W jednorazowej probówce plastikowej połączyć składniki wymienione w poniższej tabeli w celu przygotowania mieszaniny wstępnej próbki (Sample-Pre-Mix; objętości na jeden wlot).
| 2x TaqMan Universal Master Mix | 2.5 μl |
| 20x odczyn do nakładania próbek | 0.25 μl |
Uwaga: Objętość końcowa wynosi 2,75 μl, aby uwzględnić nadmiar wynikający ze strat podczas dozowania pipetą
2.2 Przygotowanie próbek
W formacie 96-dołkowym połącz każdą próbkę z mieszaniną wstępną (objętości na każdy wlot).
| Mieszanie przed analizą próbek | 2.75 μl |
| Próbka | 2.25 μl |
Uwaga: Krótko wymieszaj na wirówce typu vortex i odwiruj płytkę 96-dołkową, aby zebrać ciecz.
Objętość końcowa na wlot wynosi 5 μl; należy uwzględnić straty podczas pipetowania, przygotowując nieco większą objętość.
2.3 Przygotowanie 13 analiz
- Użyć płytki 96-dołkowej do przygotowania 13 testów. Stężenia dla 1 testu znajdują się w poniższej tabeli; należy je przeliczyć dla 13 testów.
| Uniwersalny primer odwrotny | 1 μm (1x) | Sekwencjonowanie wewnątrz_2 |
| Starter bezpośredni* | 1 μm (1x) | * |
| Sonda TaqMan specyficzna dla genu nr | 0.2 μm | # |
* Listę starterów forward można znaleźć pod adresem http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm
# Listę sond TaqMan można znaleźć pod adresem http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm
- W nowej płytce 96-dołkowej połączyć alikwoty testów 13x z Tweenem w celu uzyskania końcowego stężenia Tweenu 0,25%
Uwaga: Końcowa objętość na wlot wynosi 5 μl; należy przygotować odpowiednią objętość (5,5 μl), aby uwzględnić straty podczas przenoszenia cieczy. - Dokładnie wymieszać, unikając powstania pęcherzyków powietrza, a następnie krótko odwirować, aby zebrać ciecz.
3. Załadowanie chipa
Uwaga: Aby zapewnić prawidłowe ładowanie próbek i testów, należy upewnić się, że chip jest odpowiednio wypozycjonowany. Wygodnie jest wyrównać wcięcie do lewego górnego rogu.
Przed załadowaniem chipa należy upewnić się, że wszystkie roztwory analityczne i próbki zostały wymieszane. Wygodnie jest wykonać to w płytce 96-dołkowej, a następnie odwirować płytkę przed załadowaniem chipa. Należy zapoznać się z mapą pipetowania chipa, aby móc do niej wrócić w późniejszym czasie.
Niewykorzystane wloty na próbki należy wypełnić 2,75 μl Sample Mix oraz 2,25 μl wody wolnej od DNA.
Niewykorzystane wloty do testu należy wypełnić 2.5 μl odczynnika do ładowania testu i 2.5 μl wody.
Podczas pipetowania nie należy przekraczać pierwszego stopnia, aby uniknąć wprowadzenia pęcherzyków powietrza.
- Po załadowaniu próbek i odczynników (objętość na wlot: 5 μl) uruchom skrypt Load Mix (136x), aby wprowadzić próbki i odczynniki do chipa.
- Po zakończeniu działania skryptu wyjmij chip z kontrolera ICF.
- Oderwij niebieską folię ochronną z dolnej strony załadowanego chipa.
- Usuń wszelkie cząsteczki kurzu lub zanieczyszczenia z powierzchni chipa.
4. 96.96 qRT-PCR
- Przenieś chip do systemu BioMark i zastosuj następujące warunki amplifikacji:
5 °C przez 2 min, 95 °C przez 10 min, a następnie 40 cykli: 95 °C przez 15 s oraz 5 °C przez 1 min. - Postępuj zgodnie z protokołem producenta dotyczącym oprogramowania do gromadzenia danych.
5. Korzystanie z oprogramowania do analizy qPCR
Po przeprowadzeniu RT-PCR dedykowane oprogramowanie generuje krzywe amplifikacji, mapy ciepła oraz wartości Ct dla każdej studzienki. W celu analizy danych należy zapoznać się z instrukcją obsługi oprogramowania.
9. Reprezentatywne wyniki:
Rycina 1. Schematyczna reprezentacja przebiegu eksperymentu. Przedstawiono szczegółowy opis protokołu multipleksowej qRT-PCR, obejmujący oczyszczanie (Krok E) nadmiaru starterów z multipleksowej odwrotnej transkrypcji (Krok C) oraz multipleksowej preamplifikacji (Krok D) przed detekcją w czasie rzeczywistym (Krok F), co pozwala na uzyskanie oczyszczonej matrycy cDNA do qRT-PCR. FP: specyficzny dla mikroRNA starter bezpośredni, URP: uniwersalny starter odwrotny, R-SLP: specyficzny dla mikroRNA odwrotny starter w pętli z łodyżką.
Kliknij tutaj, aby powiększyć obraz.
Rysunek 2. Oczyszczanie matrycy do qRT-PCR za pomocą żelu poliakryamidowego po etapie pre-PCR. Prążki o wielkości produktu przed-PCR widoczne są wyłącznie w próbkach WT, a nie w próbkach DGCR8 z niedoborem mikroRNA-/- lub Dicer-/- próbki (strzałki) po 96-pleksowej RT i 12 cyklach preamplifikacji. Należy zauważyć, że we wszystkich próbkach znajdują się nieswoiste produkty nieznanego pochodzenia (groty strzałek) oraz nadmiar starterów (gwiazdki).
Rycina 3. Oczyszczanie po multipleksowej preamplifikacji znacznie poprawia dokładność wyników qRT-PCR. a) Porównanie względnych poziomów ekspresji WT mESC w stosunku do Dgcr8-/- (z niedoborem kanonicznych mikroRNA) mESC wykazuje 1) wykrycie większej liczby mikroRNA oraz 2) utratę fałszywie dodatnich sygnałów w Dgcr8-/- tła po oczyszczeniu starterów produktu pre-PCR. b) Po oczyszczeniu poziomy względnej ekspresji obu DGCR8 -/-/WT i Dicer -/-/WT wykazuje zanik sygnałów fałszywie dodatnich i umożliwia prawidłową kategoryzację rzadkich Dgcr8 niezależny / Dicer zależne małe RNA (miR-320, -484, -87).5
Rycina 4. Wysokoprzepustowe profilowanie miRNA metodą qRT-PCR w systemie Fluidigm. Przykładowy zrzut ekranu z profilowania mircoRNA metodą qRT-PCR na systemie Fluidigm 96.96 w celu przesiewania zmian w poziomach miRNA w surowicach pacjentów z rakiem prostaty. Oprogramowanie do analizy qPCR w czasie rzeczywistym przedstawia krzywe amplifikacji, kolorowe mapy ciepła oraz próg cyklu (Ct).
Dyskusja
miRNA to krótkie (18-24 nukleotydy), niekodujące cząsteczki RNA, które regulują ekspresję genów potranskrypcyjnie, zarówno poprzez destabilizację matrycowych RNA (mRNA), jak i hamowanie ich translacji.6 Fakt, że co najmniej jedna trzecia ludzkich genów zawiera konserwatywne miejsca wiązania miRNA w obszarze 3'UTR oraz ewidentne interakcje miRNA z genami odpowiedzialnymi za pluripotencję, proliferację i apoptozę, sugerują krytyczny udział w decyzjach o losie komórek, homeostazie tkankowej i chorobach, takich jak nowotwory.6,7 W związku z tym dokładne profile ekspresji mikroRNA budzą szerokie zainteresowanie.
Aby przetestować opublikowany protokół profilowania ekspresji miRNA metodą multipleksowego qRT-PCR2 wykorzystaliśmy mESC z niedoborem małych RNA jako kontrole negatywne. Komórki DGCR8-/- wykazują niedobór wszystkich kanonicznych mikroRNA, natomiast komórki Dicer-/- są pozbawione zarówno kanonicznych, jak i niekanonicznych mikroRNA.8,9
Porównując poziomy w komórkach mES typu dzikiego i komórkach DGCR8-/-, odkryliśmy brak dokładności, ponieważ kilka wyrażonych10 mikroRNA nie zostało wykrytych w komórkach typu dzikiego11. Niektóre wykazywały nawet niższe poziomy ekspresji w stosunku do komórek z nokautem (Rycina 3a). Postawiliśmy hipotezę, że brak dokładności może być spowodowany masywnym przeniesieniem starterów z dwóch następujących po sobie etapów multipleksowych (RT i Pre-PCR) przed ilościową analizą RT-quantification w układzie singleplex. Jednak multipleksowa preamplifikacja jest niezbędna do zwiększenia siły sygnału, zwłaszcza gdy początkowe stężenie RNA jest ograniczone. Poprzez oddzielenie produktów pre-PCR od starterów za pomocą selekcji według wielkości na natywnych żelach poliakrylamidowych (Rycina 2), mogliśmy wykazać znaczną poprawę dokładności poprzez wykrycie większej liczby mikroRNA oraz zanik sygnałów fałszywie dodatnich w obu liniach Dgcr8-/- oraz Dicer-/- (Ryciny 3a i 3b). Dodatkowo zmodyfikowane podejście qRT-PCR pozwoliło na prawidłową kategoryzację rzadkich małych RNA niezależnych od Dgcr8 / zależnych od Dicer (Rycina 3b)11. Zatem dodatkowy etap oczyszczania produktu pre-PCR z nadmiaru starterów jest wyraźnie korzystny, szczególnie przy użyciu dużych zestawów starterów multipleksowych na próbkę.
Optymalna liczba cykli preamplifikacji jest określana przez stężenia wejściowe RNA. Równowaga pozwalająca uniknąć niedostatecznej lub nadmiernej amplifikacji powinna być dostosowana do specyfiki konkretnego eksperymentu.
Przy ponad tysiącu znanych mikroRNA, stosowanie standardowych płytek 384-dołkowych może nie być optymalne dla szerokiego profilowania mikroRNA, szczególnie przy porównywaniu wielu próbek. Fluidigm Dynamic Array IFC umożliwia, przy znacznym zmniejszeniu liczby etapów pipetowania i zapotrzebowania na odczynniki, badanie do 96 oddzielnych próbek w zestawieniu z 96 różnymi mikroRNA w jednym eksperymencie (9216 reakcji) w skali nanolitrowej (6,7 nL). Dla każdego przebiegu oprogramowanie analityczne dostarcza krzywe amplifikacji, kolorowe mapy ciepła oraz wartości progowe cyklu (Ct). Jednoczesne profilowanie na szeroką skalę zmniejsza zmienność eksperymentalną i pozwala na normalizację średniej wartości ekspresji, co daje lepsze wyniki niż inne strategie normalizacji wykorzystujące małe RNA kontrolne.12
W porównaniu do dostępnych komercyjnie platform 384-dołkowych z przypisanymi sondami TaqMan, połączenie platformy do profilowania wysokoprzepustowego z zestawami starannie dobranych starterów zapewnia dużą elastyczność eksperymentalną.
Zoptymalizowana metoda multipleksowej qRT-PCR w połączeniu z platformą Dynamic Array pozwoliła nam na jednoczesne przesiewowe badanie surowic 48 pacjentów z rakiem prostaty pod kątem zmian poziomów 384 miRNA (ryc. 4) oraz na normalizację danych bez użycia wewnętrznych standardów kontrolnych (tj. syntetycznych mikroRNA).11
Pomimo zwiększenia liczby etapów od przygotowania próbek do uzyskania wyników profilowania, opisane podejście jest wydajną czasowo i kosztowo metodą wysokoprzepustową, pozwalającą na profilowanie dużych zestawów próbek pod kątem poziomów ekspresji miRNA, nawet przy ograniczonej ilości materiału wyjściowego.
Oświadczenia
Alan Mir jest pracownikiem Fluidigm Corporation. Poza tym nie mamy żadnych interesów finansowych do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy laboratorium Blellocha za uwagi do tekstu. Praca ta była finansowana ze środków przyznanych RB przez NIH (K08 NS48118 i R01 NS057221), California Institute of Regenerative Medicine (CIRM) (Seed Grant RS1-00161, New Faculty Award RN2-00906) oraz Pew Charitable Trust, a F.M. przez Wissenschaftlich Urologische Gesellschaft eV.
Bibliografia
- Mitchell, P. S. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10513-10518 (2008).
- Tang, F. 220-plex microRNA expression profile of a single cell. Nat Protoc. 1, 1154-1159 (2006).
- Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 644-645 (2003).
- Suh, N. MicroRNA function is globally suppressed in mouse oocytes and early embryos. Curr Biol. 20, 271-277 (2010).
- Babiarz, J. E., Ruby, J. G., Wang, Y., Bartel, D. P., Blelloch, R. Mouse ES cells express endogenous shRNAs, siRNAs, and other Microprocessor-independent, Dicer-dependent small RNAs. Genes Dev. 22, 2773-2785 (2008).
- Babiarz, J. E. Small RNAs: their biogenesis, regulation and function in embryonic stem cells. StemBook. , (2009).
- Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19, 92-105 (2008).
- Wang, Y., Medvid, R., Melton, C., Jaenisch, R., Blelloch, R. DGCR8 is essential for microRNA biogenesis and silencing of embryonic stem cell self-renewal. Nat Genet. 39, 380-385 (2007).
- Kanellopoulou, C. Dicer-deficient mouse embryonic stem cells are defective in differentiation and centromeric silencing. Genes Dev. 19, 489-501 (2005).
- Thomson, J. M., Parker, J., Perou, C. M., Hammond, S. M. A custom microarray platform for analysis of microRNA gene expression. Nat Methods. 1, 47-53 (2004).
- Moltzahn, F. Microfluidic based multiplex qRT-PCR identifies diagnostic and prognostic microRNA signatures in sera of prostate cancer patients. Cancer Res. 71, 550-560 (2011).
- Mestdagh, P. A novel and universal method for microRNA RT-qPCR data normalization. Genome Biol. 10, R64-R64 (2009).
Przedruki i uprawnienia
