Obrazowanie optyczne neuronów w zwoju stomatogastrycznym kraba z wykorzystaniem barwników napięciowo-czułych

Podsumowanie

W niniejszej pracy przedstawiamy metodologię szybkiego obrazowania fluorescencyjnego z wysoką rozdzielczością przy użyciu barwników wrażliwych na napięcie w celu analizy szczegółowej aktywności neuronów w zwoju stomatogastrycznym kraba.

Streszczenie

Obrazowanie neuronów z wykorzystaniem barwników napięciowo-czułych jest kluczową metodologią służącą zrozumieniu organizacji sieci neuronalnych oraz tego, w jaki sposób jednoczesna aktywność uczestniczących w nich neuronów prowadzi do wyłonienia się zintegrowanej funkcjonalności sieci. W niniejszej pracy przedstawiamy metodologię zastosowania tej techniki w odniesieniu do zidentyfikowanych neuronów generujących wzorce w zwoju stomatogastrycznym kraba. Demonstrujemy wprowadzanie do tych neuronów fluorescencyjnego barwnika napięciowo-czułego Di-8-ANEPPQ oraz pokazujemy, jak obrazować aktywność neuronów obciążonych barwnikiem przy użyciu systemu obrazowania z szybką kamerą CCD o wysokiej rozdzielczości MiCAM02. Prezentujemy analizę zarejestrowanych danych obrazowych przy użyciu oprogramowania BVAna powiązanego z systemem obrazowania MiCAM02. Jednoczesne obrazowanie szczegółowej aktywności wielu neuronów w zwoju stomatogastrycznym kraba z użyciem barwników napięciowo-czułych, stosowane razem z tradycyjnymi technikami elektrofizjologicznymi (rejestracjami wewnątrzkomórkowymi i zewnątrzkomórkowymi), otwiera zupełnie nowe możliwości zrozumienia zasad działania sieci neuronalnych centralnych generatorów wzorców.

Protokół

1. Przygotowanie układu nerwowego stomatogastrycznego kraba

Dorosłe osobniki *pagurus L.* zostały pozyskane z lokalnych źródeł (Newcastle University, Dove Marine Laboratories) i utrzymywane w filtrowanej, napowietrzonej wodzie morskiej (10 - 12°C). Przed sekcją zwierzęta znieczulono, umieszczając je w lodzie na 20 - 40 min. Wykorzystano wyizolowane stomatogastryczne układy nerwowe (STNS)¹. STNS przymocowano szpilkami w szalce Petri wyłożonej elastomerem silikonowym (ELASTOSIL RT-601, Wacker, Monachium, Niemcy) i poddano ciągłej perfuzji (7 - 12 mL/min) schłodzoną solą fizjologiczną (10-13°C). Sól fizjologiczna składała się z (mMol*l-1): NaCl, 440; MgCl₂, 26; CaCl₂, 13; KCl, 11; trismas base, 10; kwasu maleinowego, 5. Roztwór utrzymywano w stałej temperaturze 11 - 13°C i przy pH 7.4 - 7.6.

Szczegółowe etapy preparacji i sekcji STNS, w tym usuwanie osłonki zwoju żołądkowo-ustnego (STG), zostały przedstawione w artykule JoVE autorstwa Guttierez i Grashow¹. Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z dyrektywą Rady Wspólnot Europejskich z dnia 24^listopada 1986 r. (86/609/EWG). Rysunek 1A przedstawia schemat STNS, a rysunek 1B pokazuje typowy STG po usunięciu osłonki, w którym neurony są rozmieszczone w formie płaskiego półkola w tylnej części zwoju.

Szalkę Petriego z STNS mocuje się do platformy roboczej mikroskopu obrazującego (BW51 WI; Olympus, Tokyo, Japonia) za pomocą plasteliny modelarskiej. Zarówno stolik mikroskopu, jak i sam mikroskop są zamontowane na stole wibroizolowanym (Scientifica, Uckfield, UK), aby zapobiec artefaktom ruchowym podczas rejestracji optycznej. Wzorce aktywności motorycznej generowane w zwoju żołądkowo-odbytniczym (STG) są monitorowane za pomocą rejestracji pozakomórkowej^2-4. Odbywa się to w następujących krokach:

1. Wokół fragmentu głównego nerwu ruchowego (lvn) tworzy się cylindryczną komorę z wazeliny, aby odizolować nerw elektrycznie od kąpieli (czynność tę wykonuje się na stole sekcyjnym przed umieszczeniem szalki Petriego na platformie roboczej mikroskopu obrazującego).
2. Jeden z dwóch stalowych drutów elektrodowych umieszcza się w tej komorze, a drugi w kąpieli jako elektrodę odniesienia.
3. Sygnał różnicowy jest rejestrowany, filtrowany i wzmacniany za pomocą różnicowego wzmacniacza prądu przemiennego (Univ. Kaiserslautern, Niemcy).
4. Aktywność ruchową zwoju monitoruje się za pomocą oscyloskopu (DL708E; Yokogawa, Tokio, Japonia) i dodatkowo rejestruje za pomocą karty akwizycji danych (CED Power, 1401, Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK) oraz oprogramowania Spike 2 v6.10 (Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK). Pliki są analizowane przy użyciu Spike 2 v6.10 (Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK).

2. Przygotowanie roztworu barwnika

Użyliśmy fluorescencyjnego barwnika wrażliwego na napięcie Di-8-ANEPPQ (Cambridge Bioscience)⁵, który posiada podwójny ładunek dodatni ułatwiający wprowadzanie barwnika poprzez mikroelektrody przy użyciu dodatnich impulsów prądowych. Roztwór barwnika należy w miarę możliwości chronić przed światłem. Roztwór barwnika przygotowuje się w następujący sposób:

1. 5 mg barwnika miesza się z 1 mL roztworem kwasu Pluronic F-127 w DMSO (Invitrogen).
2. Plastikową probówkę z rozpuszczonym barwnikiem wiruje się przez 20 minut przy 12 000 rotation/minute w mikrocentry fudze Sigma Microcentrifuge 1-14 (Sigma, Osterode, Niemcy), aby oddzielić większe cząsteczki barwnika, które mogłyby zapchać mikroelektrodę.
3. Nadosad (górne 200 μL) roztworu barwnika pobiera się za pomocą pipety i przelewa do oddzielnej plastikowej probówki. Obie probówki owija się folią aluminiową, aby zapobiec ekspozycji na światło.
4. Roztwór barwnika zamraża się w temperaturze -20 °C.
5. Przed użyciem roztwór barwnika rozmraża się, umieszczając zamkniętą i owiniętą probówkę w ciepłej (25 °C) wodzie na 10-15 minut.

3. Wprowadzanie barwnika poprzez wstrzykiwanie wewnątrzkomórkowe za pomocą ostrych mikroelektrod

Do wprowadzenia barwnika do neuronów wykorzystaliśmy ostre mikroelektrody. W celu weryfikacji załadowania barwnika zastosowano system obrazowania MiCAM02 (SciMedia, Tokio, Japonia)⁶. System obrazowania posiada dwie kamery CCD: kamera HR posiada większy chip sensora (6.4 mm x 4.8 mm), co zapewnia lepszą rozdzielczość przestrzenną przy najlepszej rozdzielczości czasowej wynoszącej 1.4 ms, natomiast kamera HS posiada mniejszy (2.9 mm x 2.1 mm), lecz szybszy chip sensora, co umożliwia szybsze obrazowanie z najlepszą rozdzielczością czasową 0.7 ms. Etapy wprowadzania barwnika są następujące:

1. Mikroelektrody są wyciągane za pomocą wyciągarki do elektrod P-97 Flaming - Brown (Sutter Instruments, Novato, CA, USA), wykorzystując szklane rurki z włóknem o długości 10 cm i średnicy zewnętrznej 1 mm (GB100TF 8P, Science Products, Hofheim, Niemcy). Elektrody są wyciągane do uzyskania rezystancji w zakresie 25–40 MOhm w 3M KCl (w celu dobrania odpowiednich parametrów wyciągania należy skorzystać z instrukcji do pipet dostarczonej przez producenta wyciągarki).
2. Zamrożony roztwór barwnika zostaje roztopiony, a następnie bardzo niewielką jego ilość zasysa się do igły MicroFil (MicroFil - 34G, World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA) – zassany barwnik wypełnia około 2/3 igły.^{Badań i rozwoju} igły Microfil.
3. Roztwór barwnika znajdujący się w igle Microfil jest wstrzykiwany do końcówki mikroelektrody. Mikroelektrodę umieszcza się w ciemnej komorze na 15 minut.
4. Mikroelektrodę wypełnia się roztworem 3M KCl. Następnie elektrodę umieszcza się z powrotem w ciemnym pojemniku do przechowywania elektrod na kolejne 10–20 minut, aby roztwór barwnika dotarł do cienkiej końcówki elektrody pod wpływem sił kapilarnych działających w mikroelektrodzie.
5. Gotową mikroelektrodę umieszcza się w uchwycie do elektrod i mocuje do głowicy wzmacniacza wewnątrzkomórkowego (IA-251A, Warner Instruments Corporation, Hamden, CT, USA).
6. Wzmacniacz wewnątrzkomórkowy jest podłączony do karty akwizycji danych, która generuje sygnał impulsowy w celu wprowadzenia impulsów prądowych do mikroelektrody.
7. Mikroelektrodę umieszcza się delikatnie w błonie neuronu STG, korzystając z manipulatora mikroelektrod (PatchStar, Scientifica Ltd, Uckfield, UK). Ze względu na bardzo małą odległość roboczą obiektywu 10x (UMPLFL10XW, NA 0,30, WD 3,3 mm; Olympus Corporation, Tokio, Japonia) mikroskopu obrazującego, mikroelektrodę należy ustawić pod kątem (około 30°) a przemieszczenie mikroelektrody w odpowiednią pozycję wymaga kilkukrotnego ponownego ustawienia ostrości obiektywu mikroskopu oraz przesuwania mikroelektrody. Na początku mikroelektrodę przesuwa się w taką pozycję, aby jej końcówka znajdowała się nad STG. Obiektyw mikroskopu opuszcza się do momentu, aż końcówka elektrody stanie się widoczna i ostra. Następnie obiektyw opuszcza się nieco bardziej, jednak nie na tyle, aby dotknąć mikroelektrody. Mikroelektrodę opuszcza się do momentu, aż ponownie pojawi się ona w płaszczyźnie ostrości obiektywu. Kroki te powtarza się do czasu, aż neurony staną się wyraźnie widoczne w płaszczyźnie ostrości obiektywu. Następnie mikroelektrodę opuszcza się, aż dotknie ona i delikatnie przebije błonę wybranego neuronu STG. Proces ten monitoruje się za pomocą oscyloskopu.
8. Elektrodę wewnątrzkomórkową wykorzystuje się do rejestracji aktywności wybranego neuronu STG w celu jego identyfikacji na podstawie profilu aktywności oraz zależności między jego aktywnością a aktywnością STG rejestrowaną za pomocą elektrody zewnątrzkomórkowej^2,3,7.
9. Wzmacniacz wewnątrzkomórkowy przełącza się w tryb wstrzykiwania prądu i wykorzystuje przez 30 minut do podawania do mikroelektrody dodatnich skoków prądu o wartości 10 nA; każdy skok trwa 1 sekundę i jest oddzielony 1-sekundową przerwą, podczas której do mikroelektrody nie podaje się prądu. Wstrzykiwany prąd wprowadza dodatnio naładowane cząsteczki barwnika do rejestrowanego neuronu. Jeśli dostępny jest odpowiedni sprzęt, można wstrzykiwać barwnik do wielu neuronów jednocześnie.
10. Rozprzestrzenienie barwnika w neuronie sprawdza się w dziesiątej minucie okresu iniekcji oraz po jej zakończeniu. W tym celu wykorzystuje się system obrazowania MiCAM02 (SciMedia Ltd, Tokio, Japonia) z obiektywem 10x i oświetleniem z halogenowego źródła światła o ultra-niskim tętnieniu (HL-151; Moritex, Tokio, Japonia) poprzez kostkę filtracyjną MSWG2 (z filtrem wzbudzenia 480-550 nm; Olympus Corporation, Tokio, Japonia). System obrazowania jest ustawiony na korzystanie z kamery HR o rozdzielczości 192 x 128 pikseli, czasie obrazowania 40 ms, trybie „hbin” oraz 10 klatkach na sesję obrazowania. Jeśli wypełnienie barwnikiem przebiegło pomyślnie, obraz powinien wykazać zabarwiony obszar w neuronie wokół miejsca wprowadzenia mikroelektrody; obszar ten powinien powiększyć się pomiędzy obrazami wykonanymi po 10 a po 30 minutach. Jeśli po 30 minutach rozprzestrzenienie barwnika jest niewystarczające, wydłuża się czas iniekcji. Alternatywnie można zastosować nową elektrodę z barwnikiem.
11. Elektrodę wyjmuje się z neuronu, a następnie pozostawia go do regeneracji przez co najmniej 20–30 minut. W tym czasie do kolejnego neuronu można wprowadzić barwnik.

4. Obrazowanie barwionych neuronów

Aktywność pojedynczych neuronów można obrazować po przeprowadzeniu procedury wypełniania barwnikiem. Alternatywnie można wypełnić dwa lub więcej neuronów, aby obrazować jednoczesną aktywność kilku neuronów STG. W zasadzie wiele, a być może wszystkie neurony STG, może zostać wypełnione barwnikiem. Obrazowanie neuronów jest wykonywane za pomocą systemu obrazowania MiCAM 02 przy użyciu kamery HR. Procedura obrazowania przebiega w następujący sposób:

1. Zmieniono obiektyw mikroskopu i do gromadzenia danych obrazowych wykorzystano obiektyw 20x o wysokiej wydajności transmisji światła (XLUMPLFL20XW/0.95, NA 0.95, WD 2.0mm; Olympus Corporation, Tokyo, Japan). Obiektyw ten zbiera znacznie więcej światła niż obiektyw 10x i zapewnia również większe powiększenie, co pozwala uzyskać bardziej szczegółowy obraz neuronów. Wyższa wydajność świetlna oznacza, że nawet niewielka ilość wprowadzonego barwnika jest już widoczna przy użyciu tego obiektywu, a także że do obrazowania można zastosować niższą intensywność światła, co redukuje potencjalne uszkodzenia fotochemiczne neuronów wywoływane przez barwnik.
2. Stół roboczy mikroskopu jest ustawiony w taki sposób, aby neurony przeznaczone do obrazowania znajdowały się w polu widzenia obiektywu, a następnie obiektyw zostaje na nich skupiony.
3. Dane z rejestracji zewnątrzkomórkowej są również wprowadzane do systemu obrazowania MiCAM 02 poprzez jego analogowy kanał wejściowy. Umożliwia to stosunkowo łatwe powiązanie sygnałów optycznych z odpowiadającymi im wzorcami ruchowymi lub zarejestrowanymi zewnątrzkomórkowo impulsami (spikes) w fazie analizy.
4. System MiCAM 02 jest ustawiony na rozdzielczość 96 x 64 piksele z czasem obrazowania 2.2 ms lub rozdzielczość 48 x 32 piksele z czasem obrazowania 1.5 ms. W obu przypadkach można zastosować ustawienie „hbin”, jeśli zabarwienie neuronów nie jest bardzo intensywne.
5. Poziom światła jest ustawiony na jak najniższy (tj. barwnik w neuronach powinien nadal generować fluorescencję wystarczającą do obrazowania), aby uniknąć fotomodulacji i uszkodzeń fotochemicznych rejestrowanych neuronów.
6. Oświetlenie pomieszczenia oraz wszystkie pozostałe źródła światła zostają wyłączone. Dodatkowo wokół aparatury rejestracyjnej można zasłonić czarną zasłonę, aby zapobiec ekspozycji na światło z zewnętrznych źródeł.
7. Czas trwania sesji obrazowania jest ustawiony w przedziale od 4 do 16 sekund.
8. Spontaniczna aktywność zabarwionych neuronów jest rejestrowana podczas kilku sesji obrazowania.

5. Analiza danych obrazowania optycznego

Do analizy danych obrazowych wykorzystaliśmy oprogramowanie BVAna (wersja 10.08; SciMedia Ltd, Tokio, Japonia) powiązane z systemem obrazowania MiCAM 02. Oprogramowanie to umożliwia wizualizację danych obrazowych i zapewnia również szereg narzędzi analitycznych. Kroki analizy i interpretacji danych są następujące:

1. Dla każdego rejestrowanego neuronu wybierany jest odpowiedni okrągły obszar zainteresowania (ROI). Zazwyczaj stosujemy obszary zainteresowania o promieniu 2 - 3 pikseli do badania neuronów przy rozdzielczości 48 x 32 pikseli oraz obszary o promieniu 6 - 8 pikseli dla neuronów przy rozdzielczości 96 x 64 pikseli.
2. Możliwe jest zastosowanie wygładzania czasowego danych, zwłaszcza jeśli barwnik generuje stosunkowo niską fluorescencję (wskazuje na to niska wartość tła w danych; może to wynikać z zastosowania niskiego poziomu światła lub niskiego stopnia załadowania barwnika, np. w neurycie rejestrowanego neuronu). W takich przypadkach zazwyczaj stosowano wygładzanie czasowe z 3 - 5 jednostkami czasu.
3. Oprócz rejestracji optycznej wyświetlamy również zapis zewnątrzkomórkowy, wybierając opcję wyświetlania wejścia analogowego systemu obrazowania.
4. Parametry wizualizacji danych optycznych oraz wejścia analogowego należy ustawić w odpowiedni sposób, aby wszystkie zapisy były widoczne na ekranie komputera.
5. Biorąc pod uwagę optyczne zapisy neuronów, zapis zewnątrzkomórkowy z lvn oraz klasyfikację neuronu na podstawie wcześniejszego zapisu wewnątrzkomórkowego, możliwe jest określenie tożsamości neuronu i powiązanie jego aktywności z aktywnością neuronalną rejestrowaną z nerwu.
6. Oczekuje się, że zapisy optyczne wyraźnie i bez konieczności uśredniania wielu podobnych zdarzeń pokażą aktywność neuronalną odpowiadającą zarejestrowanym zewnątrzkomórkowo kolcom (spike'om), a także zdarzenia podprogowe, takie jak hamujące potencjały postsynaptyczne wywołane aktywnością innych neuronów.
7. Funkcje eksportu danych oprogramowania BVAna mogą zostać wykorzystane do eksportu zapisów optycznych obliczonych dla wybranych obszarów zainteresowania, a także wejścia analogowego zawierającego zapis z lvn. Wyeksportowane dane mogą być następnie przetwarzane i analizowane za pomocą innego oprogramowania do analizy danych (np. w najprostszym przypadku do dodatkowej wizualizacji i przetwarzania danych można użyć programu Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, US)).

6. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 2 przedstawia jednoczesną rejestrację dwóch neuronów (LP, boczny neuron pyloryczny; PD, neuron rozszerzający pylorus) w generatorze centralnym pylorycznym STG kraba wraz z rejestracją z lvn. Optyczne rejestracje neuronów LP i PD, zidentyfikowanych na podstawie pomiarów wewnątrzkomórkowych, wykazują, że w rzeczywistości dobrze odpowiadają one rejestracjom zewnątrzkomórkowym przypisanym do neuronów LP i PD. Między optycznymi a lvn rejestracjami szczytów potencjałów czynnościowych występuje stałe opóźnienie wynoszące 12 ms (patrz wstawka na Rysunku 2), co wynika z opóźnienia przewodzenia aksonalnego między zwojem a miejscem rejestracji zewnątrzkomórkowej. Przedstawione dane pokazują również, że aktywność neuronalna w somie, odpowiadająca potencjałom czynnościowym rejestrowanych neuronów, jest wyraźnie wykrywalna.

Rycina 1. A) Schematyczny rysunek stomatogastrycznego układu nerwowego (STNS). CoG, zwój komisuralny; OG, zwój przełykowy; STG, zwój stomatogastryczny; stn, nerw stomatogastryczny; lvn, boczny nerw komorowy. B) Zwój stomatogastryczny (STG) kraba – obraz przedstawia półkolisty, tylny układ neuronów STG.

Rysunek 2. Symultaniczne rejestrowanie pojedynczego przebiegu neuronu PD i LP wraz z rejestracją lvn. Dane wykazują, że rejestracje optyczne i nerwowe bardzo dobrze się pokrywają i że możemy zidentyfikować aktywności neuronalne odpowiadające kolcom zarejestrowanym z nerwu. Wstawka przedstawia nałożenie kilku przebiegów potencjałów czynnościowych LP – zarejestrowanych zarówno optycznie, jak i elektrycznie – oraz ich średnią, co demonstruje zgodność między aktywnościami zarejestrowanymi optycznie i elektrycznie. Ze względu na to, że nasza metoda rejestracji optycznej nie odfiltrowuje niskoczęstotliwościowych komponentów danych, jesteśmy również w stanie zarejestrować wolne zmiany potencjału błonowego charakterystyczne dla neuronów PD i LP¹⁴.

Dyskusja

Obrazowanie neuronów STG z wykorzystaniem barwników wrażliwych na napięcie^8,9 w połączeniu z tradycyjnymi metodami elektrofizjologicznymi (rejestracjami wewnątrz- i zewnątrzkomórkowymi) pozwala na lepsze zrozumienie funkcjonowania tego małego, dobrze znanego, a wciąż złożonego układu neuronalnego. STG stanowi prototyp sieci neuronalnych generatorów centralnych wzorców (CPG) (obejmuje sieci rytmiczne pyloryczne i żołądkowe)^10,,11, zatem lepsze zrozumienie wyłaniających się właściwości funkcjonalnych STG pomoże również zrozumieć, w jaki sposób sieci CPG w ogóle generują swoją funkcjonalność na poziomie sieciowym. Sieci CPG odgrywają krytyczną rolę w kontroli motorycznej¹², a także w wyższych funkcjach poznawczych¹³, w konsekwencji lepsze zrozumienie ich właściwości emergentnych może mieć istotny wpływ na wiele dziedzin neuronauki.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
MiCAM02	SciMedia		System obrazowania
BVAna v.10.08	SciMedia		Oprogramowanie do analizy danych dla systemu obrazowania MiCAM 02
HL-151	Moritex, Tokio, Japonia		Halogenowe źródło światła o bardzo niskim tętnieniu
BX51 WI	Olympus Corporation		Mikroskop pionowy do obrazowania epifluorescencyjnego
Obiektyw obrazujący 20x	Olympus Corporation	XLUMPLFL20XW/0.95	NA 0.95, WD 2.0mm
Obiektyw obrazujący 10x	Olympus Corporation	UMPLFL10XW	NA 0.30, WD 3.3mm
Kostka filtracyjna z filtrem wzbudzenia 480-550 nm i filtrem emisyjnym 590nm	Olympus Corporation	MSWG2
Stół antywibracyjny	Scientifica Ltd	63-534
Manipulator elektrod PatchStar	Scientifica Ltd	PS-7000C	Manipulator mikroelektrod
CED Power 1401	Cambridge Electronic Design		Płyta akwizycji danych
Oscyloskop DL708E	Yokogawa		Wzmacniacz wewnątrzkomórkowy
AC wzmacniacz różnicowy	University of Kaiserslautern, Niemcy		Wzmacniacz zewnątrzkomórkowy
Wytwornica elektrod P-97 Flaming – Brown	Sutter Instrument Co.		Wytwornica elektrod
Mikrowirówka Sigma Microcentrifuge 1-14	Sigma-Aldrich		Wirówka
Pipety Genex Pipettors Mline	Scientific Laboratory Supplies LTD	PIP7774	PIP7774
Szklana mikropipeta z włóknem	Science Products	GB100TF 8P	Szkło do mikr–lektrod
MicroFil – 34G	World Precision Instruments, Inc.		Igła Microfil
Spike 2 v6.10	Cambridge Electronic Design		Oprogramowanie do elektrofizjologii
Di-8-ANEPPQ	Cambridge BioScience	BT61014	Fluorescencyjny barwnik wrażliwy na napięcie
Kwas Pluronic F-127, DMSO	Invitrogen	P-3000MP	Rozpuszczalnik
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888	Składnik soli kraba
CaCl2 . 2H2O	Sigma-Aldrich	C3881	Składnik soli kraba
KCl	Sigma-Aldrich	P3911	Składnik soli kraba, roztwór elektrolitu
MgCl2 . 6H2O	Sigma-Aldrich	M9272	Składnik soli kraba
Trizma base	Sigma-Aldrich	T1503	Składnik soli kraba
Kwas maleinowy	Sigma-Aldrich	M0375	Składnik soli kraba
Elastosil RT-601	Wacker, Monachium, Niemcy		Wykładzina szalek Petriego