Wysokoprzepustowe profilowanie mikroRNA: Zoptymalizowany multipleksowy qRT-PCR w skali nanolitrowej na IFC Fluidigm Dynamic ArrayTM

Summary

Tutaj opisujemy zoptymalizowany protokół ilościowego PCR (qRT-PCR) multipleksowej odwrotnej transkryptazy w połączeniu z platformą mikroprzepływową jako efektywne kosztowo i czasowo narzędzie do wysokoprzepustowych badań przesiewowych poziomów ekspresji mikroRNA (miRNA), zwłaszcza podczas pracy z ograniczonymi ilościami próbki.

Abstract

Szerokie zaangażowanie miRNA w krytyczne procesy leżące u podstaw rozwoju, homeostazy tkanek i chorób doprowadziło do rosnącego zainteresowania wśród społeczności badawczych i farmaceutycznych. Aby badać miRNA, ważne jest, aby kwantyfikacja poziomów mikroRNA była dokładna i solidna. Porównując mysie embrionalne komórki macierzyste (mESC) typu dzikiego z małym niedoborem RNA, ujawniliśmy brak dokładności i solidności w wcześniej opublikowanych technikach multipleksowego qRT-PCR. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowaną metodę, w tym usuwanie nadmiaru starterów z poprzednich etapów multipleksu przed wykrywaniem w czasie rzeczywistym singleplex, co znacznie zwiększa dokładność i solidność techniki. Ponadto wyjaśniamy, w jaki sposób wykonanie tej techniki na chipie mikroprzepływowym o objętościach nanolitrów znacznie obniża koszty odczynników i pozwala na efektywne czasowo profilowanie ekspresji miRNA o wysokiej przepustowości.

Protocol

1. Ekstrakcja RNA: komórki hodowane w jednej warstwie

(Zgodnie z protokołem producenta przy użyciu TRIzol.)

Nazwa odczynnika firma Prod/Kot # Roztwór TRIzol Invitrogen Numer katalogowy: 15596-018 Izopropylowy Sigma-Aldrich Lata 1907-64 chloroform Sigma-Aldrich Zobacz materiał C 2432 etanol     Woda wolna od RNA    

Homogenizacja

1. Homogenizować komórki bezpośrednio na szalce hodowlanej, dodając 1 ml roztworu Trizol na 10 cm² powierzchni naczynia, obracać Trizol i pipetować w górę iw dół, aby zapewnić pełne pokrycie płytki.

Separacja faz

2. Inkubować homogenizowaną próbkę przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
3. Przenieść do oznakowanej probówki, dodać 0,2 ml chloroformu na 1 ml roztworu TrizolSolution i energicznie wstrząsać probówką ręcznie przez 15 sekund.
4. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 minuty.
5. Odwirować próbkę o masie 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 2 °C. Po odwirowaniu mieszanina rozdziela się na dolną fazę czerwoną, interfazę i bezbarwną górną fazę wodną, która zawiera RNA i powinna stanowić 60% całkowitej objętości roztworu Trizolu.

Opady RNA

6. Przenieś wodną fazę zawierającą RNA do świeżej, oznakowanej probówki.
7. Wytrącić RNA, dodając 0,5 ml alkoholu izopropylowego na 1 ml roztworu Trizolu.
8. Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
9. Wirować przy 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 2 °C.

pranie RNA

10. Po odwirowaniu wyrzucić supernatant z probówek.
11. Przemyć osad RNA (z boku i na dole probówki), dodając co najmniej 1 ml 75% etanolu na 1 ml roztworu Trizolu, wirować.
12. Wirować przy 7500 x g przez 5 minut w temperaturze 2 °C.

Elucja RNA

13. Odrzucić supernatant i ponownie odwirować przez 1 minutę. Usuń nadmiar płynu.
14. Suchy na powietrzu pellet przez 5-10 minut.
    Uwaga: przesuszone RNA jest trudne do rozpuszczenia.
15. Ponownie rozpuścić osad w wodzie wolnej od RNazy, pipetując roztwór w górę i w dół, a następnie inkubować przez 10 minut w temperaturze 55 °C.
16. Zmierz stężenie RNA (stosunek A260/280) za pomocą spektrofotometru Nanodrop™.
17. Przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu przygotowania do użycia.

2. Ekstrakcja RNA: Surowica

(Zgodnie z protokołem producenta mirVana PARIS Kit zmodyfikowanym przez Mitchella et ^al.1)

Nazwa odczynnika firma Prod/Kot # Komentarze mirVana PARIS Kit
2X roztwór do denaturacji
Kwas-fenol:Chloroform
Roztwór do płukania miRNA 1
Roztwór do płukania miRNA 2/3 Ambion AM1556 (wersja angielska) Zmodyfikowany protokół 2-merkaptoetanol Sigma-Aldrich Zobacz materiał M7522   etanol       Woda uzdatniona DEPC      

Przygotowanie chemiczne:

• Dodaj 375 μl 2-merkaptoetanolu do roztworu 2X denaturującego i dobrze wymieszaj.
• Dodać 21 ml 100% etanolu do roztworu do płukania miRNA 1.
• Dodać 40 ml 100% etanolu do roztworu do płukania miRNA 2/3.

Przygotowanie próbki:

• Rozmrozić próbkę surowicy na lodzie.

Homogenizacja

1. Wymieszać 300 μl próbki z równą objętością (300 μl) 2X roztworu denaturującego (powinien mieć temperaturę pokojową) i odwirować.
2. Inkubuj mieszaninę na lodzie przez 5 minut.
3. Dodać objętość kwasowo-fenolowo-chloroformową równą całkowitej objętości lizatu próbki plus 2X roztwór denaturujący (600 μl).
   Ważne: NIE używaj wodnego buforu, który znajduje się na wierzchu kwasu-fenolu:chloroformu.
4. Wiruj mieszaninę przez 60 sekund.
5. Wirować w temperaturze pokojowej przez 15 minut z maksymalną prędkością (>10 000 x g). Po odwirowaniu mieszanina rozdziela się na górną fazę wodną, fazę interfazową i dolną fazę organiczną.
6. Usuń warstwę wodną z wierzchu (powinna to być 300 - 500 μl, w tym wszelka białkowa "mętna" warstwa).
7. Ponownie wyodrębnić warstwę wodną jak poprzednio, ponownie dodając chloroform.
   ważny: Warstwa wodna drugiej ekstrakcji ma zwykle mniejszą objętość (250 μl). Zanotuj odzyskany wolumin.

Przygotowanie końcowej izolacji RNA (całkowite RNA)

• Podgrzej (95 °C) wodę wolną od nukleaz.
• 100% etanol musi mieć temperaturę pokojową.

Końcowa izolacja RNA (całkowita ilość RNA)

8. Dodać 1,25 objętości 100% etanolu do odzyskanej fazy wodnej (np. jeśli odzyskano 300 μl, dodać 375 μl etanolu) i dokładnie wymieszać.
9. Dla każdej próbki umieścić wkład filtracyjny w jednej z probówek zbiorczych.
10. Odpipetować lizat na filtr.
11. Wirować (10 000 x g) przez 30 sekund, wyrzucić przepływ, ponownie wirować przez 30 sekund i włożyć wkład filtra do tej samej probówki zbiorczej.

Pranie RNA-Wash

12. Nałożyć 700 μl roztworu do płukania miRNA 1 do wkładu filtrującego i wirować przez 15 sekund, wyrzucić przepływ z probówki zbiorczej i włożyć wkład filtra do tej samej probówki zbiorczej.
13. Nałożyć 500 μl roztworu do płukania miRNA 2/3, odwirować przez 15 sekund, odrzucić przepływ i powtórzyć z drugim 500 μl roztworu płuczącego 2/3.
14. Wyrzuć przepływowy i wirowanie na sucho na 1-2 minuty.
15. Umieścić wkład filtra w świeżej probówce zbiorczej, nanieść 100 μl wody wolnej od RNAzy (95 °C), zamknąć nakrętkę i inkubować przez 2 minuty.
16. Wirować przez ̃2 minuty w celu odzyskania RNA.
17. Przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia.

3. Stężenie roztworu RNA (5X)

(Zgodnie z protokołem producenta)

Nazwa odczynnika firma Prod/Kot # MICROCON Filtry odśrodkowe, Ultracell YM-3 Milipory Numer telefonu 42404 Woda uzdatniona DEPC    

Urządzenie: Microcon Ultracell YM-3, Cutoff SS i DS Nukleotydy: 10

Objętość: Pożądana objętość ponownie skoncentrowanego roztworu RNA zależy od projektu eksperymentalnego i powinna obejmować eksperymenty kontrolne.

1. Włożyć zbiornik na próbkę Microcon do fiolki i pipetować roztwór do zbiornika.
   nuta: Nie dotykaj membrany.
2. Wirować przez 185 minut w temperaturze 4 °C z maksymalną wartością 14 000 x g.
   nuta: Umieścić fiolkę z opaską na pęknięcia w kierunku wirnika.
3. Odpipetować żądaną objętość wody wolnej od RNAzy (np. 20 μl) na zbiornik, umieścić odwrócony zbiornik do nowej fiolki i wirować przez 3 minuty w temperaturze 4 °C z maksymalną wartością 3000 x g.
4. Przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia.

4. Odwrotna transkrypcja

(Zgodnie z protokołem Tang et ^al.2 z modyfikacjami.)

Nazwa odczynnika firma Prod/Kot # Komentarze Zestaw do archiwizacji cDNA o dużej pojemności
10x bufor do archiwizacji cDNA
dNTP (100 mM)
Wirus mysiej białaczki Moloneya (MMLV)
odwrotna transkryptaza (50 U/μl) Biosystemy stosowane 4368814 Zmodyfikowany protokół RNaseOUT (40 U/μl) Invitrogen 10777019   x-plex mieszanka podkładu z odwróconą pętlą trzpienia (40 nM) * Zintegrowane technologie DNA zwyczaj Sekwencji* Woda uzdatniona DEPC      

Objętość reakcji: 5,5 μl

Uwaga: końcowe stężenie starterów pętli macierzystej powinno wynosić 1-5 nM (tutaj 2 nM).

Przygotuj Master-Mix (Objętości na reakcję) w następujący sposób:

1. DEPC-Woda 1,959 μl 2. 10x bufor RT 0,55 μl 3. Inhibitor RNazy (40 U/μl) 0,0715 μl 4. dNTP (100 mM) 0,275 μl 5. Mieszanka podkładu x-plex z odwróconą pętlą trzpienia (40 nM)* 0,275 μl 6. MMLV-RT (50 U/μl) 0,369 μl

7. Wymieszaj i krótko odwiruj.
8. Dodać 3,5 μl Master-Mix do 2 μl próbki.
9. Wykonaj następującą reakcję RT:
   16 °C przez 30 minut, a następnie 60 cykli w temperaturze 20 °C przez 30 sekund, 42 °C przez 30 sekund, 50 °C przez 1 sekundę i na koniec 85 °C przez 5 minut w celu dezaktywacji MMLV-RT, 4 °C ∞.
10. Przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.

*Listę starterów do odwróconej pętli macierzystej można znaleźć pod adresem http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm

5. Pre-Amplifikacja (Pre-PCR)

(Zgodnie z protokołem Tang et ^al.2 z modyfikacjami.)

Nazwa odczynnika firma Prod/Kot # Komentarze dNTP (100 mM) Biosystemy stosowane 4368814 Zestaw archiwum cDNA o wysokiej kapitalizacji. 2x Uniwersalny PCR Master Mix z NoAmpErase UNG Biosystemy stosowane 4324018   Mieszanka podkładowa x-plex (450 nM)* Zintegrowane technologie DNA zwyczaj Sekwencji* Uniwersalny podkład odwrotny (100 μM) Zintegrowane technologie DNA zwyczaj Sekwencja² Polimeraza AmpliTaqGold (5 U/μl) Biosystemy stosowane 4311806   MgCl₂ (100 mM)       Woda uzdatniona DEPC      

Objętość reakcji: 27,5 μl (22 μl MM + 5,5 μl RT-Product)

Uwaga: Wstępne wzmocnienie jest konieczne do zwiększenia siły sygnału, zwłaszcza gdy początkowe stężenie RNA jest ograniczone. Wejściowy poziom RNA określa optymalną liczbę cykli Pre-PCR. Biorąc pod uwagę tę samą względną skuteczność, każdy cykl PCR powinien podwoić stężenie produktu końcowego. Ponieważ niektóre miRNA będą miały większą ekspresję, unikaj nadmiernej cykliczności. Jednak niedostateczna amplifikacja może spowodować utratę czułości wykrywania, szczególnie w przypadku mikroRNA ulegających ekspresji na niskich poziomach. W naszych rękach 12 cykli pre amplifikacji, przy użyciu 100 ng całkowitego RNA, okazało się wystarczające. Używając surowicy jako materiału wyjściowego, 12 cykli daje wykrywalne poziomy miRNA, ale 15 cykli wydaje się być lepszych. Wreszcie, zaczynając od 3 oocytów (około 400 pg całkowitego RNA na oocyt³), 16 cykli wstępnej amplifikacji z powodzeniem pozwoliło nam na badanie przesiewowe pod kątem poziomów ekspresji mikroRNA^4.

* Listę starterów do przodu można znaleźć pod adresem http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm

Przygotuj Master-Mix (Objętości na reakcję) w następujący sposób:

1. 2x uniwersalny MM 13,75 μl 2. DEPC-Woda 0,792 μl 3. MgCl₂ (100 mM) 0,55 μl 4. dNTP (100 mM) 1,1 μl 5. Mieszanka starterów do przodu x-plex (450 nM) 3,06 μl 6. Uniwersalny RP (100 μM) 1,375 μl 7. Polimeraza AmpliTaqGold (5 U/μl) 1,375 μl

8. Wymieszaj i krótko odwiruj.
9. Dodać 22 μl Master-Mix do każdych 5,5 μl produktu RT.
10. Wykonaj następującą reakcję Pre-PCR:
    95 °C przez 10 min, 55 °C przez 2 min, a następnie 10 - 18 cykli po 95 °C przez 1 s i 65 °C przez 1 min, 4 °C ∞.

6. Oczyszczanie produktu Pre-PCR

Oczyszczanie przez wybór rozmiaru na 10% natywnym żelu poliakrylamidowym

Nazwa odczynnika firma Prod/Kot # 40% roztwór akryloamidu/bis Bio-Rad 161-0144 TEMED Bio-Rad Numer katalogowy: 161-0801 Drabinka DNA 10 pz Invitrogen Numer katalogowy 10821-015 SYBR Gold bejca w żelu kwasu nukleinowego
Koncentrat 10 000X w DMSO Invitrogen Zobacz materiał S11494 Glikogen (20 mg/ml) Roche 10 901 393 001 Bufor EB 10% nadsiarczan amonu (APS) Bufor TEN 6x Pomarańczowy G Woda uzdatniona DEPC ddH2O

a. Przygotowanie żelu

Aby przygotować 10 ml mieszanki 10% poliakrylamidu, dodaj

1. ddH₂O Pojemność 6,5 ml 2. 10x TBE Pojemność 1 ml 3. Poliakryloamid (40%) Pojemność 2,5 ml 4. APS (10%) 80 μl 5. TEMED 4 μl

6. Przygotuj drabinę DNA:
   • 0,5 μl 10 pz drabinka DNA
   • 4,5 μl buforu (EB)
   • 1 μl 6x Pomarańczowy G
7. Dodaj 5,5 μl 6x Orange G do każdego 27,5 μl produktu Pre-PCR.

b. Uruchom żel

8. Uruchom żel z napięciem 150 V przez 55-60 minut.
   nuta: Błękit bromofenolowy jako wskaźnik działa z obszarem 20 pz.

c. Żel do plam

9. Żel do barwienia z SYBR-Gold przez 25 minut na shaker.
   Uwaga: SYBR-Gold jest wrażliwy na światło.

d. Żel do cięcia

10. Wytnij pasmo produktu Pre-PCR od 60-80 pz i przenieś do oznaczonej probówki.
    nuta: Pasmo dla produktów Pre-PCR o niskiej liczbie wejściowej RNA może nie być widoczne.
11. Zmiażdżyć opaskę żelową (np. odwirowanie probówki w probówce).

e. Re-Extract cDNA

12. Dodać 300 μl buforu TEN i inkubować w temperaturze 37 °C przez 4 godziny na rotatorze.
13. Przenieść płyn do oznakowanej probówki zbiorczej, dodać kolejne 300 μl buforu TEN do probówki zawierającej żel i inkubować wszystko w temperaturze 4 °C przez noc na rotatorze.
14. Odessać pozostały płyn, przenieść do oznaczonej probówki zbiorczej jak poprzednio i zanotować całkowitą odzyskaną objętość.

f. Wytrącanie etanolu

15. Dodaj 3 objętości 100% etanolu o temperaturze pokojowej.
16. Dodać 0,5 μl glikogenu (20 mg/ml).
17. wir.
18. Inkubować na suchym lodzie przez co najmniej 2 godziny lub w temperaturze -80 °C przez noc.
19. Wirować w mikrowirówce w temperaturze 4 °C przez 30 minut, aby uzyskać osadzanie cDNA.
20. Wylej płyn, dodaj 700 μl 75% etanolu o temperaturze pokojowej i wiruj przez 10 minut.
21. Wylej płyn i ponownie wiruj przez 5 minut.
22. Odessać supernatant bez naruszania osadu i suszyć na powietrzu przez 10 minut.
23. Ponownie rozpuść granulat w czystej wodzie.

Uwaga: Pożądana objętość skoncentrowanego roztworu cDNA zależy od projektu eksperymentalnego i powinna obejmować eksperymenty kontrolne.

7. Oczyszczanie produktu Pre-PCR

Oczyszczanie przez enzymatyczne trawienie starterów, a następnie wirowanie kolumny (zgodnie z protokołami producentów)

Nazwa odczynnika firma Prod/Kot # ExoSAP-IT USB-Affymetrix Numer telefonu 78250 Zestaw do oczyszczania MinElute PCR Qiagen powiedział: Numer katalogowy 28004 TGL

Uwaga: W naszych rękach ekskluzywne oczyszczanie enzymatyczne skutecznie usunęło startery, ale także doprowadziło do częściowej degradacji wstępnie wzmocnionego produktu, prawdopodobnie z powodu częściowej denaturacji krótkich produktów, gdy temperatura wzrasta do 80 °C podczas etapu inaktywacji enzymu. Unikanie inaktywacji termicznej i bezpośrednie oczyszczanie produktów PCR z reakcji enzymatycznej za pomocą kolumn wirowych usuwa wszelki starter bez degradacji produktu.

1. Zmieszaj 5 μl produktu post-PCR z 2 μl ExoSAP-IT.
2. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut w celu degradacji pozostałych starterów i nukleotydów.
3. Dodać 5 objętości buforu PB do 1 objętości reakcji PCR i wymieszać, jeśli wskaźnik pH I został dodany do buforu PB, sprawdzić, czy kolor mieszaniny jest żółty.
4. Umieść kolumnę MinElute w dołączonej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml w odpowiednim stojaku.
5. Umieścić próbkę w kolumnie MinElute i wirować przez 1 minutę.
6. Odrzucić przepływ, umieścić kolumnę MinElute z powrotem w tej samej probówce i dodać 750 μl buforu PE do kolumny MinElute w celu umycia i odwirowania przez 1 minutę.
7. Odrzuć przepływ i umieść kolumnę MinElute z powrotem w tej samej probówce. Odwirować kolumnę przez dodatkową 1 minutę z maksymalną prędkością.
8. Umieść kolumnę MinElute w czystej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
9. Aby wymyć DNA, dodaj 10 μl uzdatnionej wody DEPC do środka membrany, pozostaw kolumnę na 1 minutę, a następnie odwiruj przez 1 minutę.

8. Profilowanie Fludigim 96.96 qRT-PCR

Nazwa odczynnika firma Prod/Kot # Komentarze Zestaw Fluidigm 96.96 Dynamic Array<br /> 96.96 Tablica dynamiczna
96.96 Przewód sterujący płyn
20x Odczynnik Ładujący Korporacja Fluidigm     Mieszanka
Uniwersalny podkład odwrotny (1 μM)
Podkład do przodu (1 μM)
Sonda TaqMan (0,2 μM) Zintegrowane technologie DNA zwyczaj Sekwencja (1) 2x Uniwersalny PCR Master Mix
z NoAmpErase UNG Biosystemy stosowane 4324018   Animacji      

1. Przygotowanie 96.96 Dynamic Array IFC

1. Wstrzyknąć płyn z przewodu sterującego (150 μl) do każdego z akumulatorów na chipie.
2. Umieść chip w kontrolerze IFC (zintegrowany obwód fluidyczny) i uruchom skrypt Prime (136x), aby wprowadzić płyn z przewodu sterującego do chipa.

Uwaga: Chip musi być użyty 24 godziny po otwarciu opakowania. Upewnij się, że nie rozlałeś płynu z przewodu sterującego, ponieważ płyn z przewodu sterującego na chipie lub we wlotach sprawia, że chip nie nadaje się do użytku. Chip należy załadować w ciągu 60 minut od zalania.

2. Przygotowanie próbek

2.1 Przygotowanie próbki wstępnej

W jednorazowej plastikowej tubie połącz składniki z poniższej tabeli, aby uzyskać Próbkę-Wstępną Mieszankę (Objętości na wlot).

2x TaqMan Uniwersalny Mistrz Mix 2,5 μl 20x Odczynnik Ładujący 0,25 μl

Uwaga: Końcowa objętość wynosi 2,75 μl, jako nadwyżka ze względu na straty przy dozowaniu pipet

2.2 Przygotowanie próbki

Połącz w 96 dołkach formatuj każdą próbkę z mieszanką próbek wstępnych (objętości na wlot).

Wstępne mieszanie próbek 2,75 μl próbka 2,25 μl

Uwaga: Krótko odwiruj i odwiruj płytkę 96-dołkową, aby zebrać płyn.
Końcowa objętość na wlot 5 μl, należy wziąć pod uwagę ubytki związane z pipetowaniem, przygotowując nieco większą objętość.

2.3 Przygotowanie 13-krotnych testów

1. Użyj płytki 96-dołkowej, aby przygotować 13-krotne testy. 1x stężenia w poniższej tabeli, skaluj w górę do 13x.

Uniwersalny podkład odwrotny 1 μm (1x) Sekwencja w² Podkład do przodu* 1 μm (1x) * Specyficzna dla genu sonda TaqMan # 0,2 μm #

* Listę starterów do przodu można znaleźć pod adresem http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm

# Listę sond TaqMan można znaleźć pod adresem http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm

2. Połącz w nowym 96-dołkowym podwielokrotniu płytek z 13-krotnymi testami z Tween, aby uzyskać końcowe stężenie Tween 0,25%
   nuta: Końcowa objętość na wlocie wynosi 5 μl, przygotuj wystarczającą objętość (5,5 μl), aby uwzględnić straty podczas przenoszenia objętości.
3. Dobrze wymieszaj, unikając pęcherzyków i krótko odwiruj, aby zebrać płyn.

3. Ładowanie chipa

Uwaga: Aby umożliwić prawidłowe ładowanie próbek i testów, upewnij się, że chip jest prawidłowo ustawiony. Wygodnie jest wyrównać wycięcie do lewego górnego rogu.

Upewnij się, że wszystkie roztwory testów i próbek są wymieszane przed załadowaniem chipa. Wygodnie jest to zrobić w płytce 96-dołkowej i obrócić płytkę w dół przed załadowaniem chipa. Należy zapoznać się z mapą pipetowania chipów, aby móc z niej skorzystać w późniejszym czasie.

Niewykorzystane wloty próbek powinny być wypełnione mieszanką próbek o objętości 2,75 μl i wodą wolną od DNA o objętości 2,25 μl.

Nieużywane wloty testów powinny być wypełnione 2,5 μl odczynnikiem ładującym test i 2,5 μl wody.

Nie przekraczaj pierwszego przystanku podczas pipetowania, aby uniknąć wprowadzenia pęcherzyków powietrza.

1. Po załadowaniu próbek i testów (objętość na wlocie: 5 μl) uruchom skrypt skryptu Load Mix (136x), aby załadować próbki i testy do chipa.
2. Po zakończeniu działania skryptu wyjmij układ scalony z kontrolera ICF.
3. Oderwij niebieską folię ochronną od spodu załadowanego chipa.
4. Usuń wszelkie cząsteczki kurzu lub zanieczyszczenia z powierzchni wióra.

4. 96,96 qRT-PCR

1. Przenieś chip do systemu BioMark i użyj następujących warunków amplifikacji:
   55 °C przez 2 min, 95 °C przez 10 min, a następnie 40 cykli po 95 °C przez 15 s i 55 °C przez 1 min.
2. Postępuj zgodnie z protokołem producenta dotyczącym oprogramowania do gromadzenia danych.

5. Korzystanie z oprogramowania do analizy qPCR

Po RT- PCR zastrzeżone oprogramowanie dostarcza krzywe amplifikacji, mapy ciepła i wartości Ct dla każdego dołka. Zapoznaj się z instrukcją obsługi oprogramowania w celu analizy danych.

9. Reprezentatywne wyniki:

Rysunek 1. Diagramowe przedstawienie eksperymentalnego przepływu pracy. Pokazano opis krok po kroku protokołu multipleksowego qRT-PCR, w tym oczyszczanie (Krok E) nadmiaru starterów z multipleksowej odwrotnej transkrypcji (Krok C) i multipleksowej preamplifikacji (Krok D) przed detekcją w czasie rzeczywistym (Krok F), w wyniku czego powstaje oczyszczona matryca cDNA do qRT-PCR. FP: starter do przodu specyficzny dla mikroRNA, URP: uniwersalny starter odwrotny, R-SLP: specyficzny dla mikroRNA starter reverse stem-loop.
Kliknij tutaj, aby powiększyć obraz.

Rysunek 2. Oczyszczanie matrycy qRT-PCR w żelu poliakrylamidowym po pre-PCR. Pasma wielkości produktu pre-PCR są widoczne wyłącznie w próbkach WT, ale nie w próbkach DGCR8^-/- lub Dicer^-/- z niedoborem mikroRNA (strzałki) po 96-plex RT i 12 cyklach preamplifikacji. Należy zauważyć, że we wszystkich próbkach (gwiazdy) znajdują się niespecyficzne produkty niewiadomego pochodzenia (groty strzałek) i nadmierna ilość starterów.

Rysunek 3. Oczyszczanie po preamplifikacji multipleksowej znacznie poprawia dokładność wyników qRT-PCR. a) Porównanie względnych poziomów ekspresji mESC WT do mESC Dgcr8^-/- (kanoniczny niedobór mikroRNA) ujawnia 1) wykrycie większej liczby mikroRNA i 2) utratę fałszywie dodatnich sygnałów w tłach Dgcr8^-/- po oczyszczeniu starterów produktu pre-PCR. b) Po oczyszczeniu względne poziomy ekspresji zarówno ^{DGCR8 -/-}/_WT, jak i ^{Dicer -/-}/_WT wykazują utratę sygnałów fałszywie dodatnich i pozwalają na właściwą kategoryzację rzadkich małych RNA niezależnych od Dgcr8 / _Dicer (miR-320, -484, -877). ⁵

Rysunek 4. Wysokoprzepustowe profilowanie miRNA qRT-PCR metodą Fluidigm. Przykładowy zrzut ekranu profilowania mirkoRNA 96.96 Fluidigm qRT-PCR w celu wykrycia zmian w poziomach miRNA surowic pacjenta z rakiem prostaty. Oprogramowanie do analizy qPCR w czasie rzeczywistym zapewnia krzywe wzmocnienia, oznaczone kolorami mapy ciepła i próg cyklu (Ct).

Discussion

miRNA to krótkie (18-24 nukleotydy), niekodujące RNA, które regulują ekspresję genów po transkrypcji, zarówno destabilizując informacyjne RNA (mRNA), jak i hamując ich translację. ⁶ Fakt, że co najmniej jedna trzecia ludzkich genów zawiera konserwatywne miejsca wiązania miRNA w ich 3'UTR oraz ewidentne interakcje miRNA z genami pluripotencji, proliferacji i apoptozy, sugeruje krytyczny wkład w decyzje dotyczące losu komórek, homeostazy tkanek i chorób takich jak rak. ^6,7 W związku z tym dokładne profile ekspresji mikroRNA cieszą się dużym zainteresowaniem.

Aby przetestować opublikowany protokół profilowania ekspresji miRNA qRT-PCR^{multipleksu 2}, użyliśmy mESC z niedoborem małego RNA jako kontroli negatywnej. Komórki DGCR8^-/- mają niedobór wszystkich kanonicznych mikroRNA, podczas gdy komórki Dicer^-/- nie mają zarówno kanonicznych, jak i niekanonicznych mikoRNA. ^8,9 pkt.

Porównując poziomy w komórkach mES- typu dzikiego do DGCR8^-/- , odkryliśmy brak dokładności, ponieważ kilka ekspresji¹⁰ mikroRNA nie zostało wykrytych w komórkach typu dzikiego¹¹. Niektóre wykazały nawet niższe poziomy ekspresji w stosunku do komórek nokautujących (ryc. 3a). Postawiliśmy hipotezę, że brak dokładności może być spowodowany masowym przenoszeniem starterów dwóch kolejnych etapów multipleksu (RT i Pre-PCR) przed kwantyfikacją RT singleplex. Jednak wstępne wzmocnienie multipleksowe jest konieczne w celu zwiększenia siły sygnału, zwłaszcza gdy początkowe stężenie RNA jest ograniczone. Oczyszczając produkty pre-PCR ze starterów poprzez dobór wielkości na natywnych żelach poliakrylamidowych (Figura 2), mogliśmy wykazać znaczną poprawę dokładności poprzez wykrycie większej liczby mikroRNA i utratę sygnałów fałszywie dodatnich zarówno w tłach Dgcr8^-/- , jak i Dicer^-/- (Figury 3a i 3b) Ponadto zmodyfikowane podejście qRT-PCR pozwoliło na właściwą kategoryzację rzadkich niezależnych od Dgcr8 / _Dicer zależne małe RNA (ryc. 3b)¹¹. Dlatego dodatkowy etap w celu oczyszczenia nadmiaru starterów z produktu pre-PCR jest wyraźnie korzystny, zwłaszcza w przypadku stosowania dużych zestawów starterów multipleksowych na próbkę.

Optymalna liczba cykli wstępnej amplifikacji zależy od wejściowych stężeń RNA. Równowaga, aby nie dopuścić do niedostatecznego lub nadmiernego wzmocnienia, powinna opierać się na szczegółach konkretnego eksperymentu.

Przy ponad tysiącu znanych mikroRNA, użycie standardowych płytek 384-dołkowych może nie być optymalne dla rozległego profilowania mikroRNA, zwłaszcza podczas porównywania wielu próbek. Fluidigm Dynamic Array IFC umożliwia, przy znacznym zmniejszeniu liczby etapów pipetowania i wymaganych procesów chemicznych, przetestowanie do 96 pojedynczych próbek na 96 różnych mikroRNA w jednym eksperymencie (9216 reakcji) w skali nanolitrowej (6,7 nL). Dla każdego przebiegu oprogramowanie analityczne zapewnia krzywe wzmocnienia, oznaczone kolorami mapy cieplne i wartości progowe cyklu (Ct). Jednoczesne profilowanie na dużą skalę zmniejsza wariancje eksperymentalne i pozwala na normalizację średniej wartości ekspresji, co przewyższa inne strategie normalizacji wykorzystujące kontrole małych RNA. ¹²

W porównaniu z dostępnymi na rynku platformami 384 odwiertów z wstępnie przypisanymi sondami TaqMan, połączenie wysokowydajnej platformy profilowania z niestandardowymi zestawami starterów zapewnia wysoką elastyczność eksperymentalną.

Zoptymalizowane podejście multipleksowe qRT-PCR w połączeniu z platformą Dynamic Array z powodzeniem pozwoliło nam jednocześnie przebadać surowice 48 pacjentów z rakiem prostaty pod kątem zmian w poziomach 384 miRNA (Figura 4) i znormalizować dane bez skoku w kontrolach (tj. syntetycznych mikroRNA). ¹¹

Pomimo wydłużenia etapów od przygotowania próbek do wyników profilowania, opisane podejście jest efektywną czasowo i kosztowo metodą o wysokiej przepustowości do profilowania dużych zestawów próbek pod kątem poziomów ekspresji miRNA, nawet przy ograniczonym materiale wyjściowym.