Artykuł metodologiczny

FISH w diagnostyce preimplantacyjnej

40.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2570

⸱

23 lutego 2011

 ,  , 
1Department of Cytogenetics, GSTS-Pathology, Guy’s & St Thomas’ NHS Foundation Trust, Guy’s & St Thomas’ Centre for Preimplantation Genetic Diagnosis

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy artykuł opisuje dobór odpowiednich sond do techniki single-cell FISH, metody preparowania jąder blastomerów, a także hybrydyzację in situ i ocenę sygnałów w kontekście diagnostyki przedimplantacyjnej (PGD) stosowanej w warunkach klinicznych.

Streszczenie

Diagnostyka preimplantacyjna (PGD) jest uznaną alternatywą dla diagnostyki prenatalnej i polega na wyborze embrionów przed implantacją z kohorty uzyskanej dzięki technikom wspomaganego rozrodu (ART). Taka selekcja może być konieczna z powodu rodzinnej choroby monogenowej (np. mukowiscydozy) lub w przypadku, gdy jeden z partnerów jest nosicielem rearanżacji chromosomowej (np. dwustronnej translokacji wzajemnej). PGD jest dostępna dla par, które miały wcześniej dzieci z wadami i/lub w przypadku rearanżacji chromosomowych, nawracających poronień lub niepłodności. Oocyty aspiracyjne po stymulacji jajników są zapładniane poprzez imersję w nasieniu in vitro (IVF) lub poprzez wstrzyknięcie pojedynczego spermatozoonu do cytoplazmy (ICSI). Embriony w stadium przedimplantacyjnego podziału są poddawane biopsji, zwykle poprzez usunięcie pojedynczej komórki w 3. dobie po zapłodnieniu, a pobrana komórka jest badana w celu ustalenia statusu genetycznego embrionu. Hybrydyzacja fluorescencyjna in situ (FISH) na utrwalonych jądrach pobranych komórek z wykorzystaniem specyficznych sond DNA jest preferowaną techniką wykrywania niezrównoważenia chromosomowego związanego z rearanżacjami chromosomowymi oraz selekcji embrionów żeńskich w rodzinach z chorobą sprzężoną z chromosomem X, dla której nie istnieje test specyficzny dla danej mutacji. Metoda FISH była również stosowana do przesiewowego badania embrionów w kierunku spontanicznej aneuploidii chromosomowej (znanej również jako PGS lub PGD-AS) w celu próby zwiększenia efektywności wspomaganego rozrodu; jednak wartość predykcyjna tego testu z wykorzystaniem opisanej tutaj techniki rozprzestrzeniania i FISH jest prawdopodobnie nieakceptowalnie niska w większości ośrodków i nie jest ona zalecana do rutynowego stosowania klinicznego. Opisujemy dobór odpowiednich sond do metody FISH w pojedynczej komórce, techniki rozprzestrzeniania jąder blastomerów oraz hybrydyzację in situ i ocenę sygnałów w zastosowaniu do PGD w warunkach klinicznych.

Protokół

1. Lizowanie i rozprzestrzenianie jądra z pobranego blastomeru

  1. Bufor do lizy komórek do rozcierania komórek (0,2% Tween20 w 0,01 M HCl, pH 2,0) należy przygotować z 24-godzinnym wyprzedzeniem i przechowywać w temperaturze -20°C. Przygotować 100 mL i przefiltrować 20 mL do sterylnego pojemnika uniwersalnego o pojemności 30 mL, używając sterylnej strzykawki 20 mL i filtra strzykawkowego. Rozdzielić w aliquoty po 1 mL do 10-15 sterylnych probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,7 mL, zamknąć i opisać probówki przed zamrożeniem. Zaleca się stosowanie dwóch różnych serii: nowej oraz poprzedniej, która została przetestowana i może być użyta, jeśli nowa seria okaże się niesatysfakcjonująca.
  2. Rozmrozić bufor do lizy w temperaturze pokojowej na 30 minut przed procedurą biopsji. W praktyce temperatura robocza będzie mieścić się w zakresie między temperaturą pokojową a temperaturą dłoni.
  3. Narysować mały okrąg (średnica około 5 mm) na spodniej stronie szkiełka pokrytego aminą (np. Genetix) za pomocą rysika diamentowego i opisać szkiełko numerem przypadku, unikalnym numerem szkiełka oraz datą biopsji. Użyć osobnego szkiełka dla każdego blastomeru w kolejności numerycznej i opisać go numerem zarodka. Szkiełka należy opisywać twardym ołówkiem (np. 4H) i „przetrzeć” rękawiczką lateksową, aby usunąć pył grafitowy.
  4. Nanieść niewielką objętość buforu do lizy wewnątrz okręgu.
  5. Przenieść pobrany blastomer do buforu do lizy. W razie potrzeby dodawać bufor do lizy wewnątrz okręgu, aż komórka zacznie ulegać lizie; komórka powinna ulec całkowitej lizie, a cytoplazma powinna się rozprzestrzenić przed wyschnięciem buforu.
  6. Obserwować jądro komórkowe, aby upewnić się, że pozostaje ono wewnątrz okręgu i nie uległo zgubieniu; jeśli komórka nie posiada jądra lub posiada wiele jąder, należy pobrać inną komórkę.
  7. Pozostawić szkiełko do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej.

2. Hybrydyzacja in situ jądra pojedynczego blastomeru

  1. Przygotować serię etanolową (70, 90 i 100%) sporządzoną w sterylniej wodzie destylowanej.
  2. Włączyć blok grzejny (np. Hybaid Omnislide lub Vysis Hybrite) i ustawić temperaturę na 75°C.
  3. Rozmrozić sondy, wymieszać na wortexie i odwir fracciones w wirówce. Odczynniki należy sprawdzić i zweryfikować przed przygotowaniem mieszaniny sond. Odmierzyć pipetą objętości określone przez producenta, aby przygotować mieszaninę sond w sterylnym probówce do mikrocentryfugi o pojemności 0,65 mL, a następnie wymieszać na wortexie i odwirować przed użyciem. Całkowita objętość mieszaniny sond powinna być wystarczająca, aby zapewnić 2 μL na każde badane jądro komórkowe, z zaokrągleniem w górę do najbliższych 10 μL w celu zachowania marginesu bezpieczeństwa.
  4. Przeprowadzić wstępne mycie szkiełek w naczyniach Coplina, używając soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) (pH 7,0: 0,14 M NaCl, 3 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4) przez 5 min w temperaturze pokojowej.
  5. Płukać szkiełka dwukrotnie w sterylniej wodzie destylowanej.
  6. Odwodnić szkiełka w serii etanolowej (70, 90 i 100%) po 2 min w każdym etapie w temperaturze pokojowej, a następnie wysuszyć na powietrzu. Upewnić się, że szkiełka są całkowicie zanurzone; jeśli na powierzchni pojawi się pył grafitowy, zebrać go czystą chusteczką.
  7. Zapisać położenie jądra komórkowego w obrębie okręgu, wizualizując je za pomocą mikroskopu fazowego.
  8. Odwodnić w 100% etanolu przez 2 min w temperaturze pokojowej i wysuszyć na powietrzu.
  9. Nanieść 2 μL mieszaniny sond i przykryć szkiełkiem cover-slip o wymiarach 9 x 9 mm (jedna czwarta szkiełka nr 1 o wymiarach 18 x 18 mm).
  10. Uszczelnić krawędzie szkiełka przykrywkowego cementem gumowym (np. Cow Gum; Cow Proofing).
  11. Przeprowadzić denaturację szkiełek na bloku grzejnym w temperaturze 75°C przez 5 min, a następnie hybrydyzować szkiełka przez noc (16-20 h) w komorze wilgotnościowej w temperaturze 37°C. Mieszaniny sond składające się wyłącznie z sond centromerycznych (np. w przypadkach sprzężonych z płcią) dadzą satysfakcjonujący wynik po 60 min hybrydyzacji.
  12. Przygotować kąpiel wodną z odpowiednią liczbą naczyń Coplina i podgrzać do 71°C.
  13. Przygotować roztwór do rygorystycznego płukania 0,4x standardowego cytrynianu saline (SSC) (pH 7,0 przy 71°C, 0,06 M NaCl, 6 mM C6H5Na3O7.2H2O) i podgrzać w kąpieli wodnej.
  14. Nalać 50 mL roztworu do rygorystycznego płukania do każdego wymaganego naczynia Coplina i sprawdzić czystym termometrem, czy temperatura bezpośrednio przed użyciem wynosi 71°C.
  15. Ostrożnie usunąć cement gumowy z każdego szkiełka i spłukać szkiełko przykrywkowe, używając 4x SSC/0,05% Tween20 (pH 7,0) w temperaturze pokojowej.
  16. Myć szkiełka w rygorystycznym roztworze 0,4x SSC w temperaturze 71°C przez 5 min. Myć nie więcej niż 6 szkiełek w jednym naczyniu Coplina.
  17. Myć szkiełka w 4x SSC/0,05% Tween20 w temperaturze pokojowej przez 2 min.
  18. Jeśli mieszanina sond zawiera sondy znakowane pośrednio, odprowadzić nadmiar cieczy ze szkiełek i nanieść 20 μL przeciwciała sprzężonego z fluoroforem pod kwadratem Parafilmu o wymiarach 20 x 20 mm.
  19. Inkubować w komorze wilgotnościowej w temperaturze 37°C przez 15 min.
  20. Usunąć Parafilm i raz wypłukać w 4x SSC/0,05% Tween20 w temperaturze pokojowej przez 2 min.
  21. Myć dwukrotnie przez 2 min w PBS w temperaturze pokojowej i odprowadzić ciecz ze szkiełek.
  22. Nanieść 6 μL DAPI/Vectashield (160 ng 4',6-diamidino-2-fenyloindolu dihydrochlorku w 1 mL medium montażowego Vectashield, Vector Laboratories) na szkiełko przykrywkowe nr 0 o wymiarach 22 x 22 mm i odwrócić szkiełko nad szkiełkiem przykrywkowym.
  23. Osuszyć i uszczelnić krawędzie szkiełka przykrywkowego bezbarwnym lakierem do paznokci.

3. Analiza przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego odpowiednio wyposażonego w filtry dopasowane do stosowanych sond.

  1. Oceń sygnały poprzez bezpośrednią wizualizację przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego i pojedynczych filtrów pasmowych dla każdego fluorochromu zastosowanego w teście. Każde jądro komórkowe powinno zostać ocenione przez dwóch analityków. Ogólna wytyczna powinna prowadzić do uznania sygnału za pojedynczy w przypadku, gdy dwa blisko położone sygnały są oddalone od siebie o mniej niż jedną domenę (szerokość sygnału); należy jednak kierować się doświadczeniem przy interpretacji sygnałów o różnej wielkości, intensywności i stopniu rozdzielenia.
  2. Użyj oprogramowania do obrazowania (np. Isis, MetaSystems, Altlussheim, Niemcy; CytoVision, Genetix), aby zarejestrować obraz jądra komórkowego w celu potwierdzenia diagnozy wizualnej oraz do archiwizacji obrazów w ramach planu zapewnienia jakości laboratorium.

4. Reprezentatywne wyniki:

Należy zbadać jądra w metafazie i interfazie z hodowli limfocytów krwi obwodowej, aby potwierdzić, że wybrane sondy są specyficzne dla chromosomów z translokacją, informatywne dla punktów pęknięcia (sondy subtelomerowe powinny hybrydyzować tylko z segmentami translokowanymi, a sonda(y) centromerowa(e) z segmentami centrycznymi), a sygnały w jądrach w interfazie powinny być jasne i wyraźne. W celu oceny wydajności testu zaleca się zliczenie liczby sygnałów dla każdej sondy w 100 jądrach w interfazie dla każdego partnera. W tym przypadku w 95%–99% jąder odnotowano 2 sygnały dla każdej sondy. Rycina 1 przedstawia jądro w metafazie i interfazie z preparatu dla translokacji wzajemnej między krótkimi ramionami chromosomów 5 i 9.

Sygnały w jądrach w fazie interfazy blastomerów zarodka powinny być jasne i wyraźne, a ich ocena powinna być przeprowadzona przy użyciu oddzielnych filtrów pasmowych dla zastosowanych kolorów. Rycina 2 przedstawia jądro blastomeru z prawidłowym wzorem sygnałów (2 kopie dla wszystkich badanych loci), co jest zgodne z prawidłowym lub zbalansowanym zestawem chromosomów dla chromosomów 5 i 9, oraz jądro z nieprawidłowym wzorem sygnałów, odpowiadającym niezbalansowanemu produktowi translokacji, w którym występuje monosomia (jedna kopia) dla translokowanego segmentu chromosomu 5 oraz trisomia (3 kopie) dla translokowanego segmentu chromosomu 9.

Analiza aberracji chromosomowych; technika FISH; schemat z chromosomami oznaczonymi jako der(9) i der(5).
Rycina 1. Preparat metafazy oraz jądra w interfazie przygotowany z hodowli limfocytów krwi obwodowej od nosiciela translokacji wzajemnej ramion krótkich chromosomów 5 i 9 z punktami pęknięcia w 5p14.3 i 9p24.1: 46,XY,t(5;9)(p14.3;p24.1).ish t(5;9)(5ptel48-,9ptel30+;9ptel30-,5ptel48+,9cen+). Sondy FISH dobrano dla obu segmentów translokowanych (5p14.3→5pter, czerwona Cytocell subtelomere5ptel48 TexasRed; 9p24.1→9pter, zielona Cytocell subtelomere 9ptel30 FITC) oraz dla segmentu centrycznego chromosomu 9 (9p24.1→9qter, niebieska Abbott CEP 9 alpha satellite SpectrumAqua).

Schematy analizy fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w celu wykrywania translokacji chromosomowych.
Rycina 2. Sygnały w jądrach blastomerów w fazie interfazy z embrionów 3-dniowych, zarejestrowane przy użyciu różnych filtrów dla każdego fluorochromu i połączone w celu utworzenia obrazu kompozytowego. (A) Dwa sygnały dla każdej sondy wskazujące na dwie kopie każdego locus, co jest zgodne z prawidłowym lub zrównoważonym zestawem dla chromosomów z translokacją. (B) Jeden sygnał czerwony, trzy sygnały zielone i dwa sygnały niebieskie wskazujące na jedną kopię translokowanego segmentu chromosomu 5, trzy kopie translokowanego segmentu chromosomu 9 i dwie kopie segmentu centrycznego chromosomu 9, co jest zgodne z segregacją sąsiednią-1 (adjacent-1) translokacji, prowadzącą do powstania niezrównoważonego produktu z monosomią dla 5p14.3→5pter i trisomią dla 9p24.1→9pter.

Dyskusja

Zastosowanie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) do pojedynczej komórki embrionalnej (blastomeru) wiąże się ze szczególnymi wyzwaniami, zarówno w kwestiach praktycznych, jak i w interpretacji wzoru sygnałów. Pobrana podczas biopsji komórka musi zostać rozprzestrzeniona w obrębie zdefiniowanego obszaru na szkiełku, aby ułatwić jej lokalizację po przeprowadzeniu FISH; należy zachować szczególną ostrożność, aby upewnić się, że komórka została zlizowana, cytoplazma rozproszona, a jądro jest widoczne i nienaruszone; ponadto, ponieważ diagnoza zależy od wyników uzyskanych z tej jednej komórki, należy stosować rygorystyczne wytyczne dotyczące oceny i interpretacji. Jednak w rękach doświadczonego specjalisty FISH jest niezawodną techniką stosowaną w diagnostyce preimplantacyjnej (PGD) w praktyce klinicznej. Zasada PGD metodą FISH polega na wykorzystaniu specyficznych dla celu sond DNA, znakowanych różnymi fluorochromami lub haptenami, do oznaczenia liczby kopii konkretnych loci, a tym samym wykrycia niezrównoważenia chromosomowego związanego z segregacją meiotyczną rearanżacji chromosomowych (1), w tym translokacji Robertsona, translokacji wzajemnych, inwersji i rearanżacji złożonych (2). FISH może być również wykorzystywany do selekcji embrionów żeńskich w rodzinach z chorobami sprzężonymi z chromosomem X, dla których nie istnieje test specyficzny dla danej mutacji (3, 4). Bardziej kontrowersyjnie, FISH stosowano również do przesiewowego wykrywania sporadycznych aneuploidii chromosomowych w celu próby zwiększenia efektywności wspomaganej prokreacji (5, 6); jednak wartość prognostyczna tego testu z użyciem FISH jest prawdopodobnie nieakceptowalnie niska w większości przypadków i nie jest on zalecany do rutynowego stosowania w klinice (7). Niniejszy artykuł koncentruje się na aspektach technicznych i ograniczeniach metody FISH stosowanej w klinicznej diagnostyce pojedynczej komórki.

Metody rozprzestrzeniania i utrwalania pojedynczych blastomerów obejmują zastosowanie metanolu/kwasu octowego (5, 8), Tween/HCl (9) oraz kombinacji Tween/HCl i metanolu/kwasu octowego (10). Warianty tych metod obejmują traktowanie komórek roztworem hipotonicznym przed rozprzestrzenianiem i/lub traktowanie pepsyną i paraformaldehydem po utrwaleniu. Metoda powinna zostać odpowiednio zwalidowana w danym laboratorium (14). Metoda Tween/HCl jest szczegółowo opisana w niniejszym artykule. Metoda Tween/HCl jest prosta technicznie i wykazuje wysoką powtarzalność w różnych laboratoriach. Metoda ta może być stosowana do przygotowania pojedynczych jąder do diagnostyki FISH w celu określenia płci oraz wykrycia rearanżacji chromosomowych z akceptowalną dokładnością diagnostyczną (7).

Mieszaniny sond mogą składać się z sond znakowanych bezpośrednio i pośrednio, a także z sond pochodzących od różnych producentów. Należy unikać sond dla znanych polimorficznych regionów chromosomów (11, 12) oraz tych, które wykazują znaczną hybrydyzację krzyżową z innymi chromosomami (13), choć mogą one zostać zastosowane, jeśli wcześniejsze badania obojga partnerów potwierdzą ich specyficzność i przydatność do PGD. Dostępne fluorochromy/hapteny oraz strategie rozróżniania sond obejmują następujące opcje: Texas Red (TR), izotiocyjanian fluoresceiny (FITC), SpectrumGreen (Vysis), SpectrumOrange (Vysis), SpectrumAqua, sondy biotynilowane wykrywane za pomocą TR-awidyny, FITC-awidyny lub streptawidyny Cy-5 (wizualizowane przy użyciu filtra FarRed), mieszankę sond czerwonych i zielonych w celu uzyskania sygnału żółtego, drugą rundę hybrydyzacji oraz trzeci kolor uzyskany poprzez sekwencyjne wychwytywanie SpectrumOrange przy użyciu filtra TexasRed oraz filtra SpectrumGold).

Do określania płci zaleca się zestaw sond zawierający trzy sondy specyficzne dla regionów centromerycznych chromosomów X i Y oraz jednego autosomu (14); sonda autosomalna służy do ustalenia ploidii, a tym samym do rozróżnienia między trisomią X (2n, 47,XXX) a triploidią (3n, 69,XXX) oraz między tetrasomią X (48,XXXX) a tetraploidią (4n, 92,XXXX). Typowym zestawem sond stosowanym w takich przypadkach jest mieszanina Abbott AneuVysion zawierająca satelity alfa X, Y oraz 18; wykazano, że zestaw ten charakteryzuje się bardzo niskim stopniem polimorfizmu, w związku z czym wstępna analiza partnerów w zakresie reprodukcji nie jest wymagana (14).

Mieszanina sond dla konkretnej rearanżacji powinna: w idealnym przypadku zawierać sondy wystarczające do wykrycia wszystkich oczekiwanych produktów rearanżacji z niezrównoważeniem chromosomowym. Jeśli nie jest to możliwe, dopuszczalne mogą być mieszaniny sond, w których niewykryte produkty niezrównoważone zostały ocenione jako niezdolne do przeżycia w rozpoznawalnej ciąży i prawdopodobnie mają bardzo niską częstość występowania (14). Zostać przetestowana na metafazach hodowlanych limfocytów obojga partnerów reprodukcyjnych. Przynajmniej dziesięć preparatów metafaz powinno zostać zbadane pod kątem swoistości sond, polimorfizmów i hybrydyzacji krzyżowej, a w przypadku nosiciela rearanżacji chromosomowej, aby upewnić się, że sondy hybrydyzują zgodnie z oczekiwaniami z różnymi segmentami rearanżacji. Dodatkowo, należy ocenić co najmniej 100 jąder interfazowych z tych preparatów, aby ocenić swoistość, jasność i dyskretność sygnałów (14).

Dostępne są komercyjne zestawy sond PGS (np. Abbott MultiVysion PB lub PGT), celujące w chromosomy najczęściej wykazujące aneuploidię w produktach poczęcia i zawierające jedną sondę na każdy badany chromosom. Zazwyczaj jądro może zostać poddane drugiej hybrydyzacji z sondami dla dodatkowych chromosomów, co zapewnia analizę chromosomów 13, 15, 16, 18, 21, 22 oraz XY (14). Wartość predykcyjna tego testu z wykorzystaniem opisanej tutaj techniki rozcierania i FISH jest prawdopodobnie nieakceptowalnie niska w przypadku większości użytkowników, w związku z czym nie jest on zalecany do rutynowego stosowania w praktyce klinicznej (7, 15).

Techniki takie jak porównawcza hybrydyzacja genomowa (CGH) stosowana do pojedynczych komórek pozwalają na badanie liczby kopii każdego chromosomu (Wilton et al. 2001), a wykorzystanie macierzy polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (SNP) i analizy ilościowej (Wells et al. 2008) lub genotypowania metodą „karyomappingu” (Handyside et al. 2009) stanowią obiecujące alternatywne techniki wykrywania aneuploidii chromosomowej. Jednakże granica rozdzielczości i dokładność w przypadku niezrównoważenia segmentów pozostają niepewne i prawdopodobne jest, że FISH nadal będzie preferowaną techniką w badaniu rearanżacji chromosomowych obejmujących małe segmenty.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas solny, 2,5 lVWR International101254H
Chlorek sodu, 5 kgVWR international443827W
Chlorek potasu, 250 gVWR international26764.232
bezwodny wodorofosforan sodu(I), 500 gVWR international102494C
Wodorofosforan potasu, 500 gVWR international10203 4B
Wodorotlenek sodu w granulkach, 500 gVWR international28245.265
Tween20, 500 mlVWR international663684B
etanol, 2,5 lVWR international8.18760.2500Opłacone cło
cytrynian trisodu, 5 kgVWR International27833.363
Guma krowia, 250 mlCow Proofings Ltd.Już niedostępneStare zapasy można wciąż znaleźć w sklepach plastycznych
DAPI/Antifade ES, 0,125μg/ml, 500 µlCytocell Ltd.DES500L150μfiolka z odczynnikiem’dołączony do każdej sondy Cytocell TEL
lakier do paznokci, 12 mlButy10088316001
szkiełka aminowane, 25 szt.GenetixK2615
DAPI, 0,1 mlSigma-AldrichD-9542
Vectashield, 10 mlVector LaboratoriesH1000
awidyna znakowana Texas Red, 0,001 mlVector LaboratoriesA-2016
awidyna-FITC, 0,001 mlVector LaboratoriesA-2011
Streptawidyna Cy-5, 0,001 mlGE HealthcarePA45001
Probówki do mikrocentryfugi, 1,75 ml, opakowanie 500 szt.Thistle ScientificAX-MCT-175-C
Probówki do mikrocentrifugi, 0,6 ml, opakowanie 1000 szt.Thistle ScientificAX-MCT-060-C-CS
Pojemniki uniwersalne 30 ml, opakowanie 400 szt.Sterylina128BDostępne w NHS Supply Chain, nr kat. KCP053
Blok grzejny
palnik spirytusowy gniazdo palnika spirytusowego knot palnika spirytusowegoVWR international451-0107 451-3112 451-3111
Szklane pipety z korkiemFisher ScientificPMK-300-052R
Mikroskop stereoskopowyWild Heerbrugg
Chusteczki higieniczne, 100 opakowańNHS SUPPLY CHAINMJT058
Metalowe tace hodowlane
Plastikowe tace melaminoweVWR international682-009
Piekarnik
Końcówka do pipety ustnejScientific Laboratory Supplies LTDHAE3700
Przewody
filtr strzykawkowy, 0,2 µmμporowatość m, średnica 25 mmFisher ScientificFDM-340-010U
Rylec diamentowyVWR international818-0021
Blok grzejny do szkiełek przedmiotowychThermo Fisher Scientific, Inc.HBOSBB
Komora do hybrydyzacji
Rolka tkankiŁAŃCUCH DOSTAW NHSMJT004
Słoik SchieferdeckeraVWR international631-9313
Słoik CoplinaVWR international631-9331
Pinceta precyzyjnaVWR international232-2123
Pinceta tępaVWR international232-2113
Zlewka 1000 mlVWR international213-1642
Mikroskop fazowo-kontrastowyNikon InstrumentsE200
Karty do transferu bezwłókniste, opakowanie 100 szt.Fisher ScientificSDE1
Przedmioty szkiełka przedmiotowe z niebieskim matowym polem, pudełko 100 szt.Scientific Laboratory Supplies LTDMIC3022
Łaseczki, 18x18 mm, nr 1, opakowanie 200 szt.Scientific Laboratory Supplies LTDMIC3110
Kryszalki, 22x22 mm, nr 0, opakowanie 200 szt.Scientific Laboratory Supplies LTDMIC3104
Szkiełka nakrywkowe, 22x50 mm, nr 0, opakowanie 100 szt.Scientific Laboratory Supplies LTDMIC3206
Strzykawka 1 ml, opakowanie 100 szt.NHS Supply ChainFWC045
Napiwek do pipety 1 ml, 10 stojaków po 1000 szt.*Thistle ScientificAX-T-1000-C-L-R
InkubatorLEEC
Kąpiel wodnaWyposażenie z grantuW22
Termometr alkoholowyDostępne są różne źródła
pH-metrJenway3305
Elektroda pHVWR international662-1759Wtyk BNC pasujący do pH-metru Jenway 3305
Mieszadło z podgrzewaniemBibbyHC502
Pipety Pasteura 1 ml, opakowanie 500 szt.Scientific Laboratory Supplies LTDPIP4202
Parafilm, 50 mm x 75 mVWR international291-1214

Bibliografia

  1. Scriven, P. N., Handyside, A. H., Ogilvie, C. M. Chromosome translocations: segregation modes and strategies for preimplantation genetic diagnosis. Prenat. Diagn. 18, 1437-1449 (1998).
  2. Harper, J. C. Preimplantation genetic diagnosis for chromosome rearrangements. Preimplantation Genetic Diagnosis. , 2nd Ed, Cambridge University Press. 194-201 (2009).
  3. Harper, J. C., Coonen, E., Ramaekers, F. C. S., Delhanty, J. D. A., Handyside, A. H., Winston, R. M. L., Hopman, A. H. N. Identification of the sex of human preimplantation embryos in two hours using an improved spreading method and fluorescent in situ hybridisation using directly labelled probes. Hum. Reprod. 9, 721-724 (1994).
  4. Harper, J. C. Preimplantation genetic diagnosis for sex-linked diseases and sex-selection for non-medical reasons. Preimplantation Genetic Diagnosis. , 2nd Ed, Cambridge University Press. 230-235 (2009).
  5. Munné, S., Lee, A., Rosenwaks, Z., Grifo, J., Cohen, J. Diagnosis of major chromosome aneuploidies in human preimplantation embryos. Hum. Reprod. 8, 2185-2192 (1993).
  6. Harper, J. C. Preimplantation genetic diagnosis for infertility (preimplantation genetic screening). Preimplantation Genetic Diagnosis. , 2nd Ed, Cambridge University Press. 203-229 (2009).
  7. Scriven, P. N., Bossuyt, P. M. Diagnostic accuracy: theoretical models for preimplantation genetic testing of a single nucleus using the fluorescence in situ hybridization technique. Hum Reprod. Cytogenetics. 5, 394-400 (2010).
  8. Coonen, E., Dumoulin, J. C., Ramaekers, F. C., Hopman, A. H. Optimal preparation of preimplantation embryo interphase nuclei for analysis by fluorescence in-situ hybridization. Hum. Reprod. 9, 533-537 (1994).
  9. Dozortsev, D. I., McGinnis, K. T. An improved fixation technique for fluorescence in situ hybridization for preimplantation genetic diagnosis. Fertil. Steril. 76, 186-188 (2001).
  10. Hsu, L. Y., Benn, P. A., Tannenbaum, H. L., Perlis, T., Carlson, A. D. Chromosomal polymorphisms of 1, 9, 16, and Y in 4 major ethnic groups: a large prenatal study. Am. J. Med. Genet. 26, 95-101 (1987).
  11. Shim, S. H., Pan, A., Huang, X. L., Tonk, V. S., Varma, S. K., Milunsky, J. M., Wyandt, H. E. FISH variants with D15Z1. J. Assoc. Genet. Technol. 29, 146-151 (2003).
  12. Knight, S. J., Flint, J. Perfect endings: a review of subtelomeric probes and their use in clinical diagnosis. J. Med. Genet. 37, 401-409 (2000).
  13. Thornhill, A. R., de Die-Smulders, C. E., Geraedts, J. P., Harper, J. C., Harton, G. L., Lavery, S. A., Moutou, C., Robinson, M. D., Schmutzler, A. G., Scriven, P. N., Sermon, K. D., Wilton, L. ESHRE PGD Consortium (PGS) ESHRE PGD Consortium 'Best practice guidelines for clinical preimplantation genetic diagnosis (PGD) and preimplantation genetic screening (PGS)'. Hum. Reprod. 20, 35-48 (2005).
  14. Munné, S., Wells, D., Cohen, J. Technology requirements for preimplantation genetic diagnosis to improve assisted reproduction outcomes. Fertil. Steril. 94, 408-430 (2010).
  15. Wilton, L., Williamson, R., McBain, J., Edgar, D., Voullaire, L. Birth of a healthy infant after preimplantation confirmation of euploidy by comparative genomic hybridization. N. Engl. J. Med. 345, 1537-1541 (2001).
  16. Wells, D., Alfarawati, S., Fragouli, E. Use of comprehensive chromosomal screening for embryo assessment: microarrays and CGH. Mol. Hum. Reprod. 14, 703-710 (2008).
  17. Handyside, A. H., Harton, G. L., Mariani, B., Thornhill, A. R., Affara, N., Shaw, M. A., Griffin, D. K. Karyomapping, a universal method for genome wide analysis of genetic disease based on mapping crossovers between parental haplotypes. J. Med. Genet. 47, 651-658 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situbiopsja zarodkarearan acja chromosom wanaliza chromosom w p cirozprzestrzenianie j derhybrydyzacja sondrygorystyczne p ukaniemikroskopia fluorescencyjnaobrazowanie cyfrowe
FISH w diagnostyce preimplantacyjnej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.